Abstract

A quinase activada por p21 3 (PAK3) eo soro e induzida por glucocorticóides quinase 2 (SGK2) foram previamente propostos como quinases essenciais para o vírus do papiloma humano positivo (HPV +) a sobrevivência das células do câncer cervical. Esta foi criada usando uma abordagem knockdown shRNA. Para validar PAK3 e SGK2 como potenciais alvos para HPV + terapia do cancro do colo do útero, a relação entre fenótipos induzidas shRNA em HPV + células cancerosas cervicais e PAK3 ou knockdown SGK2 foi cuidadosamente examinado. Observou-se que os fenótipos de HPV + células de cancro do colo do útero induzida por vários PAK3 e SGK2 shRNAs não podia ser resgatado por expressão complemento das respectivas construções de cDNA. Um PAK3 knockdown deficiente shRNA com um único desfasamento foi suficiente para inibir o crescimento de células HeLa numa extensão semelhante à de tipo selvagem PAK3 shRNA. Os HPV + células de cancro cervical também eram susceptíveis a várias shRNAs alvo não-humanos. A discrepância entre PAK3 e apoptose induzida por shRNA SGK2 knockdown e a expressão do gene, assim como a estimulação da morte celular, sugere que estes shRNAs matou células HeLa através de diferentes percursos que podem não ser específico para o alvo. Estes dados demonstram que o HPV + a morte de células de câncer cervical não foi associada com PAK3 induzida por RNAi e knockdown SGK2 mas provavelmente através de efeitos fora do alvo

Citation:. Zhou N, Ding B, Agler M, Cockett M, McPhee F (2015) letalidade da PAK3 e SGK2 shRNAs a células Papilomavírus Humano positiva câncer cervical é independente da PAK3 e SGK2 Knockdown. PLoS ONE 10 (1): e0117357. doi: 10.1371 /journal.pone.0117357

Editor do Academic: Xuefeng Liu, da Universidade de Georgetown, Estados Unidos

Recebido: 23 de outubro de 2014; Aceito: 22 de dezembro de 2014; Publicação: 23 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o financiamento deste estudo foi de Bristol-Myers Squibb. BMS forneceu apoio sob a forma de salários para os autores [NZ, BD, MA, MC e FM], mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘. Desde Michele Agler tornou-se um funcionário da Boehringer Ingleheim, eles têm prestado apoio na forma de um salário para ela, mas não tinha nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Competir interesses: os autores têm as seguintes participações: Todos os autores deste manuscrito são ou foram funcionários da Bristol-Myers Squibb Company (BMS) no momento em que o trabalho descrito foi realizado e um autor (Michele Agler) é agora a Boehringer Ingleheim (BI) do empregado. Financiamento deste estudo foi de Bristol-Myers Squibb. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os papilomavírus humanos (HPVs) são pequenos vírus tumorais de DNA que infectam cutânea ou células epiteliais da mucosa [1 ]. Até à data, 170 tipos de HPV foram totalmente caracterizados, e cerca de 40 tipos infectam o tracto genital [2]. Os tipos de HPV genitais são sexualmente transmissível e pode ser dividido em grupos de baixo risco e de alto risco de acordo com a propensão de suas lesões induzidas para avançar para malignidade. Persistentes de alto risco papilomavírus humanos (HPV) é a principal causa de cancro cervical. Uma vez integrados no genoma do hospedeiro, os tipos de HPV de alto risco exercem os seus efeitos oncogénicos em primeiro lugar através da expressão contínua das oncoproteínas E6 e E7 [3]. Muitas actividades foram descritas para ambos estes oncoproteínas, entre as quais as seguintes são melhor caracterizadas e críticos para a transformação: E6 se liga à proteína E6-associado (E6-AP), resultando na ubiquitinação e degradação da proteína supressora de tumor p53; E7 se liga a membros da família de proteínas de bolso, em particular, a proteína do retinoblastoma (Rb), provocando inactivação e degradação de Rb [4]. As interacções entre as oncoproteínas de HPV de alto risco e as proteínas celulares endógenos têm sido mostrados para provocar a desregulação do ciclo celular e apoptose, e um aumento subsequente na replicação de células transformadas, progredindo para o cancro [5].

interferência de ARN (ARNi ) tornou-se uma ferramenta amplamente utilizada para estudos de genômica funcional em vertebrados e invertebrados [6]. RNAi funciona ao silenciar um gene através homóloga curtas interferindo RNAs de cadeia dupla (siRNAs), que provocam a destruição de RNA mensageiro correspondente (mRNA) pelo silenciamento complexos (RISC) induzida pelo RNA [7]. A facilidade, velocidade e custo-eficácia tornaram o método de escolha para estudos da função de perda de gene. Recentemente, telas de RNAi de alto rendimento foram usadas para explorar as diferenças nos requisitos de quinase para a proliferação e sobrevivência entre as várias células cancerosas [8-10]. Um conjunto comum de quinases foram observados como sendo necessário para a proliferação /sobrevivência de três linhas de células de carcinoma cervical (CaSki, HeLa e SiHa), mas dispensável para humana primária queratinócitos do prepúcio (HFKs). Propõe-se que a quinase activada por p21 3 (PAK3) e o soro e induzida por glucocorticóides quinase 2 (SGK2) eram essenciais para (HPV +) sobrevivência HPV positivo cervical de células de cancro. A letalidade causada por células SGK2 ou exaustão PAK3 em HPV E6 expressando foi uma consequência da p53 inactivação [10].

O PAK proteínas são serina /treonina e divididos em dois grupos. Grupo I PAKs inclui PAK1 a 3; essas cinases se ligam e são cataliticamente activada por Rac e Cdc42 GTPases [11, 12]. PAK3 é abundantemente expresso no sistema nervoso central (CNS), e é especificamente implicado na plasticidade neuronal e spinogenesis [13]. PAK3 também regula a progressão do ciclo celular, migração neuronal e apoptose [13-16]. Perda da função de PAK3 é responsável por retardo mental não-sindrômica ligada ao X [17, 18]. A família de quinases inclui SGK SGK1 a 3; SGK2 é o membro mais mal estudados desta família. Ao contrário SGK1, ARNm SGK2 não é induzida pela estimulação com soro ou glucocorticóide, e está presente apenas em níveis significativos no fígado, rim e pâncreas e em níveis mais baixos no cérebro [19]. No entanto, semelhante ao SGK1 e 3, SGK2 também activa determinados canais de potássio e de sódio, o que sugere um envolvimento na regulação de processos, tais como a sobrevivência da célula, a excitabilidade neuronal, e a excreção renal de sódio [20, 21].

específico aniquilação de células de câncer do colo do útero seria de interesse significativo para a comunidade de pesquisa anti-câncer. Para confirmar que o bloqueio da função de SGK2 PAK3 ou por uma via dependente de p53 está associada com a depleção de células + HPV, controlos adequados são essenciais quando se utiliza uma abordagem de RNAi. especificidade alvo tem sido uma fonte de preocupação desde a primeira aplicação de RNAi para genómica funcional. efeitos não específicos foram relatados que, para além dos genes alvo, conduziu a alterações na expressão de outros genes em ambos os níveis de mRNA e proteína [22-24]. Além disso, a indução de genes envolvidos na resposta de interferão máquinas tem sido observado [25-28], um desafio ainda mais a fiabilidade de ARNi em estudos de perda de função. Neste estudo, demonstra-se que os fenótipos de HPV + células de cancro do colo do útero induzidas pela PAK3 ou SGK2 shRNAs não podia ser resgatado por expressão complemento das respectivas construções de cDNA. Os HPV + células de cancro cervical são também susceptíveis a várias shRNAs alvo não-humanos. Estes dados mostram que a perda de células de câncer cervical HPV viável + não se correlaciona com PAK3 induzida por RNAi e knockdown SGK2, conforme relatado anteriormente [10].

Materiais e Métodos

Células

HeLa (ATCC CCL-2) e CaSki (ATCC CRL-1550), as células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com soro de bovino fetal e penicilina-estreptomicina a 1% a 10%.

Os plasmídeos

stocks glicerol de bactérias ou plasmídeos contendo PAK3, SGK2 e controle (luciferase, EGFP, Turbo-GFP e não-alvo) Missão shRNA vectores lentivírus (Tabela 1) foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). As cassetes de expressão PAK3and SGK2shRNA em um backbone de lentivírus foram caracterizadas e validadas anteriormente pelo Consórcio RNAi (TRC, Broad Institute, Cambridge, MA). Os plasmídeos foram purificados utilizando o kit Plasmid Maxi Endo-free (Qiagene, Valência, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. A doxiciclina (DOX) -inducible plasmídeo pLKO-Tet-On foi um presente do Dr. Susan Wee [29]. foram inseridas sequências shRNA dos vectores lentivírus Missão shRNA (Tabela 1) entre os sites Agel /EcoRI do pLKO-Tet-On usando a tecnologia de clonagem padrão.

Para construir um controle knockdown deficiente PAK3 shRNA , uma gama de shRNA 3245 mutantes com diferentes nucleótidos desemparelhados com o ARNm alvo foram concebidos e clonado para pLKO-Tet-On vector. Depois de quantificar a redução de mRNA PAK3 número de cópias por esses shRNAs descasamento, um knockdown deficiente PAK3 shRNA (shRNA 3245 m15) com uma única incompatibilidade na posição 15 (CCAAACTTCCAACAgAACA) foi identificado.

final ORF clones humanos para PAK3 (NCBI Referência Sequência: NM_002578.3), e SGK2 variantes 1 e 2 (e NM_170693.1 NM_016276.3) foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). sequências de ORF PAK3 SGK2 e foram introduzidos no vector de expressão pcDNA3.2-dest usando a tecnologia Gateway (Invitrogen). Para as experiências de socorro, e PAK3 SGK2 plasmídeos que expressam mutantes foram construídos abrigando 4 a 5 mutações silenciosas nas sequências complementares shRNA. As mutações foram introduzidas em pcDNA-PAK3 utilizando o kit QuikChange mutagénese dirigida ao local (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e os seguintes pares de iniciadores: pPAK-3244mut 5′-GATAGCTACTTGGTGGGTGACGAGTTGTGGGTAGTCATGGA ATACTT-3 ‘e 5′-AAGTATTCCATGACTACCCACAACTCGTCACCCACCAAGT AGCTATC-3; pPAK3-3245mut 5’-GGCACGATTACTCCA AACCAGCAATATAACA AAATTGGAACAG-3 ‘e 5′-CTGTTCCAATTTTGTTAT ATTGCTGGTTTGGAGT AATCGTGCC-3; pPAK3-5142mut 5’-GTTGATATCTGGTCTCTTGGCATCATGGCC ATCGAAATGGTGGAAGGTGAACC-3 ‘e 5′-GGTTCACCTTCCACCATTTCGAT GGCCATGATGCCAAGAGACCAGATATCAAC-3’. As mutações foram introduzidas em pcDNA-SGK2 utilizando os seguintes pares de iniciadores: 5′-pSGK2-2111mut GTAGAGCCTGA AGACACCACCAGCACCTTCTGTGGTACCCCTGA GT-3 ‘e 5′-ACTCAGGGGTA CCACAGAAGGTGCTGGTGGTGTCTTCAGGCTCT AC-3′; pSGK2-2112mut 5’-CA TTGGCTACCTGCACT CCTTGAATATTATTTACAG GGATCTGAAACC-3 ‘e 5′-GGTTTCAGATCCCTGTAAATAATGTTAAGTGAGTGCAGGTAGCCAATGGCG-3’. Estes plasmídeos foram confirmados como sendo refratário ao PAK3 ou SGK2 shRNA knockdown usando qPCR para quantificação de ARNm e Western blot para quantificação de proteínas.

Lentivírus produção

lentivírus recombinantes foram produzidos por cotransfecção células 293T Lenti-X (Clontech, mountain View, CA) com o vector de lentivírus, shRNA plasmídeo de empacotamento e o plasmídeo de expressão de VSV-G. Resumidamente, 3 × 10

6 células Lenti-X foram semeadas numa placa de 10 cm antes da transfecção. Para cada prato 10 cm, 3 plasmídeo ug shRNA-lentivírus, 2,7 ug pCMVΔ8.9 (plasmídeo embalagem), e 0,3 ug pVSV-G foram misturados com reagente Transit-293 (Mirus Bio, Madison, WI) em Opti-MEM e incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos. mistura de transfecção foi adicionado às células e incubado durante a noite. O meio foi aspirado e adicionado meio fresco para suportar o crescimento do vírus. O meio de cultura contendo lentivírus infecciosa foi recolhido 48 h após a transfecção, centrifugado para remover os restos de células, e filtrado através de uma unidade de filtração de 0,45 um. O vírus foi titulado com um kit de ensaio de p24 (Perkin Elmer, Waltham, MA) e o método de selecção de puromicina recomendado pela Sigma (www.sigmaaldrich.com). títulos virais de ~ 3 × 10

7 UFC /mL foram obtidos utilizando este método; rendimento do vírus foi similar, independentemente da entrada de vectores de expressão shRNA.

A viabilidade das células /proliferação ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços a 2000 células /poço em 100 ul de meio antes de infecção por vírus. O lentivírus shRNA infecciosa foi diluída em meio contendo 10 ng /mL de polibreno. O meio foi removido das células, e as diluições em série de 100 uL de lentivírus foram adicionados a cada poço. Após 24 horas, o vírus foi removido e substituído por 100 uL de meio fresco. Para experiências utilizando o shRNAs indutível, /foi adicionado meio fresco contendo 20 ng mL de doxiciclina. A viabilidade celular foi medida 5 dias após infecção utilizando o reagente CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI). O reagente CellTiter-Azul foi diluída numa proporção de 1: 4 em meio, e 20 uL do reagente diluída foi adicionada a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 2 horas antes da gravação de fluorescência (531

EX /595

eM) num leitor Envision multilabel 2104 (Perkin Elmer, Waltham, MA). As células vivas foram contadas usando um ensaio de goiaba ViaCount como descrito no protocolo do fabricante (Merck Millipore, Billerica, MA).

apoptose celular ensaio

Sementeira e infecção de células foram realizados como descrito para o ensaio de proliferação de células, excepto que 80 ul de meio /poço adicionou-se depois que o vírus foi descartado. Um ensaio de apoptose foi realizada 72 horas após a infecção, utilizando um kit de ensaio de caspase 3/7 Glo (Promega, Madison, WI). Resumidamente, o substrato de caspase 3/7 foi diluída em tampão de lise e 20 ul de substrato diluída foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora e o sinal de luminescência lidas num leitor multi-etiqueta Envision.

autofagia celular ensaio

células HeLa foram infectadas com lentivírus diluídos em série SGK2 shRNA bem como com um controlo não-alvo (NT) shRNA (Tabela 1). O vírus foi removido após 24 horas de infecção e as células foram cultivadas durante 48 horas adicionais. A rapamicina (1 uM, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) foi incluído como um controlo em cada placa e adicionada 24 horas antes de as placas foram processadas por imagiologia. placas de células foram fixadas por adição de 20 ul de tampão de fixação [(4% v /v de formaldeído em Fosfato de Dulbecco-salino tamponado (DPBS)] directamente para o meio de ensaio e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente seguido por 2 lavagens com DPBS. As células foram imunocoradas para a indução de autofagia por permeabilização durante 10 minutos com 0,1% de Triton X-100 em albumina de soro bovino 1% (BSA) /tampão de DPBS. um tampão de bloqueio de soro de bovino fetal a 5% (FBS) em DPBS foi usado durante incubações de anticorpos que consistia de um anticorpo primário LC3B (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) seguido de um anticorpo secundário Alexa 488-conjugado (Invitrogen, Carlsbad, CA). O núcleo foi corado com Hoescht corante (Invitrogen, Carlsbad , CA) e actina foi corado com Alexa 647-faloidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para identificar a célula.

as imagens foram adquiridas na confocal Opera alta Imager conteúdo (Perkin Elmer, Watham, MA). a 20x objectiva de imersão em água (20x water_Lucplfln NA = 0,7), foi utilizado com um 488 diodo laser (filtro de excitação: λ = 520 nm, 75 nm passa-banda), uma fonte de luz UV não confocal (filtro de excitação λ = 450 nm, 50 nm passa-banda) e um laser de diodo 640 (filtro de excitação: λ = 690, 50 nm passa-banda). Para cada condição experimental, 12 campos /poço (~ 1200 células) foram adquiridos e analisados ​​usando um Acapella modificado (Perkin Elmer) algoritmo que mede a intensidade de coloração LC3B na área do citoplasma normalizada numa base por célula.

fenótipo salvamento

as células foram semeadas a 2 x 10

5 células /poço em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. Estas células foram transf ectadas com diluídos em série ou PAK3 SGK2 mutante ou plasmídeos que expressam o tipo selvagem, utilizando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) como um reagente de transfecção. Após 6 horas, o meio de transfecção foi removido. As células foram infectadas com lentivírus shRNA que expressam (1 ml) que tinha sido diluído 1:10 ou 1:15 em meio contendo 10 ug /ml de polibreno, e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante a noite. As células foram tripsinizadas e contadas, e semeadas a 2000 células /poço em placas de 96 poços. Para os ensaios de controlo de apoptose e viabilidade celular, as células foram colhidas às 72 horas e 5 dias após a infecção, respectivamente, usando os métodos acima mencionados.

A quantificação de ARNm PAK3 e SGK2

As células foram semeadas a 2 × 10

5 células /poço em placas de 6 poços um dia antes da infecção com shRNA-expressando lentivírus. A infecção ou transfecção /infecção foi realizada como previamente descrito. O ARN total foi extraído a partir de células 72 horas após a infecção, utilizando RNeasy Mini Kit Além disso, além de digestão com DNase I (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. ARN total extraído (2-5? G) foi sujeitos a transcrição reversa num volume total de 20 ul usando SuperScript III Síntese da primeira cadeia do sistema (Invitrogen, Carlsbad, CA). ADNc resultante foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização. PAK3 (Taqman Gene Expression Assay Applied Biosystems ID: Hs00176828_m1) e SGK2 (ID: Hs00367636_m1) foram realizados ensaios para a quantificação de ARNm utilizando um sistema de PCR em tempo real 9700HT (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). GAPDH mRNA também foi medida no mesmo poço para padronizar o carregamento da amostra.

A quantificação de proteínas PAK3 e SGK2

os níveis de proteína foram determinadas a partir das mesmas de transfecção e experiências de infecção utilizadas para quantificar mRNA knockdown. As células foram colhidas 72 horas após a infecção, lavadas uma vez com tampão fosfato salino (PBS) e lisadas em tampão de lise (HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, 1% Igegel CA-630, 0,25% de desoxicolato de sódio, 10% de glicerol, 25 NaF mM, MgCl 10 mM

2, 1 mM de EDTA, 1 mM de vanadato de sódio, 1 comprimido /50 mL de inibidor de proteases) em gelo durante 30 minutos. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação (15.000 rpm) a 4 ° C durante 10 minutos. A proteína total, 80? g, foi misturada com um tampão de carga e ferve-se a 100 ° C durante 10 minutos. As amostras foram submetidas a uma electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de 4-15% e posteriormente transferidas electroforeticamente para membranas de PVDF. Após os locais de ligação não específicos foram bloqueados com leite magro a 5%, a membrana foi incubada com os anticorpos primários (diluição a 1: 1000; anticorpo PAK3 monoclonal anti-humano de N-19 e anti-humana anticorpo monoclonal SGK2 3T-2, Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante a noite. A membrana foi lavada três vezes e incubadas com o anticorpo secundário respectivo durante 1 hora à temperatura ambiente. As bandas imunorreactivas foram visualizadas com o reagente de quimioluminescência aumentada (ECL), de acordo com as instruções do fabricante. carga de proteína foi padronizado pela inclusão de proteína GAPDH como controle.

Resultados

RNAi reduz PAK3 e SGK2 expressão

Para validar o efeito da PAK3 shRNA na expressão PAK3, quatro independentes PAK3 shRNA foram usadas para direccionamento diferentes regiões do ARNm PAK3. As células HeLa foram infectadas com lentivírus que albergam o respectivo PAK3 shRNAs. Como um controlo específico, foi empregue lentivírus abrigando um shRNA NT. A eficiência de infecção por lentivírus foi optimizada usando uma expressão de lentivírus vetor Turbo-GFP; uma taxa de infecção de 90% foi obtida. Uma significativa knockdown de ARNm PAK3 foi observada em células HeLa após a infecção com cada um dos quatro testados shRNAs (Fig. 1A). Resultados semelhantes foram também observados quando se usa lentivírus indutível expressando PAK3 shRNAs em células CaSki (dados não mostrados). Desde que a proteína PAK3 é expresso em níveis muito baixos em células HeLa e CaSki, e migra com PAK2, que também pode ser detectada pelo anticorpo N-19 PAK3 (ver Materiais e Métodos), knockdown proteína PAK3 foi examinada numa elevada expressão PAK3 pequeno de células de carcinoma do pulmão de células, DMS-79. Todo o PAK3 shRNAs testado diminuiu significativamente ambos PAK3 ARNm e os níveis de proteína em células de DMS-79 (Fig. 1B e C).

os níveis de ARNm foram determinados por análise de PCR quantitativa de transcrição reversa a 72 horas após a infecção com o respectivos vectores shRNA; controlo indica a infecção com um não-alvo vector que codifica shRNA. Cada barra no gráfico de barras representa a média ± desvio padrão de 4 repetições de uma de três experiências independentes com resultados semelhantes. Os níveis de ARNm foram normalizados com GAPDH expressão; PAK3 e proteína SGK2 expressão foram determinadas 72 horas após a infecção usando um imunotransferência de Western. proteína GAPDH actuou como um controlo de carga de proteína para cada amostra. (A) PAK3 shRNA diminuição dos níveis de ARNm em células HeLa PAK3; (B) PAK3 shRNAs reduzida expressão de mRNA PAK3 em DMS-79 células; (C) PAK3 shRNAs reduzida expressão da proteína em células PAK3 DMS-79. DMS-79 lisados ​​celulares foram analisados ​​com anticorpo monoclonal PAK3 N-19; (D) SGK2 shRNAs níveis reduzidos de ARNm SGK2 em células HeLa; (E) SGK2 shRNAs reduziu os níveis de mRNA SGK2 em GTL16 células; (F) SGK2 shRNAs reduziu os níveis de proteína em SGK2 GTL16 células. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​GTL16 com anticorpo monoclonal SGK2 3T-2.

Experiências semelhantes foram realizadas para validar SGK2 shRNAs. a expressão de ARNm em células HeLa SGK2 foi dramaticamente reduzida pelo quatro SGK2 shRNAs (Fig. 1D), tal como a expressão de ARNm em células CaSki SGK2 indutível por SGK2 shRNAs (dados não mostrados). Tal como acontece com PAK3, a expressão da proteína SGK2 é demasiado baixa para ser detectada em células HeLa e CaSki. O knockdown de proteína SGK2 foi, portanto, avaliada em GTL16, uma elevada expressão de células de carcinoma gástrico linha SGK2. SGK2 shRNAs reduziu significativamente SGK2 ARNm, bem como a expressão da proteína em células GTL16 (Fig. 1E e 1F). Assim, verificou-se a knockdown de PAK3 e SGK2 pela sua shRNAs correspondente.

fenótipos induzidas por PAK3 e

células HeLa SGK2 lentiviral shRNAs

foram infectados com PAK3 e SGK2 shRNA expressando lentivírus para determinar a fenótipos shRNA-induzida. células CaSki foram infectados com PAK3 inducible e SGK2 shRNA lentivírus que expressam. O shRNA NT e um vector de lentivirus não contendo qualquer cassete de expressão shRNA foram usadas como controlos. Para o estudo fenótipo, infecção por lentivírus com e sem centrifugação foram comparados. Embora melhor eficiência de infecção pode ser conseguido pelo spin-inoculação com a mesma quantidade de vírus, a toxicidade associada com NT shRNA e mesmo o controlo sem vírus shRNA aumentado proporcionalmente (dados não mostrados). Portanto, as células foram infectadas, sem centrifugação. As células foram divididas em diferentes placas de 24 horas após a infecção para a caspase 3/7 e ensaios de proliferação de células /viabilidade. Um curso de tempo da caspase 3/7 expressão induzida pelos vários PAK3 shRNAs indicado expressão pico 72 horas após a infecção (Figura 2A;. O tempo de curso de dados não mostrados). Ambos PAK3 e SGK2 shRNAs reduziu a viabilidade das células HeLa e CaSki (Fig. 2B e 2D, dados não mostrados para as células CaSki) como relatado anteriormente [10]. Os quatro shRNAs PAK3 variaram na sua capacidade para induzir apoptose de células HeLa (Fig. 2A). O shRNA, 3244, foi o mais potente na activação de apoptose, enquanto que a indução de shRNA 3245 exibida marginal de apoptose, apesar da sua capacidade para suprimir fortemente PAK3 ARNm em células HeLa (Fig. 1A). Além disso, a proliferação de células shRNA 3245 inibiu /viabilidade semelhante ao mais forte indutor de apoptose, shRNA 3244 (Fig. 2A e 2B), indicando que os vários shRNAs PAK3 induzida diferentes vias que conduzem à morte celular. A discrepância entre a indução de apoptose e a expressão do gene knockdown, assim como a estimulação da morte celular, também foi observada com SGK2 shRNA 2112 (Fig. 2C e 2D).

células HeLa (A) foram infectadas com PAK3 shRNA numa diluição de 1:10. apoptose celular foi determinada utilizando um ensaio de luciferase caspase 3/7 Glo 72 horas após a infecção. O gráfico de barras apresenta dobre mudanças de caspase 3/7 atividade (luminescência) induzida por vários shRNAs em comparação com um controle sem shRNA. Os dados representam a média ± desvio padrão de 4 repetições de uma das duas experiências separadas com resultados semelhantes; (B) Inibição da proliferação /viabilidade de células HeLa por PAK3 shRNAs foi avaliada utilizando um ensaio de azul CellTiter 5 dias após a infecção. O gráfico de barras apresenta cento viabilidade (fluorescência) de células shRNA infectados lentivirais comparação com um lentivírus de controlo sem expressão shRNA. Os dados representam a média ± desvio padrão de três experiências independentes; (C) SGK2 shRNAs lentivirais induziu apoptose de células HeLa. Os dados representam 4 repetições de uma das duas experiências separadas com resultados semelhantes; (D) SGK2 shRNAs inibiu a proliferação /viabilidade das células HeLa. Os dados representam a ± desvio médio padrão de dois experimentos independentes; (E) SGK2 lentiviral shRNAs autofagia induzida de células HeLa. As células foram infectadas com lentivírus SGK2 shRNAs na diluição de 1:16 e 1:32, respectivamente. 1 uM rapamicina foi incluído como um controlo autofagia em cada placa. placas de células foram fixadas 72 horas após a infecção e imunocoradas para a indução de autofagia com um anticorpo primário LC3B, seguido de um anticorpo secundário conjugado com Alexa 488-. As imagens foram capturadas usando o confocal Imager conteúdo Opera alta. Imagens de células HeLa SGK2 Lentivirus shRNA-infectadas (~ 1200 células /poço) foram capturadas e o número de células contadas. A intensidade média de coloração LC3B por célula foi medida e calculada utilizando um algoritmo modificado Capella (Perkin Elmer). O gráfico de barras apresenta a ± desvio médio padrão de LC3B intensidade da coloração derivada de dois poços.

A autofagia é um dos principais mecanismos para manter a homeostase celular e não está directamente associada à morte celular, em vez de um auto -cannibalisation via [30]; Patel et al., 2012). Todos os shRNAs testados em nossos experimentos, incluindo quatro SGK2 shRNAs eo controle shRNA (NT shRNA), induzida conversão autofágica LC3B marcador quando comparado com o não controle da infecção (Fig. 2E). Os três SGK2 shRNAs cada exibida uma forte capacidade para induzir a autofagia em células HeLa que NT shRNA enquanto um (shRNA2112) se comportou de forma semelhante ao NT shRNA. -Induzida shRNA SGK2 marcador autofagia (expressão de LC3B) não se correlacionou com a diminuição do número de células (comparar Fig. 2E com 2D), o que sugere também que os vários shRNAs SGK2 mediada por diferentes vias que conduzem à morte celular.

PAK3 knockdown com deficiência de inibição shRNA de HeLa crescimento celular

para esclarecer melhor se induzida por shRNA PAK3 morte HPV + celular foi associada a knockdown PAK3, um PAK3 knockdown deficiente shRNA com uma única incompatibilidade com o mRNA PAK3 foi testado para a sua capacidade para induzir a morte celular em células HeLa e CaSki. A adição de doxiciclina de células HeLa infectadas com NT shRNA não diminuiu a expressão de ARNm PAK3 nem afectem o crescimento celular (Fig. 3). Observou-se uma diminuição significativa nos níveis de ARNm PAK3 por expressão induzida pela doxiciclina shRNA de 3245, enquanto que o ARNm PAK3 não foi afectada pela expressão induzida pela doxiciclina de shRNA 3245 M15 (Fig. 3A). No entanto, tanto o tipo selvagem e mutante PAK3 shRNAs inibiu drasticamente a proliferação de células HeLa /viabilidade de forma semelhante (Fig. 3B), sugerindo que a morte celular induzida por HeLa PAK3 shRNA não está associado com knockdown PAK3. Um resultado semelhante foi também observada com a linha de células CaSki (dados não mostrados).

os níveis de mRNA PAK3 foram determinados por análise de PCR quantitativa de transcrição reversa a 72 horas após a infecção com os respectivos vírus shRNA. o número de células vivas foram contadas 5 dias após a adição de 20 ng /mL de doxiciclina. O gráfico de barras que representa a média ± desvio padrão de 3 repetições de uma de duas experiências independentes, com resultados semelhantes. Os níveis de ARNm PAK3 foram normalizados com GAPDH expressão; (A) Efeito do tipo selvagem (3245) e PAK3 mutante shRNA 3245 (3245 M15) sobre os níveis de ARNm em células HeLa PAK3; (B) Efeito do tipo selvagem (3245) e PAK3 mutante shRNA 3245 (3245 m15) sobre o crescimento de células HeLa.

shRNAs que não têm como alvo genes humanos também inibir a proliferação /viabilidade de HPV + câncer cervical células

para determinar se as células cancerosas cervicais HPV + são especificamente vulneráveis ​​a PAK3 e SGK2 shRNAs, investigamos quatro lentivírus controle de vetores shRNA que não segmentam genes humanos (Luc, EGFP, T-GFP e NT shRNAs, consulte a Tabela 1) para o seu efeito sobre a proliferação /viabilidade das células HeLa e CaSki. Nenhuma knockdown de ARNm e expressão PAK3 SGK2 pelo controlo foi observado shRNAs (dados não mostrados). Cada vírus foi titulada para quantificar a sua capacidade para induzir a inibição de células HeLa e de células CaSki proliferação /viabilidade. PAK3 e SGK2 shRNAs também foram incluídos no estudo para comparação. Três dos shRNA controlo, excepto NT shRNA, suprimiu o crescimento de células HeLa com potências comparáveis ​​a PAK3 e SGK2 shRNAs (Fig. 4A). Dois shRNAs de controlo (EGFP Luc e shRNAs) de inibição do crescimento induzida de CaSki (Fig. 4B). Além disso, células HeLa e células CaSki perda de viabilidade foi observada usando Luc e EGFP shRNAs num vector de expressão de shRNA DOX-indutível (dados não mostrados). Assim, as células HeLa e CaSki mostraram ser susceptíveis a shRNAs que não têm como alvo genes humanos, o que sugere que a inibição do crescimento dessas células pode ser induzida por shRNAs através de vias não específicas de genes.

A viabilidade celular foi avaliada através um ensaio CellTiter azul 5 dias após a infecção. Cada um dos vírus foi titulada para a infecção para determinar a sua potência de inibição da indução /viabilidade proliferação de células HeLa. a viabilidade celular por cento (fluorescência) na presença de lentivírus shRNAs foi calculada por comparação com um controlo sem expressão lentivírus shRNA. Os dados representam a ± desvio médio padrão de 4 repetições de um dos três experimentos independentes com resultados semelhantes; (A) Inibição da proliferação de células HeLa /viabilidade; (B) Inibição da proliferação /viabilidade das células CaSki.

fenótipos induzidas por PAK3 e SGK2 shRNAs não poderia ser resgatados com as correspondentes expressões transgênicos

Existem limites intrínsecos sobre a especificidade de ARNi, tal como a resposta de interferão de cadeia dupla de RNA e induzida por fora do alvo efeitos resultantes da hibridação imperfeita quando um shRNA age como um miARN. Um experimento ideal deve demonstrar que a expressão de uma versão mutada do gene alvo não é reconhecido pelo shRNA ou reverte resgata o fenótipo. Como um primeiro passo, a expressão PAK3 foi caracterizado em células HeLa. Existem quatro variantes de splicing PAK3 em mamíferos [31]. Todas as variantes são expressos no cérebro enquanto que, em alguns tecidos, tais como rim e fígado, apenas a variante PAK3 A é expresso [31]. Ao utilizar o método de RT-PCR específico do variante anteriormente descrita [31], que confirmou que apenas a variante A é expresso em células HeLa (Fig. 5a). A região de codificação do ADNc de PAK3 a partir de células HeLa é idêntica à sequência do GenBank NM_002578. No que diz respeito ao SGK2, a sua expressão em células HeLa era demasiado baixa para ser caracterizado; portanto, foram utilizados plasmídeos das duas variantes SGK2 relatados expressão para o estudo de recuperação [19].