PLOS ONE: polimorfismo funcional do intrões Gene CK2α desempenha papéis oncogênicas no câncer de pulmão

Abstract

A proteína quinase CK2 é frequentemente sobre-regulada em cancros humanos, embora o mecanismo de activação CK2 em câncer permanece desconhecida. Neste estudo, nós investigamos o papel do gene da CK2α intrões (

CSNK2A1P

, um pseudogene CK2α presumido) na patogênese dos cancros humanos. Encontramos evidência de amplificação e sobre-expressão do

gene CSNK2A1P

em linhas pequenas não de células de câncer de pulmão de células e leucemia e 25% dos tecidos de câncer de pulmão estudado. Os níveis de expressão de mRNA correlacionados com os números de cópias do gene da

CSNK2A1P

. Nós também identificou uma nova variante polimórfica (398T /C, I133T) do

CSNK2A1P

gene e mostrou que o alelo 398T é seletivamente amplificado ao longo do alelo 398C em 101 amostras de não-pequenas de câncer de pulmão de células do tecido em comparação com aqueles em 48 controlos normais (

P

= 0,013 0,05). Mostramos para a expressão da proteína CSNK2A1P primeira vez em 293T de rim transfectadas humana embrionária e rato embrionárias fibroblastos linhas de células NIH-3T3. Ambos os alelos estão a transformar estes em linhas celulares, e o alelo 398T parece ser mais do que o alelo de transformação 398C. Além disso, o alelo 398T degrada proteína supressora de tumor LMP de forma mais eficiente do que o alelo 398C e mostra uma relativamente forte ligação a LMP. Knockdown do

CSNK2A1P

expressão do gene com siRNA específico aumentou o nível de proteína PML em células de câncer de pulmão. Relatamos, pela primeira vez, que o

CSNK2A1P

gene é um proto-oncogene funcional em cancros humanos e seu polimorfismo funcional parece degradar PML diferencialmente em células cancerosas. Estes resultados são consistentes com um papel importante para o alelo 398T do

CSNK2A1P

na suscetibilidade ao câncer de pulmão humano

Citation:. Hung MS, Lin YC, Mao JH, Kim IJ, Xu Z, Yang CT, et ai. (2010) polimorfismo funcional do intrões Gene CK2α desempenha papéis oncogênicas no câncer de pulmão. PLoS ONE 5 (7): e11418. doi: 10.1371 /journal.pone.0011418

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 17 de dezembro de 2009; Aceito: 05 de junho de 2010; Publicação: 02 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Hung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (093708-01A3) eo Larry Hall e Zygielbaum Memorial Trust, eo Kazan, McClain, Edises, Abrams, Fernandez, Lyons e Fundação Farrise. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos [1]. Alguns dos eventos envolvidos somáticas no cancro do pulmão têm sido bem caracterizadas, mas alguns deles permanecem desconhecidos [2], [3]. CK2 proteína quinase (anteriormente conhecida como a caseína-quinase II), é uma proteína quinase serina /treonina, que fosforila as proteínas mais de 300 [4]. Degrada-se as proteínas supressoras de tumor, tais como PML [5], e promove a actividade e a estabilidade de proteínas oncogénicas, tais como AKT [6]. Por exemplo, CK2 promove a degradação PML e da atividade CK2 quinase é inversamente correlacionada com os níveis de proteína PML no câncer de pulmão humano [5]. Recentemente, a sobrevivência das células de mieloma múltipla, foi mostrado que contar com a elevada actividade da proteína cinase CK2 [7]. CK2 também afeta várias vias de sinalização celular, incluindo PI3K, NFkB, e as vias de Wnt [8].

O nível de expressão CK2α é estreitamente regulada em células normais [9], e aumento do nível CK2α ea atividade tem sido consistentemente observada numa variedade de cancros humanos [10]. Por exemplo, o alto nível e /ou localização nuclear de CK2α é um marcador de mau prognóstico para pacientes com leucemia mielóide aguda, câncer de próstata e câncer de pulmão de células escamosas [10]. CK2α é a subunidade catalítica da proteína cinase CK2 e CK2α tem sido relatada a ser codificada pela

gene CSNK2A1

no cromossoma 20p13 [11]. O

gene CSNK2A1

pode servir como um oncogene e sua expressão desregulada pode induzir tumores mamários e linfomas em camundongos transgênicos [12], [13]. Embora a actividade da

CSNK2A1

gene tem sido mostrado para ser elevada em cancros humanos, nenhuma evidência genética ou epigenético sólido está disponível em relação à causa da alta actividade de CK2α em células cancerosas [10]. O gene CK2α intrões (também conhecido como CK2α “pseudogene”),

CSNK2A1P

, está localizado no cromossoma 11p15.3 e a sua sequência é altamente homóloga (99% de identidade) com a

CSNK2A1

ADNc sequência [14]. Embora o gene da

CSNK2A1P

é declaradamente expressa numa linha celular megacariocítica [15], o seu papel no desenvolvimento de células do cancro continua a ser desconhecido. Por isso, investigou a amplificação e expressão do

CSNK2A1P

gene no câncer de pulmão e linhas celulares de leucemia e tecidos de câncer de pulmão.

Resultados

Over-expressão e amplificação do

CSNK2A1P

gene em células cancerosas e tecidos de câncer de pulmão

estamos focados no

CSNK2A1P

gene porque, inicialmente, verificou-se minimamente expressa em células normais, mas foi predominantemente expresso em vários tipos de linhas de células de cancro humanas e tecidos tumorais, incluindo a linha celular de leucemia de células T humanas Jurkat, que é conhecido pela sua elevada actividade CK2. Por semi-quantitativo de RT-PCR, que mostrou que o

CSNK2A1P

gene também é sobre-expresso em três linhas de NSCLC: H1299, H322, e A549, mas minimamente expressos em células normais e duas linhas celulares de cancro do pulmão H1650 e H460 (Fig. 1A). Além disso,

CSNK2A1P

ARNm foi sobre-expressa em tecido de tumor de pulmão a partir de sete de amostras de 29 (~ 25%) do tumor, em comparação com os tecidos de controlo emparelhadas (Fig. 1B). Além disso, a análise FISH nas mesmas linhas celulares de cancro humano fornecida evidência sólida da amplificação do gene

CSNK2A1P

localizado no cromossoma 11p15.3 (Fig. 1D). Por exemplo, quatro cópias do

CSNK2A1P

gene foram encontrados na linha celular de leucemia de células T humanas Jurkat, e as três cópias em linhas celulares de cancro do pulmão H1299, A549, H322 e. Em contraste, os linfócitos normais e a linha celular H460 tinha cópias diplóides de o

CSNK2A1P

gene (Fig. 1C e D). É importante ressaltar que os níveis de expressão de mRNA correlacionada com números de cópias do

CSNK2A1P

gene nestas linhas celulares de cancro humano (n = 8; γ de Pearson = 0,9346;

p

= 0,0007). (Fig 1 E ). Foi realizada ainda semi-RT-PCR quantitativo para avaliar a expressão de mRNA do

CSNK2A1 gene

com primers específicos. A superexpressão do

CSNK2A1

gene também foi observado em linhas celulares de cancro acima (Fig. 1F), sugerindo que além da

CSNK2A1

gene, o

CSNK2A1P

gene também desempenha um papel importante na patogênese do câncer de pulmão. Alinhamento dos iniciadores utilizados para semi-quantitativo de RT-PCR do

CSNK2A1

e

genes CSNK2A1P

foram mostrados nos dados complementares (Fig. S1).

(A) semi-quantitativo de RT-PCR utilizando iniciadores específicos de CSNK2A1P mostra o nível de expressão de ARNm de CSNK2A1P é consistente com os números de cópias detectados por FISH (3 para H1299, 4 para Jurkat, 3 para H322 e A549, 2 para WI-38 e CCL-211 ). (B) semi-quantitativo de RT-PCR utilizando iniciadores específicos de CSNK2A1P mostra o ARNm sobre-expresso em CSNK2A1P é sete (paciente 1 a 7) de tumores 29 (~ 25%) do pulmão, em comparação com o tecido normal adjacente correspondente. Paciente 8-14 representam amostras sem CSNK2A1P ARNm sobre-expresso. Outras 14 amostras com resultados semelhantes não são mostrados. (C) O

CSNK2A1P

gene é amplificado na linha celular de leucemia de células T humanas Jurkat, e em linhas celulares de cancro do pulmão H1299, A549, H322 e. (D) imagens representativas dos resultados do estudo FISH em metáfases de linfócitos normal, Jurkat, H322 e linhas de células A549. O gene

CSNK2A1P

foi marcado com Cy3 (em vermelho). Cromossoma 11 sonda centímetros foi marcado com FITC (em verde). (E) A correlação entre o número de cópias e expressão de mRNA do

CSNK2A1P

gene foi calculada utilizando a correlação de Pearson. (F) semi-quantitativo de RT-PCR utilizando iniciadores específicos de CSNK2A1 mostra o nível de expressão de ARNm de CSNK2A1 em linhas de células normais e cancerosas mencionadas acima. Todos os semi-quantitativos experiências de RT-PCR foram repetidas três vezes com resultados semelhantes.

amplificação específica de alelo do

gene CSNK2A1P

no cancro do pulmão

Para determinar se existem quaisquer mutações do

CSNK2A1P

em cancros do pulmão humanos, que sequenciou o quadro de leitura aberta do

CSNK2A1P

gene. Embora nós não encontramos qualquer mutação, descobrimos um polimorfismo romance dentro do domínio quinase (398T /C, o que leva a amino mudança I133T ácido, Fig. 2A) em 18 linhas celulares de cancro (Tabela 1) e 101 amostras de tecido de câncer de pulmão primário (Mesa 2). A alteração de um aminoácido específico é predito para afectar a função da proteína quando o intolerante a partir tolerante método de classificação (SIFT) é utilizado [16]. Curiosamente, esse polimorfismo parecia estar uniformemente distribuída no tecido normal, mas em tumores, foi significativamente mais frequente no alelo 398T (Fig 2C.) (Teste do qui-quadrado, p 0,05). Além disso, dos 56 tecidos heterozigotos cancro do pulmão examinados no que diz respeito a este polimorfismo (Fig. 2D), 20 (35,7%) das amostras apresentaram amplificação nesta região, e em 18 (90%) destas amostras de 20, o alelo 398T foi selectivamente amplificado (Fig. 2E). Esta amplificação seletiva sugere que o alelo 398T pode proporcionar uma vantagem de crescimento ao longo do alelo 398C. Para validar ainda mais os resultados de sequenciação de ADN, investigou-se a amplificação específica para um alelo do alelo 398T de

CSNK2A1P

(que codifica a variante Ile133) em tumores humanos usando um único polimorfismo de nucleótidos análise quantitativa (SNP), isto é, -TaqMan com base ensaio de discriminação alélica. Os dados discriminação alélica é consistente com os dados de sequenciação (Fig. 2b). Dos 101 amostras de tumor de pulmão digitadas, 56 eram heterozigóticos em relação ao polimorfismo 398C → T, e estas foram analisadas 56 amostras de amplificação específica para alelos da 398C → T polimorfismo de

CSNK2A1P

por análise TaqMan (Fig . 2B). Vinte amostras mostraram desequilíbrio alélica entre os dois alelos, 2 amostras apresentaram ganho do alelo 398C (que codifica Thr133) e 18 amostras apresentaram ganho do alelo 398T (que codifica Ile133). Estes resultados mostram amplificação específica de alelo estatisticamente significativa do alelo 398T (

P Art 0,05, teste qui-quadrado), fornecendo evidências adicionais para o papel desse alelo no cancro do pulmão humano. Estes resultados levaram-nos a sondar mais profundamente o papel da variante

CSNK2A1P

formas em desenvolvimento do tumor.

(A) amplificação específica de alelo do alelo 398T (TTT /C ou TT /C) é encontrado em algumas amostras de pulmão de não pequenas células de tecido de cancro. A T acima da ponta de seta (398T nucleotídeo, I133), à direita é a indicação do gene do tipo selvagem. (B) Amplificação do

CSNK2A1P

alelos em tumores de pulmão foi validado pela análise alelo quantitativo específico polimorfismo (SNP). A relação entre as 398T e 398C alelos em tumores pulmonares heterozigotos foi determinada por análise de TaqMan utilizando sondas específicas de alelo e é expresso como as diferenças nos níveis de TC (ciclos) com os valores ΔCT positivos ou negativos, indicando a amplificação do 398T ou 398C alelo, respectivamente. De 56 amostras digitadas, 2 mostrou amplificação do 398C alelo superior a 0,6 TCs (amostras T3-4) e 18 apresentaram amplificação do alelo 398T (amostras T5-23). Trinta e seis amostras apresentaram nenhuma amplificação (representado por T1-2). amostras de controlos normais não apresentaram amplificação (N1-3). Os meios normalizados e desvios-padrão de três experimentos independentes são mostrados. (C, D e E) de amplificação específica para um alelo do alelo 398T aumenta significativamente em amostras de pulmão de não pequenas células de tecido de cancro. Normal: adulto ADN genómico humana normal. Tumor: não-pequenas tecidos de câncer de pulmão de células. * Significa p . 0,05 (teste do qui-quadrado)

Diferencial atividade transformadora dos dois

CSNK2A1P

alelos

Para testar a significado funcional do polimorfismo 398T → C na

CSNK2A1P

gene, que clonou o

CSNK2A1

e

CSNK2A1P

genes em pcDNA 3.1 /myc-His do vetor e realizaram um série de ensaios de crescimento de células, utilizando células NIH3T3. Neste estudo, estes vectores foram transientemente transfectados para células 293T e NIH3T3 e análise de Western foi utilizada para confirmar a expressão da proteína de ambos os alelos do

CSNK2A1P

gene (Fig. 3A). Os resultados mostram, pela primeira vez, que a expressão de

CSNK2A1P

pode produzir suas proteínas.

(A) O

CSNK2A1

e

CSNK2A1P

genes foram transf ectadas transitoriamente em células 293T e NIH3T3, utilizando Lipofectamine 2000 Reagente, de acordo com o protocolo do fabricante. 72 horas após a transfecção, as células foram colhidas e as proteínas celulares totais foram extraídos. A análise por Western blot foi usado para confirmar a expressão da proteína em ambos os alelos do

CSNK2A1P

gene. anticorpo tag anti-myc foi utilizado para detectar as proteínas de fusão tag CSNK2A1P-Myc. ensaio de formação (B) Colony. A transfecção de

gene CSNK2A1P

em células NIH3T3 resulta em crescimento dependente de ancoragem melhorado, em comparação com o controlo de vector vazio. Os números de colónias de células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 e são dramaticamente mais elevados do que aqueles das células NIH3T3-EV. (C) Ensaio de agar mole. Transfecção estável de

CSNK2A1P

genes em células NIH3T3 resulta em crescimento independente de ancoragem melhorada. Tanto as células NIH3T3-CSNK2A1 e NIH3T3-CSNK2A1P produzidos significativamente mais do que as colónias de células NIH3T3-EV fez (* p 0,05, teste t). Dos dois alelos do

CSNK2A1P

gene, o alelo 398T formado colónias mais do que o fez alelo 398C (** p 0,05, teste t). Relativa de formação de colónias em ambas as linhas de células é expressa como percentagem normalizada de grupo de controlo vazio do vector e transfectadas como barra ± desvio padrão de três experiências independentes. ensaio (D) cinase do CSNK2A1 expressos e proteínas CSNK2A1P em células NIH3T3. As proteínas expressas foram imuno-precipitados com ensaio de anticorpos tag e quinase Anti-Myc foi realizada. Tanto as células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 e teve actividades significativamente mais elevados do que os quinase células NIH3T3-EV fizeram (* P 0,05, teste t). Dos dois alelos do

CSNK2A1P

gene, as células 398T de alelos tinha significativamente mais elevada do que a actividade de quinase alelo 398C fez (** p 0,05, teste t). a actividade de cinase relativa é expressa como percentagem normalizada de grupo de controlo vazio do vector e transfectadas como barra ± desvio padrão de três experiências independentes. EV: vector vazio. Peso: CSNK2A1. 398C: CSNK2A1P (I133) 398T: CSNK2A1P (I133T)

No ensaio de formação de colónias, transfecção de

CSNK2A1P

genes em NIH3T3 (NIH3T3-CSNK2A1P) células resulta em Anchorage reforçada. crescimento dependente, em comparação com o controlo de vector vazio (NIH3T3-EV). Além disso, foram geradas células NIH3T3 com CSNK2A1 (NIH3T3-CSNK2A1) como um controlo positivo. Os números de colónias de células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 e eram dramaticamente mais elevados do que aqueles das células NIH3T3-EV (Fig. 3B). A transfecção de

CSNK2A1P

gene em células NIH3T3 também resultou no crescimento independente de ancoragem melhorada. Quando os resultados de agar mole ensaio de formação de colónias foram comparados, verificou-se que a transfecção estável de

CSNK2A1P

genes em células NIH3T3 resultou no crescimento independente de ancoragem melhorada (Figura 3C). Tanto a células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 e produziu mais colónias do que as células NIH3T3-EV fez. Em comparação com as células NIH3T3-EV, as células NIH3T3-CSNK2A1P NIH3T3-CSNK2A1 e produziu colônias que eram em sua maioria maior e tinha formas espalhados-out. Quando os dois alelos do

CSNK2A1P

genes foram comparados, encontramos que o alelo 398T formado mais colónias do que o alelo 398C fez. Um ensaio de cinase das proteínas expressas foi também realizado (Figura 3D). O produto do gene 398T tem uma actividade de quinase mais elevado do que o produto do gene faz 398C. Os resultados do ensaio de quinase são consistentes com a formação de colónias e de dados em agar mole.

polimorfismo funcional de

CSNK2A1P

genes sobre a degradação da proteína supressora de tumor PML

Para determinar o mecanismo potencial pelo qual o alelo 398T é preferencialmente amplificado em amostras de cancro de pulmão, foram estudados os efeitos dos dois alelos do

CSNK2A1P

gene de proteína PML supressor de tumor. O

CSNK2A1P

genes foram estavelmente transfectado em linhas celulares NIH3T3 e NSCLC H1650. A análise Western blot mostrou um nível de proteína PML reduzida nas células transfectadas com os

CSNK2A1P

genes. O alelo CSNK2A1P 398T, semelhante à do tipo selvagem CSNK2A1, diminuiu os níveis de proteína PML mais do que o fez alelo 398C (Fig. 4A). Em segundo lugar, determinou-se a meia-vida da PML é diferencialmente reguladas pelos dois alelos. Estas duas linhas de células transfectadas com o

gene CSNK2A1P

foram tratadas com cicloheximida para 0, 2, e 6 horas, e os níveis de proteína PML endógenos foram examinados. O alelo 398T diminuiu a meia-vida de LMP de forma mais eficaz do que o alelo 398C fez (Fig. 4B). Em terceiro lugar, utilizou-se a co-imunoprecipitação de mostrar a directa e uma ligação preferencial entre a proteína e proteína PML 398T (Fig. 4C).

(A) A proteína PML diminui em linhas celulares estáveis ​​de NIH3T3 e H1650 que foram transfectadas pela

CSNK2A1

e

CSNK2A1P

genes. A proteína CSNK2A1 endógeno e proteínas CSNK2A1 e CSNK2A1P overexpressed também foram mostrados. (B) A degradação da proteína PML é mais proeminente em linhas celulares estáveis ​​de NIH3T3 transfectadas com CSNK2A1 e CSNK2A1P (I133). H: horas após o tratamento cicloheximida. (C) As células 293T foram co-transfectadas com PML-V5 e marcada com myc ou CSNK2A1 CSNK2A1P construções. CSNK2A1 e CSNK2A1P (I133) mostraram ligação mais forte com a proteína PML em ensaios de imunoprecipitação recíprocos. EV: vector vazio. Peso: CSNK2A1. 398T: CSNK2A1P (I133) 398C: CSNK2A1P (I133T). (D) A expressão do

CSNK2A1P

gene diminui na linha de células de câncer de pulmão H1299 após transfecção com o

CSNK2A1P

gene siRNA específico. Não há diminuição na expressão do

CSNK2A1

e

CSNK2B

genes foram anotados. (E) Os diminui o nível de proteína CK2α eo nível de proteína PML aumentos na linha de células de câncer de pulmão H1299 após a transfecção com o

CSNK2A1P

gene siRNA específico. N: controle negativo siRNA. CSNK2A1P:

CSNK2A1P

siRNA. As densidades da banda são normalizadas para o grupo transfectadas siARN negativa utilizando actina como um controlo interno. Todas as experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes.

Para aprofundar a questão de saber se o mRNA CSNK2A1P é totalmente traduzido e degrada PML em células cancerosas, que derrubou o

CSNK2A1P

gene em linhas celulares de cancro do pulmão H1299 com siRNA específicas para o

CSNK2A1P

gene. Escolhemos a linha celular de cancro do pulmão H1299 porque o nosso estudo (Figura 1A e C) mostrou que o

CSNK2A1P

gene é amplificado e sobre-expresso nesta linha de células. O

CSNK2A1P

siRNA específico gene causou uma diminuição superior a 70% na expressão do

CSNK2A1P

gene e nenhuma diminuição na expressão do

CSNK2A1

e

CSNK2B

genes (Fig. 4D). De acordo com a diminuição da expressão do

gene CSNK2A1P

, a proteína total CK2α diminuiu e a proteína PML aumento nas células tratadas com

CSNK2A1P

siRNAs comparação com os controlos negativos siRNA transfectadas (Fig. 4E) .

Discussão

neste estudo, nós fornecemos, a nosso conhecimento, a primeira evidência para mostrar que o

CSNK2A1P

gene é um proto-oncogene funcional em cancros humanos . Para apoiar a nossa hipótese de que

CSNK2A1P

gene é um proto-oncogene funcional, ao invés de um “pseudogene”, fizemos DNA extensa, mRNA, proteínas e análise de siRNA. Os resultados desta análise fornecem a primeira evidência de que o nível de expressão de ARNm de correlaciona com o número de cópias do

CSNK2A1P

gene em várias linhas celulares de cancro humano. Além disso, siRNA knock down do

CSNK2A1P

gene diminuição do nível de proteína total CK2α em células cancerosas, indicando que o

CSNK2A1P

gene é totalmente traduzido em células cancerosas. Assim, a amplificação do gene da

CSNK2A1P

pode desempenhar um papel oncogénica nestas linhas celulares de cancro humano. Com base nos nossos resultados, propomos que dois genes funcionais podem existir na família CK2α humana,

CSNK2A1

, que localiza no cromossomo 20p13, e

CSNK2A1P

, que localiza no cromossomo 11p15.3.

Nós também um polimorfismo romance dentro do domínio quinase (398T /C, o que leva a amino I133T mudança ácido, Figura 2a) em 101 tumores primários. Este polimorfismo parece ser distribuídos uniformemente no tecido normal, mas em tumores, é significativamente mais frequente no alelo 398T (Tabela 2, Figura 2). O alelo 398T foi amplificado seletivamente em dezoito dos 101 tecidos de câncer de pulmão, sugerindo que poderia proporcionar uma vantagem de crescimento ao longo do alelo 398C. A amplificação alelo 398C só foi encontrado em dois dos 101 tecidos de câncer de pulmão, sugerindo que poderia ser um evento aleatório. Estes resultados genéticos intrigantes nos levou a investigar mais profundamente o papel da variante

CSNK2A1P

formas em desenvolvimento do tumor. Fazer isso rendeu duas descobertas importantes, em primeiro lugar, que o alelo 398T é mais transformador do que o alelo 398C e, segundo, que o alelo 398T degrada a proteína PML supressor de tumores de forma mais eficiente do que o alelo 398C. Por exemplo, o alelo 398T mostrou aumento significativo da actividade de transformação, tanto a formação de colónias e os ensaios de agar mole do que o alelo 398C (Fig. 3B e C). Os dados do ensaio de quinase mostrou que o produto do gene 398T tem maior actividade de cinase do que o produto do gene 398C (Fig. 3D), sugerindo que o alelo 398T é um alelo mais transformação do que o alelo 398C. Além disso, estes dados sugerem também que a capacidade de transformação do alelo 398T do

CSNK2A1P

pseudogene é semelhante ao do normal,

CSNK2A1

produto do gene, de modo que o alelo mais activo do pseudogene parece ter actividade comparável ao

CSNK2A1

gene regular. Até à data, não há nenhuma evidência genética ou epigenético na activação do gene CSNK2A1 no cancro humano. Assim, nosso estudo fornece a primeira evidência de que o

CSNK2A1P

398T alelo, que é semelhante ao

CSNK2A1

gene, é amplificado em tecidos de câncer de pulmão humanos.

O gene PML foi originalmente identificada no ponto de interrupção de t (15; 17) na leucemia promielocítica aguda [17], e mostrou-se um gene supressor de tumores [18]. Perda de PML tem sido correlacionada com mau resultado clínico em uma variedade de cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão, apoiando a sua função supressora de tumor [5], [19]. PML promove a desfosforilação de pRb e regula o destino celular no neocórtex em desenvolvimento [20]. CK2 regula a degradação mediada por ubiquitina do PML em linhas celulares de cancro do pulmão humano [5], [21]. Este pode ser um dos mecanismos potenciais pelos quais o alelo 398T é preferencialmente amplificados em amostras de cancro de pulmão. Este polimorfismo genético é provavelmente um marcador útil para detectar a amplificação do gene intrões CK2, porque a amplificação monoalélicos se acredita ser responsável por amplificação de genes em cancro [22]. Esta amplificação específica do alelo também implica que as células cancerosas pode ser viciado para o oncogénica CK2α [23]. Em suma, a amplificação do alelo 398T do

CSNK2A1P

gene pode contribuir, pelo menos em parte, para a patogênese do câncer de pulmão.

O

CSNK2A1P

gene é um pseudogene processado localizado no cromossoma 11p15.3 e é suposto ser formado por retrotransposição, e caracteriza-se pela ausência de intrões, a presença de flanqueamento dirige repetições, e a cauda de 3 ‘poliadenilação [15]. No entanto, ele tem um promotor forte a montante do codão de iniciação (14, 15). A expressão do gene da

CSNK2A1P

é potencialmente mais firmemente regulado do que o

CSNK2A1

é. Por exemplo, a região promotora do gene da

CSNK2A1P

contém duas caixas TATA e uma caixa CAAT, enquanto que a sequência a montante de

CSNK2A1

exibe características de limpeza de genes, por exemplo, elevado teor de GC, a presença de várias caixas GC e caixa de TATA a falta (14, 15). Além disso, vários sítios de ligação ao factor de transcrição importante (por exemplo, CEBP-, GATA-, e locais de ligação ao SMAD) foram previstos dentro da região de 5 ‘(1 kb) a partir do codão

CSNK2A1P

de partida, o que sugere que o

CSNK2A1P

gene pode potencialmente ser induzida ou reprimida por vários reguladores mestre de vias de desenvolvimento. A amplificação do gene da

CSNK2A1P

poderia resultar na sobre-expressão da proteína CSNK2A1P em células cancerosas. Também pode ser possível que o

CSNK2A1

gene é de alguma forma indiretamente regulada pela expressão do

CSNK2A1P

gene. Futuros estudos são necessários para descobrir o mecanismo através do qual o

CSNK2A1P

e

CSNK2A1

genes são regulados. Até agora, cerca de 10.000 pseudogenes processados ​​[24] foram caracterizados no genoma humano, e alguns destes genes foram relatados para ser expresso em células cancerosas. Por exemplo, a oncogênico

CRIPTO3

pseudogene é expresso em cancros do cólon, mama e pulmão [25], o homólogo humano do clone gene H1 fosfatase vírus vaccinia 5 (

HVH-5 ​​

) pseudogene é expressa em linhas celulares de cancro da mama [26], e o

Rac1

pseudogene é expresso em tumores cerebrais [27]. Tomados em conjunto com os nossos resultados, isto sugere um potencial papel oncogênico dos pseudogenes presumíveis em alguns cancros humanos.

Este estudo teve algumas limitações. Nós demonstramos a correlação entre o

CSNK2A1P

gene e estabilidade da proteína PML em apenas linhas celulares de cancro de pulmão dois in vitro. Amostras de apenas 101 doentes com cancro de pulmão foram analisados, 56 dos quais eram heterozigóticos em relação a este polimorfismo e pode ser utilizado para a análise. Em estudos futuros, será importante incluir linhas celulares de cancro adicionais e mais tecidos de câncer.

Nossos resultados fornecem evidências genéticas para a ativação do gene CK2α intrões no câncer humano. Embora CK2 era conhecido anteriormente para ser um jogador-chave no cancro, o seu mecanismo de ativação no câncer não era conhecido [10], [28]. Devido a esta falta de conhecimento sobre o mecanismo de activação CK2 e sua atividade constitutiva, CK2 tem sido quase sempre negligenciada como um alvo chave para drogas anti-câncer. Desde o progresso significativo foi feito nas bases estruturais da inibição CK2, é agora possível desenvolver inibidores da CK2 de células-permeável potentes e selectivos [29], [30]. Compreender a diferença na sequências das

CSNK2A1P

polimorfismos do gene pode permitir-nos para projetar testes de diagnóstico específicos para o câncer humano. Importante, nossos resultados suportam a noção de que a proteína quinase CK2α é um alvo atraente para terapêutica do câncer, tais como inibidores de pequenas moléculas [10], [31].

Materiais e Métodos

As linhas celulares

O câncer humano (Jakurt, H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052, Hela e H1650) e pulmão normal (WI-38 e CCL-211) As linhas celulares foram obtidas de American Type Culture Collections (Manassas, VA). H290 e linhas celulares de MS-1 foram obtidos a partir do NIH (Frederick, MD). As células foram cultivadas em meio de crescimento completo (meio de Eagle modificado de Dulbecco para HeLa, A549 e CCL-211; Mínimo de Eagle Meio Essencial para WI-38; meio de Roswell Park Memorial Institute para H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052 e H1650) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 unidades /ml de penicilina e 10 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO2.

as amostras de tecido

tecidos tumorais frescas e tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSLC) que foram submetidos a ressecção cirúrgica do tumor primário. O estudo foi aprovado pela Universidade da Califórnia, San Francisco, conselho de revisão institucional (CHR # H8714-11647-14). Obtivemos escrita consentimentos informados de todos os participantes envolvidos no nosso estudo. As amostras de tecido foram mantidas a -180 ° C freezers de nitrogênio líquido antes do uso e diagnóstico patológico final foi confirmada por um patologista da Universidade da Califórnia, San Francisco (UCSF), nos EUA. adultos normais do sangue periférico forma de ADN genómico foi comprado de Biochain (Hayward, CA).

Fluorescência-hibridação in situ

A fluorescência de hibridação in situ (FISH) para a sonda CSNK2A1P (RP11-567I13 , cromossoma 11p15.3) foi adquirido a partir de BacPac Recursos (Oakland, CA). O centrômero cromossomo 11 foi marcado por Vysis CEP 11 SpectrumGreen ™ sonda (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). lâminas em metafase foram preparados utilizando protocolos padrão da instalação UCSF Molecular Pathology núcleo. Todas as hibridizações foram feitas pela instalação UCSF Patologia Molecular Core. A sonda CSNK2A1P BAC foi marcado com Cy3 vermelho pela tradução do nick. mistura de sondas foi preparado de acordo com o protocolo padrão

ADN e análise de sequenciação de ADNc

ADN genómico ou ARN total foi isolado a partir de linhas celulares e amostras de tecido utilizando o DNeasy Blood Kit de tecido ou o RNeasy Mini Kit (Qiagen Valência, CA), respectivamente. O gene CSNK2A1P foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores específicos de gene. Os iniciadores directo e inverso, utilizados para a PCR e a sequenciação foram: 5′-AGAAAATTGCTCCCCACTCC-3 ‘e 5′-GTGCTGCCAGAGAATGA CAA-3’, respectivamente. Os produtos de PCR foram utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen Valência, CA), purificado em gel e foram subsequentemente sequenciados em MCLab (South San Francisco, CA).

semi-quantitativa de transcrição reversa-PCR (RT-PCR ) análise

o ARN total a partir de linhas de células e tecidos foi isolado utilizando um kit de extracção, e o ADN foi eliminado por tratamento em coluna com DNase (RNeasy Mini kit; Qiagen, Valência, CA, EUA). Semiquantitativa RT-PCR foi realizada usando SuperScript uma etapa de RT-PCR com o kit Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. One-step RT-PCR foi realizada utilizando pares de primers CSNK2A1P-específica (para frente: 5′-AGAAAATTGCTCC CCACTCC-3 ‘e inverter: 5′-GTGCTGCCAGAGA ATGACAA-3′), primers específicos de CSNK2A1 (Forward: 5’-TGGGGACAGAAGATTTATATGA -3 ‘e Reverse: 5′-CTGAAGAAATCCCTGACA TCAT-3′) e primers CSNK2B-específica (para frente: 5’-CAGGTCCCTCACTACCGACA -3 ‘e Reverse: 5′-CAGCTGGTAGGCCATCGGAT-3’). Os produtos de PCR foram verificadas por sequenciação directa de ADN. O gliceraldeído-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) foi usada como um controlo interno.

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