PLOS ONE: pontos quânticos para detecção multiplexada e Caracterização de células cancerosas da próstata Usando um Digitalização de campo próximo microscópio óptico

Sumário

Nesta digitalização estudo de campo próximo microscopia óptica (SNOM) tem sido utilizada em conjunto com rotulagem ponto quântico para interrogar a composição biomolecular das membranas celulares. A técnica ultrapassa os limites de difracção óptica encontrados em microscopia de fluorescência padrão e também produz informação topográfica vital. A técnica tem sido aplicado para investigar a adesão célula-célula em células epiteliais humanas. Isto tem sido realizado através de imunofluorescência da célula-célula proteína de adesão de E-caderina. Além disso, um protocolo de marcação dupla foi optimizado para facilitar um estudo comparativo dos mecanismos de adesão e o efeito da expressão aberrante de proteína de adesão em ambas as células epiteliais saudáveis ​​e cancerosos. Este estudo relata claras diferenças na morfologia e fenótipo de células saudáveis ​​e cancerosas. Em células epiteliais da próstata saudáveis ​​(PNT2), E-caderina foi predominantemente localizados em torno da periferia da célula e dentro de extensões filopoidais. A presença de E-caderina parecia ser melhorada quando o contato célula-célula foi estabelecida. Em contraste, o exame das células de adenocarcinoma da próstata metastático (PC-3) não revelaram qualquer rotulagem de E-caderina em torno da periferia das células. Esta falta de funcional E-caderina em células PC-3 coincidiu com uma marcadamente diferentes células morfologia e PC-3 não foram encontrados para formar associações célula-célula estreitas com seus vizinhos. Temos demonstrado que, com uma metodologia de preparação de amostras totalmente otimizado, rotulagem ponto quântico multiplexados em conjunto com imagiologia SNOM pode ser aplicado com sucesso para interrogar localização biomolecular dentro de membranas celulares delicadas

Citation:. Walker K-AD, Morgan C, Doak SH, Dunstan PR (2012) pontos quânticos para detecção multiplexada e Caracterização de células cancerosas da próstata Usando um Digitalização de campo próximo microscópio óptico. PLoS ONE 7 (2): e31592. doi: 10.1371 /journal.pone.0031592

editor: Joel M. Schnur, George Mason University, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de agosto de 2011; Aceito: 11 de janeiro de 2012; Publicação: 09 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Walker et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. HEFCW são reconhecido por investimento em equipamentos (www.hefcw.ac.uk). EPSRC são reconhecidos por fornecer financiamento estudantil pesquisa de doutorado (www.EPSRC.ac.uk). Graças à Fundação Prostate UK (número de concessão: G2009 /27) para apoio a aspectos deste trabalho (www.prostateaction.org.uk). SH Doak é apoiado por um RCUK Academic Fellowship (www.rcuk.ac.uk). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adesão celular desempenha um papel importante na manutenção da arquitectura dos tecidos e órgãos, e é essencial para o seu funcionamento correcto. adesão célula-célula anormal tem implicações no aparecimento de muitas doenças e patologias. Um esforço tem sido feito por muitos investigadores para determinar a relação entre a adesão celular e a capacidade metastática de muitos cancros [1], [2].

E-caderina é um dos principais mediadores da célula-célula adesão em tecidos epiteliais e tem sido extensivamente examinado para determinar o seu papel na progressão e metástase do cancro. Foi demonstrado que a perda de expressão ou função de E-caderina está associada ao aumento do potencial invasivo [3], o potencial metastático [4] e pior prognóstico do paciente [5], [6]. Esta relação é particularmente importante para os cancros da próstata, que têm uma propensão para metastizar e formar tumores secundários (principalmente esquelético), resultando em um prognóstico pobre paciente [7], [8]. Apesar dos esforços significativos foram feitos no sentido de compreender o papel da E-caderina na progressão do câncer de próstata, os pesquisadores não chegaram a um consenso [9], [10]. Uma compreensão mais detalhada dos mecanismos de adesão pode conduzir ao desenvolvimento de novos tratamentos contra o cancro, tal como indicado pelos estudos preliminares efectuados por Zhou

et ai.

[11] e Mao

et ai.

[ ,,,0],12].

Embora rotineiramente aplicada em ciências da vida, técnicas de microscopia de fluorescência convencional são limitadas pelo limite de difração óptica. O acesso a informações para além do limite de difração de uma vasta gama de tipos de amostras foi possível após o surgimento de técnicas de microscopia de varredura por sonda (SPM). SPM permite o exame de uma amostra de metrologia com resolução nanoescala e varrimento de campo próximo microscopia óptica (SNOM) é um exemplo que é particularmente adequado para interrogar as interacções e funções de materiais biológicos [13] – [15]. SNOM tem a capacidade de sondar simultaneamente topografia e examinar recursos ópticos em escalas que normalmente não podem ser alcançados com a microscopia de fluorescência convencional, explorando as propriedades de ondas evanescentes. Um típico SNOM conjunto experimental está ilustrada na Figura 1. Embora tenha havido avanços rápidos (veja a revisão por Galbraith e Galbraith [16]) no campo de microscopia óptica de super-resolução, com o desenvolvimento de técnicas, tais como esgotamento de emissão estimulada (STED), microscopia de localização activado foto-(PALM) e imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) [17], o uso de ópticas quase-campos para investigações de superfície ou membrana usando microscopia de reflexão interna de fluorescência total (TIRFM) tem também se tornam mais comuns [18], [19]. Por sua natureza, TIRFM restringe o Z-range iluminado e, portanto, oferece uma melhor resolução do que a microscopia confocal. SNOM tem os benefícios de TIRFM mas, além disso gera um campo próximo óptica, que também é espacialmente confinado a dimensões nanométricas em X e Y. Além disso a sua sonda é combinada com um mecanismo de feedback topográfica que lhe permite revelar simultaneamente as mudanças estruturais da amostra juntamente com a sua resposta óptica.

Este artigo relata o uso de um protocolo de rotulagem dupla otimizado para levar uma estudo comparativo dos mecanismos de adesão em ambas as células epiteliais saudáveis ​​e cancerosos. O foco do estudo foi uma análise de alta resolução utilizando SNOM sobre a função da proteína E-caderina em duas linhas celulares. Como bem como E-caderina, a proteína de junção apertado ZO-1 foi seleccionado como um controle de imagem adequado, uma vez que é expresso na membrana plasmática na fronteira célula-célula. Assim, os anticorpos contra as proteínas de adesão de E-caderina e ZO-1 foram utilizados para marcar indirectamente células epiteliais prostáticas normais e PNT2 células de adenocarcinoma da próstata PC-3. A técnica SNOM examina a localização subcelular diferencial de moléculas de adesão célula-célula em alta resolução e tem sido realizada em paralelo com estudos de expressão gênica para dar indicações gerais sobre função e expressão.

Materiais e Métodos

Cultura de células

próstata epiteliais, PNT2 e células de adenocarcinoma de próstata, PC-3, foram obtidos a partir da Colecção Europeia de culturas de células (Salisbury, UK). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 1% de L-glutamina, 60 unidades /mL de penicilina e 60 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C /5% de CO

2. As células foram sub-cultivadas quando atingiram aproximadamente 80% de confluência.

Para geração de imagens, as células foram cultivadas em estéreis 25 mm lamelas de vidro circulares. As células foram fixadas à temperatura ambiente utilizando 3,7-4% ultra-pura isenta de formaldeído metanol (Parque Scientific Ltd., Northampton, UK) em PBS durante 15 minutos, seguido por três lavagens de 5 minutos em PBS /glicina 100 mM e desidratada através uma série de etanol. As amostras foram armazenadas a 4 ° C até ser necessário para a marcação por fluorescência.

extracção de RNA e PCR quantitativo em tempo real (PCR)

As células foram cultivadas até à confluência em 75 cm

3 frascos . O ARN celular total foi extraído utilizando o estojo de extracção de RNeasy (Qiagen, Crawley, Reino Unido) e de ADN residual foi removido por tratamento com DNA-free ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN de 1 ug, utilizando iniciadores aleatórios e o kit de transcrição reversa de síntese de ADNc de Alta Capacidade (Applied Biosystems, Warrington, UK). As reacções de PCR em tempo real foram realizadas no termociclador iCycler iQ térmica (laboratórios Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK), utilizando a metodologia de detecção de SYBR Green. Os conjuntos de iniciadores foram concebidas para serem exão-exão abrangendo a fim de minimizar a possibilidade de que qualquer ADN genómico contaminante iria ser amplificado. Os conjuntos de iniciadores utilizados foram também testados para garantir que todos eles demonstraram eficiências iguais de amplificação. Todas as reacções foram realizadas em triplicado com 2 ul de cDNA, 12,5 ul iQ SYBR Green Supermix (laboratórios Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) e 0,2 uM iniciadores directos e inversos, num volume de reacção final de 25 ul. As condições de amplificação de PCR foram 95 ° C durante 3 minutos, seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 30 segundos. Fold expressão foi normalizada para PNT2. E-caderina e ZO-1 foram amplificadas utilizando os iniciadores apresentados na Tabela 1. Também são mostradas as sequências de iniciadores para actina e β-HPRT, que foram utilizados como controlos endógenos.

Western blotting

A proteína total foi extraído usando tampão RIPA (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido). Trinta microgramas de proteína foi corrida num gel de 7,5% de Tris-glicina PRINCIPAL (laboratórios Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas com leite em pó a 5% sem gordura em Tween /TBS (todos Sigma Aldrich, Dorset, UK) para inibir a ligação não específica e incubadas durante a noite a 4 ° C utilizando anti ZO-1 de anticorpo de ratinho (Invitrogen, Paisley, Reino Unido ) em 1:250 e anticorpo de coelho anti-e-caderina (New England Biolabs, Hertfordshire, Reino Unido) em 1:1000. β-actina (1:1000) foi utilizado como um controlo para a carga de proteína. As membranas foram lavadas para remover o anticorpo primário e incubadas com peroxidase de rábano anti-ratinho /anticorpos secundário conjugado anti-coelho (1:1000) durante 1 hora à temperatura ambiente. As proteínas foram visualizadas utilizando o kit de detecção chemiluminescene Immun-Star WesternC (laboratórios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) e quantificadas por meio da densitometria e quantidade Um software (laboratórios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido).

Imunofluorescência

Todas as etapas foram realizadas em condições ambientais, a menos que indicado de outra forma. Imunomarcação foi geralmente levada a cabo dentro de 24 horas de fixação. Todos os passos dos protocolos de imunofluorescência foram aperfeiçoado dos procedimentos básicos descritos pelos fabricantes; incluindo as condições de permeabilização, passos de bloqueio, concentração de reagentes, condições de incubação e os passos de lavagem. A optimização foi completado para cada linha de células utilizada neste estudo. experiências de controlo negativo foram efectuadas ao longo marcação por fluorescência para assegurar a selectividade dos marcadores fluorescentes. Os controlos negativos não foram encontrados para produzir qualquer padrão de marcação distinto ou ter qualquer rendimento de fluorescência significativa. Para células dupla etiqueta PNT2 contra a E-caderina e ZO-1, as lamelas foram lavadas com PBS, permeabilizadas com 0,1% de Triton-X durante 10 minutos e incubadas com o Image-iT potenciador sinal FX (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 30 minutos . As lamelas foram então lavadas e posteriormente incubadas com 31 ug /ml de ratinho anti-ZO-1 de anticorpo (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 2 horas a 37 ° C. Para etiquetar ZO-1 com quantum dots, as lamelas foram incubadas com 30 nM de Qdot 525 de cabra anti-IgG de ratinho conjugado (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 1 hora. o anticorpo primário anti-E-caderina de coelho (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi então aplicado às células a uma concentração de 18 ug /ml e lamelas foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C. Para etiquetar E-caderina com quantum dots, Qdot 605 de cabra anti-coelho foi aplicada a uma concentração de 20 nM e deixada durante 1 hora (Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Antes da imagem, as lamelas foram lavadas em PBS para remover o excesso de pontos quânticos não ligados. Para facilitar a imagiologia SNOM, as amostras foram adicionalmente lavadas com água, desidratadas através de uma série de etanol e secou-se ao ar. Para a etiquetagem dupla de células PC-3 foi necessário um protocolo ligeiramente diferente. Para reduzir a coloração de fundo, lamelas foram bloqueadas com PBS /glicina 100 mM, antes da aplicação dos anticorpos e a ordem de aplicação foi de E-caderina anticorpo primário, o anticorpo anti-coelho de 605 cabra Qdot, ZO-1 de anticorpos primários e Qdot 525 cabra anti -mouse anticorpo secundário (20 nM de concentração foi usada para Qdot 525, todas as outras concentrações e tempos de incubação foram como para células PNT2). As amostras foram observadas por microscopia de fluorescência antes da imagiologia SNOM para verificar que a marcação tinha sido bem sucedida. As amostras foram fotografadas dentro de 48 horas de preparação.

imaging SNOM

As imagens SNOM foram obtidos utilizando um Aurora 3 (Veeco Instruments, Cambridge, UK), utilizando sondas de fibra óptica de alumínio revestido com frequência ressonante 80-110 kHz e a abertura de cerca de 50-100 nm, conforme especificado pelos fabricantes (Veeco Instruments, Cambridge, UK). A 488 nm Ar

+ laser foi utilizado para sinais de excitação e de transmissão foram recolhidos com um objectivo de recolha 40 ×, 0,65 NA. Os sinais foram passados ​​através de um (passa alto) de filtro óptico de Raman de 488 nm de ponta para eliminar a luz do laser. Para a localização de imagem proteínas ZO-1 (marcado com emissores de quantum dots verde), a luz remanescente foi passado através de um filtro de passagem de 525 nm de banda óptica, para remover fluorescência vermelha, e concentrado para um diodo foto avalanche (APD). Para a imagem a localização de proteínas E-caderina (marcado com emissores de pontos quânticos vermelhos), um nm filtro passa-banda óptico 609 foi utilizada. Neste artigo, os sinais de APD que surgem devido à fluorescência são apresentados e os tempos típicos de integração APD foram 20 ms /pixel, com resolução de imagem de 300 x 300 pixels.

A análise estatística

Para testar a pressuposto que os dados eram normalmente distribuídos, as parcelas normais foram realizadas para cada grupo. Uma amostra estatísticas de Kolmogorov-Smirnov resultou em valores de p 0,05, indicando os dados foram distribuídos normalmente. A análise foi, portanto, realizada utilizando o teste ANOVA paramétrica. análise Dunnett post hoc foi realizada para comparar linhas celulares de cancro com o não-cancerosas controle de linha celular e análise de Tukey post hoc foi realizada para comparações múltiplas de grupo. A

p

-valor. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Expression Analysis

Os dados de expressão gênica foi obtida através de reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) e para a e-caderina, revelou uma redução estatisticamente significativa (-7,25 vezes) na expressão em PC-3 (

P

= 0,001) em comparação com PNT2. Para ZO-1, embora a expressão foi regulada para baixo em PC3 em comparação com PNT2 (-1,20 vezes) esta não foi considerada significativa (Figura 2).

Os níveis de expressão foram normalizados contra dois genes de manutenção e em mudar expressão relativa a PNT2 é ilustrado. * Denota diferença significativa (P 0,05). Comparação com PNT2

análise de Western blot revelou que estabelece regulação da E-caderina também foi evidente no nível de proteína. Densitometria revelou uma dobra para baixo regulação 2.6 do E-caderina na linha de células PC-3 em comparação com PNT2. Os níveis de proteína para ZO-1 também foram regulados (-1,05 vezes) em relação ao PNT2, apoiando os dados de expressão gênica (Figura 3).

A regulamentação significativa para baixo de E-caderina é observado enquanto as diferenças de a expressão da proteína ZO-1 entre as linhas de células é menos significativa. Note-se, β-actina foi utilizada para um controlo de carregamento.

dupla marcado células PNT2

para conseguir a separação de filtro dos sinais de fluorescência produzidos pelas amostras marcadas dupla, era importante utilizar pontos quânticos que emitem em comprimentos de onda distintamente separada, portanto, a seleção de pontos quânticos com comprimentos de onda de emissão de 605 nm e 525 nm. PNT2 amostras foram examinadas utilizando SNOM e as imagens apresentadas na Figura 4 foram gerados. Topografia informação pode ser visto na Figura 4A, que foi adquirido para demonstrar que a extenso protocolo etiquetagem dupla não resultou em alterações na estrutura da amostra. Como pode ser visto na Figura 4A, a estrutura celular permaneceu bem preservada e características podem ser claramente distinguidos.

imagens revelam a resposta (B, C e D) topografia (A e E) e de fluorescência. Imagens (B) e (C) foram obtidos com diferentes filtros para distinguir entre espectralmente fluorescência vermelha e verde, a identificação de locais de ZO-1 e E-caderina, respectivamente. A região em caixa em (A) foi examinada a maior resolução para gerar a imagem detalhada de E-caderina de fluorescência (D) e a topografia de acompanhamento é mostrado em (E). regiões circulado em (C) e a seta /ponta de seta em clusters destaque E-caderina (D).

correspondentes imagens ópticas foram adquiridos para a imagem topografia mostrado na Figura 4A a revelar a localização do ZO- 1 e e-caderina (mostrado nas Figuras 4B e 4C, respectivamente). Análise da expressão de genes revelou ZO-1 é expresso em ambas as linhas de células e assim para os fins deste estudo foi utilizado como um controlo positivo. Apesar de uma proporção relativamente baixa de sinal-para-ruído de fundo ~5.6, A Figura 4B demonstra que as proteínas ZO-1 são apropriadamente localizada na periferia das células em células PNT2.

Ao examinar a E-caderina (Figura 4C), consideravelmente aumentar os níveis de sinal-para-ruído de mais de ~33 sejam alcançados. A qualidade superior das imagens obtidas é provavelmente devido à natureza mais brilhante dos pontos quânticos vermelhos em comparação com verde. A Figura 4C revela a E-caderina é encontrada principalmente ao longo dos limites da célula PNT2 com níveis particularmente elevados de fluorescência concentrada em regiões específicas (com um círculo na Figura 4C).

De modo a examinar as regiões com elevada actividade fluorescente em mais pormenor, a região encaixotado na Figura 4A foi posteriormente digitalizadas em resolução superior. A imagem topografia resultante (Figura 4E) revela uma rede de filopódios a partir de células que estabeleceram contato vizinho. A imagem de fluorescência em simultâneo adquirida é mostrado na Figura 4D. Uma fileira de fluorescência correspondente à localização de E-caderina pode ser visto correndo paralelamente ao bordo de uma célula (ver seta na Figura 4D). Linhas adicionais de fluorescência também estão presentes ao longo do comprimento da grande filopodium no centro da imagem (identificado pela seta). Estes resultados confirmam que a localização de E-caderina pode ser examinada com êxito em amostras que foram coradas dupla.

Análise Estrutural de células PC-3

Para comparar a morfologia de células saudáveis ​​e cancerosas , imagens brilhantes microscopia de campo foram inicialmente obtidos. PNT2 células confluentes são mostrados na Figura 5A, enquanto que as células PC-3 são apresentados na Figura 5B. As células PC-3 exibir uma aparência muito diferente: algumas células PC-3 exibir uma morfologia esférica, enquanto outros parecem mais alongadas e fibroblasto-like, muitas vezes possuindo lamellipodia alongado

Antes de imunomarcação de PC. -3 células, sua morfologia foi ainda examinada usando de alta resolução aquisições SNOM topografia. As imagens mostradas na Figura 6 confirmam directamente as observações da Figura 5. Algumas células aparecem de forma esférica, como demonstrado na Figura 6A, enquanto outros apresentam uma morfologia mais do tipo fibroblastos com longa, a ramificação saliências citoplasmáticos (como indicado pelas setas nas Figuras 6C e 6D) . Estas saliências são significativamente mais longo do que o observado filopios tipicamente sobre as células saudáveis ​​e foram encontrados frequentemente para prolongar a comprimentos superiores a 25-30 mm, isto é, para além da gama de tamanho das verificações de topografia. Além disso, as medições de mostrar o seu diâmetro ser muito mais largo do que o mais fina filopios, alguns dos quais podem distinguir-se saliente a partir do lamelip�ios como indicado por setas nas Figuras 6C e 6D. Estas saliências maiores tendem a desaparecer como seus aumentos de comprimento no entanto, em seu ponto mais largo que foram encontrados para medir até 2,1 mm e alcançar alturas de até cerca de 300 nm. Medidas sobre as saliências finas observadas nestas imagens reveladas larguras variando entre 120-340 nm. Os núcleos de células “(indicado por N) podem ser claramente distinguidos nas Figuras 6A e 6B. As regiões enquadradas nas Figuras 6A e 6B representam áreas que foram posteriormente ampliada. Isto permitiu contraste superior entre as características de altura semelhante e expostos muito mais detalhes.

Imagem (A) é um exemplo típico de um não-confluente PC-3 de amostra. O quadrado a tracejado indica uma região que tem sido estudado em mais pormenor, o que pode ser visto na imagem (C). Nestas imagens as células PC-3 apresentam saliências citoplasmáticos, indicados pela seta na imagem (C). Imagens (B) e (D) mostram uma distribuição mais confluentes de células PC-3. Uma região ampliada é descrito na imagem (B) e imagem (D) é o zoom resultante. A resolução mais alta revela claramente associações célula-célula soltas ao longo da fronteira entre as células; este limite é indicado pela etiqueta M. Na imagem (D) as saliências citoplasmáticos são novamente marcado com uma seta. Outros rótulos utilizados nas figuras incluem pontas de seta para indicar os locais filopódios e a etiqueta N é destacar o núcleo celular.

Em contraste com confluentes células PNT2, PC-3 células não aparecem para formar muito perto associações com células vizinhas. Isto é demonstrado pelas imagens mostradas na Figura 6B e 6D. As lacunas de até 2,1 uM em torno da periferia das células são observados e nenhum selo ao longo da fronteira entre as células adjacentes tenha sido estabelecida (o limite de célula-célula é indicada pela etiqueta M na figura). Várias extensões filopoidais finas podem ser vistos para se projetam através destas lacunas; porém poucos parecem interagir com os de células opostas. Este é notavelmente diferente para as células onde PNT2 filopios a partir de células adjacentes foram observados para interdigitam em toda a região intercelular. Quando as células PNT2 conseguida alta confluência, as células foram completamente seladas em conjunto e sem lacunas podem ser distinguidos.

dupla marcado células PC-3

De modo a avaliar a localização sub-celular de E- proteína caderina nas células PC-3, rotulagem dupla foi realizada novamente. aquisições SNOM típicos de células PC-3 são marcados dupla mostrado na Figura 7. A imagem topográfica é mostrado na Figura 7A e revela uma única célula cujo núcleo (marcado por N) é claramente distinto. As medições mostram que a altura máxima desta célula é atingido através da região nuclear, o que equivale a cerca de 890 nm. O lamellipodium (marcado por L) pode ser visto e verificou-se abranger uma área de cerca de 90 um

2. Um grande saliência celular é visível na célula e é identificado pela etiqueta P na imagem. As medições indicam uma largura de 6,2 ± 0,1 um no seu ponto de origem.

imagens revelam topografia de células (A) e de fluorescência (B, C, D e E). O núcleo é identificado por N, lamellipodium por L e protrusão por P. ZO-1 de localização é mostrado nas imagens (B e D), enquanto rotulagem E-caderina é mostrado em (C e E). As regiões em caixas em (B e C) correspondem às regiões de zoom pormenorizadas apresentadas em (D e E) respectivamente. A seta em (D), salienta a rotulagem periferia superior de ZO-1.

correspondentes aquisições de fluorescência SNOM são mostrados nas Figuras 7B e 7C e foram obtidos usando diferentes filtros passa-banda óptico para distinguir entre ZO- 1 e e-caderina, respectivamente. Uma subsequente zona ampliada (realçada na Figura 7B e 7C) foi gerado por software para permitir a periferia da célula para ser resolvido em mais detalhe. Figuras 7D e 7E revelar a rotulagem relativa de ZO-1 e E-caderina, respectivamente.

Tal como observado anteriormente com as células PNT2, as relações sinal-ruído alcançados com os pontos quânticos verdes na Figura 7B são visivelmente menor em comparação ao obtido por pontos quânticos vermelhas na Figura 7C. A razão sinal-para-ruído da Figura 7B é ~7.2. Correlacionando a imagem de fluorescência ZO-1 (Figura 7B) com a topografia (Figura 7A) revela fluorescência ao longo da região da célula que corresponde ao núcleo. No entanto, a fluorescência pode também ser claramente identificados ao longo da periferia da protuberância celular e é identificada pelas setas na imagem mostrada na Figura 7D. Enquanto o ZO-1 foi principalmente uma ferramenta de controlo, este re-distribuição da fluorescência na região nuclear (semelhante à de E-caderina) foi observado em estudos anteriores [20], [21].

Figura 7C mostra a aquisição SNOM obtido para examinar a localização de proteínas E-caderina em células PC-3, gravando a resposta de fluorescência de campo próximo do emissor de rotulagem ponto quântico vermelho. Embora a imagem mostra uma forte resposta de fluorescência a partir da amostra, o nível de sinal-para-ruído (~14.6) é notavelmente reduzido em comparação com o observado na análise da E-caderina nas células PNT2. Além disso, os sinais de fluorescência são evidentes predominantemente em torno do perímetro do núcleo e também são encontrados para alargar de algum modo ao longo do comprimento da saliência. Isto pode ser visto mais claramente na Figura 7E, que representa um zoom da região em caixa da Figura 7C. Apesar desta resposta, parece haver nenhum padrão de marcação da E-caderina significativa em redor da periferia da célula nas regiões que conferem o contacto célula-célula, como foi observado com a linha de células PNT2. Isto dá uma indicação clara de falta de localização de proteínas adequada nas células PC-3.

Discussão

Na sequência de investigações anteriores dos mecanismos de adesão na linha de células epiteliais saudáveis ​​PNT2 [22], uma metodologia de dupla marcação tem sido desenvolvido para facilitar o estudo de moléculas de adesão em outras linhas de células. optimização extensiva dos protocolos foi necessário a fim de gerar amostras fluorescentes de alta qualidade e para assegurar que imunomarcação reflete com precisão a distribuição de proteínas na membrana celular. Muitos aspectos de preparação foram tomados em consideração durante este procedimento, a fim de alcançar a rotulagem eficaz com alta resposta de sinal e baixa rotulagem fundo, conforme detalhado em Materiais e Métodos.

Análise

A expressão genética revelou uma regulação significativa no E- caderina na linha de células PC-3 em comparação com a linha celular de controlo, PNT2. Este foi validado no nível de proteínas por Western blot e está de acordo com outros estudos que mostram a expressão da proteína caderina-E deve ser regulada negativamente no PC-3 células [23]. ZO-1 a expressão da proteína em ambas as linhas celulares foi encontrado para ser apenas ligeiramente alterada e, portanto, pode atuar como um sinal de controlo adequado. Por isso foi considerado uma abordagem de marcação dupla necessário para investigações de localização de E-caderina, utilizando como SNOM ZO-1 de detecção iria assegurar a detecção óptica no nosso instrumento SNOM foi óptima, particularmente no caso em que os sinais de E-caderina não pôde ser detectado. Para abordar as dificuldades encontradas durante a marcação dupla de PC-3, as proteínas caderina-E foram imunomarcadas com brilhante (devido à sua maior rendimento quântico) vermelhas emissores de pontos quânticos. foi necessária optimização de protocolos para assegurar que a rotulagem eficaz foi conseguida com uma resposta de sinal precisa. Esta foi mais difícil de alcançar na linha de células PC-3, como a expressão de E-caderina é reduzida e um protocolo de rotulagem pouco desenvolvidos pode simplesmente ser rotular a E-caderina mal. Este, por sua vez, apresentar-se como refletindo uma mudança de expressão. Deste optimização extensiva, etiquetagem dupla foi conseguida com sucesso e, assim facilitado o estudo da localização da E-caderina e proteínas ZO-1 em duas linhas de células epiteliais da próstata utilizando a imagiologia SNOM de alta resolução.

Análise de duplo células epiteliais PNT2 saudáveis ​​rotulados revelaram que a e-caderina é predominantemente localizadas ao longo da periferia da célula e apareceu reforçada em regiões onde o contato célula-célula foi estabelecida. Isto foi demonstrado pelos agregados puntiformes de E-caderina, que foram observados quando filopios estabelecido contacto e iniciada a adesão célula-célula, como foi mostrado na Figura 4C. PNT2 células foram encontrados para formar a aparência típica de paralelepípedos que é caracteristicamente visto em tecidos epiteliais normais. Isto foi consistente com estudos anteriores, onde apenas a localização de proteínas E-caderina foi examinado [22]. Como esperado, ZO-1 proteínas também foram encontrados para ser localizada em torno da periferia das células PNT2. Isto foi claramente demonstrado na Figura 4B, apesar da qualidade das imagens de fluorescência ZO-1 sendo inferiores aos obtidos para a E-caderina, devido às diferenças de rendimento quântico do quantum dots utilizados.

O estudo foi estendido para examinar células cancerosas PC-3. Inicialmente a morfologia destas células metastáticas foi analisada através da aquisição de imagens de topografia SNOM. PC-3 foram encontradas células que diferem em estrutura às células epiteliais saudáveis ​​de várias maneiras. Em primeiro lugar, a sua forma geral verificou-se ser mais irregular com algumas células assumindo uma morfologia do tipo fibroblastos, em comparação com o aparecimento mais paralelepípedos de células saudáveis. Em segundo lugar, as células PC-3 eram muitas vezes difíceis de imagem, devido às suas características abruptas. As células PC-3 comumente possuída saliências citoplasmáticos longos, para além do observado filopios rotineiramente em células saudáveis. Finalmente, o exame das amostras mais confluentes revelaram que as células PC-3 formar associações frouxas com células vizinhas, com poucas filopódios oposição interagindo. As lacunas foram frequentemente observadas em redor da periferia das células (tal como demonstrado na Figura 6D), em contraste com os selos apertados que foram observadas durante a análise de células PNT2. A morfologia das células PC-3 observados neste estudo utilizando SNOM confirma observações anteriores feitas por Lang

et al.

[24] usando microscopia de contraste de fase e microscopia eletrônica de varredura.

Quando imagem com SNOM , estabelecer comparações quantitativas de níveis de expressão com base no número de contagens registradas torna-se difícil quando as diferentes sondas SNOM têm sido utilizados. No entanto, utilizando a relação sinal-ruído em vez das contagens absolutas ajuda a explicar as diferenças que possam surgir com uma mudança de sonda SNOM. Foi realizada a análise subsequente da localização sub-celular das proteínas de E-caderina e ZO-1 em células PC-3. aquisições de fluorescência SNOM revelou a presença de ZO-1 na periferia das protuberâncias celulares para além de ser observada na região nuclear. Embora não seja o foco principal deste estudo, esta observação confirma as conclusões de outros relatórios onde deslocalização da ZO-1 é visto [21].

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