PLOS ONE: Câncer de expressão celular do Autotaxina controla a formação metástase óssea no rato através lisofosfatídico Activation Acid-Dependente de Osteoclasts

metástases

Abstract

Fundo

ósseas são complicações muito freqüentes de câncer de mama. Atuais tratamentos metástase óssea usando agentes anti-resorbtive poderosos são apenas paliativos, indicando que fatores independentes do controle da reabsorção óssea progressão metástase óssea. Autotaxina (ATX /NPP2) é uma proteína segregada com ambas as propriedades oncogénicas e pró-metastáticos. Através da sua actividade lysosphospholipase D (lysoPLD), ATX controla o nível de ácido lisofosfat�ico (LPA) no sangue. Derivado de plaquetas LPA promove a progressão de metástases ósseas osteolíticas de células de cancro da mama. Perguntamos se ATX foi envolvido no processo de metástase óssea. Nós caracterizado o papel do ATX na formação de metástases ósseas osteolíticas usando células de câncer de mama geneticamente modificados explorados em diferentes modelos de ratos metástases ósseas osteolíticas.

Metodologia /Principais Achados

A injecção intravenosa de cancro da mama humano MDA -B02 células com expressão forçada de ATX (MDA-B02 /ATX) para inmmunodeficiency BALB /C

nu

ratinhos aumentada formação de metástases de osso osteolíticas, tal como avaliado por um aumento da perda de massa óssea, a carga tumoral, e um maior número de activa osteoclastos no local metastático. células de cancro da mama do rato 4T1 induzida a formação de metástases ósseas osteolíticas após a injecção intracardíaca em ratinhos imunocompetentes BALB /C. Estas células expressaram ATX activo e silenciar a expressão ATX inibiu a extensão das lesões ósseas osteolíticas e diminuiu o número de osteoclastos activos no local do osso metastático.

In vitro

, a diferenciação dos osteoclastos foi reforçada na presença de meios condicionados de células MDA-B02 /ATX ou autotaxina recombinante que foi bloqueado pela vpc8a202 inibidor autotaxina.

In vitro

, adição de LPA para soro tratado com carvão vegetal activo restaurou a capacidade do soro para suportar RANK-L /osteoclastog�ese induzida MCSF.

Conclusão /Significância

expressão de autotaxina por células cancerosas controla formação de metástases osteolíticas do osso. Este trabalho demonstra um novo papel para LPA como um fator que estimula diretamente o crescimento do câncer e metástase, e diferenciação de osteoclastos. Portanto, visando o autotaxina /faixa LPA surge como uma potencial nova abordagem terapêutica para melhorar os resultados dos pacientes com metástases ósseas

Citation:. David M, Wannecq E, Descotes F, Jansen S, Deux B, Ribeiro J , et ai. (2010) Cancer de expressão celular do Autotaxina controla a formação metástase óssea no rato através da ativação lisofosfatídico Acid-Dependente dos osteoclastos. PLoS ONE 5 (3): e9741. doi: 10.1371 /journal.pone.0009741

editor: Erik Danen, Leiden /Center Amsterdam para Drug Research, Universidade de Leiden, Holanda The Sims

Recebido: 14 Janeiro, 2010; Aceito: 26 de fevereiro de 2010; Publicação: 17 de março de 2010

Direitos de autor: © 2010 David et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do INSERM (OP e PC), o Comité départemental de la Loire de la Ligue Nationale contre le Cancer (OP), o Instituto Nacional Francês de Câncer, INCA (OP, contrato 0610-3D1616-102 /PL 2006 ) e da Associação Francês pour la Recherche sur le Câncer, ARC (OP). M.D. era um receptor da bolsa da Ligue Nationale contre le Cancer. J. S. detém uma bolsa de pós-doutorado da Fundação de Pesquisa – Flandres (FWO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O osso é um local metastático comum para muitos tipos de câncer [1]. As metástases ósseas são associados com hipocalcemia devido à destruição óssea, dor óssea intratáveis ​​e fraturas patológicas. As células tumorais presentes no local do osso metastático estimulam a reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos, e factores de crescimento derivados de osso libertados de osso reabsorvido promover o crescimento do tumor, levando ao desenvolvimento de um ciclo vicioso. [2]. Infelizmente, os tratamentos atuais usando agentes anti-reabsorção poderosos (bisfosfonatos) deixar de fornecer o benefício de prolongamento da vida para pacientes com metástases ósseas levantando a necessidade de um melhor conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nesta patologia [3]. Encontraram-se recentemente que o ácido lisofosfatídico (LPA) derivada a partir de plaquetas de sangue actua localmente sobre células tumorais para promover a progressão de metástases ósseas [4]. Entre os receptores específicos da superfície celular para LPA (LPA

1-6) expressa por células tumorais, demonstramos que LPA

1 atividade prevaleceu durante a progressão da metástase óssea e que a segmentação deste receptor foi uma nova estratégia terapêutica contra metástases ósseas [ ,,,0],5]. No entanto, como LPA é gerado no local do tumor e como LPA produzido pelas células tumorais, pode-se contribuir para a progressão de metástases ósseas são ainda desconhecidos.

Autotaxina (ATX, NPP2) pertence à fosfodiesterase de nucleótidos pirofosfato (NPP ) da família [6]. Além da actividade de fosfodiesterase conservada (PDE) entre todas as centrais nucleares, autotaxina tem uma actividade única lisofosfolipase D (lysoPLD), permitindo a geração de LPA de lisofosfatidilcolina (LPC) [7]. O significado biológico da actividade de PDE e lysoPLD em funções autotaxina permanece a ser determinada. No entanto, a relevância funcional da actividade catalítica de autotaxina

In vivo

foi recentemente demonstrada a partir de estudos que mostram que ratos knockout autotaxina é responsável pelos níveis de AFL na circulação sanguínea [8], [9]. A ligação entre o aumento da actividade lysoPLD e a formação de LPA foi encontrado em várias patologias tais como artrite reumatóide [10], dor neuropica [11], a hepatite C crónica [12] e adipócitos insulina-resistência na obesidade [13]. Autotaxina é uma glicoproteína inicialmente identificado como um factor de motilidade autócrino segregado por células de melanoma humano [14], [15]. A expressão aumentada de autotaxina foi mostrado para correlacionar com o aumento da capacidade de invasão de células de cancro da mama [16] e verificou-se aumentar o potencial metastático de transformadas com Ras 3T3 de fibroblastos [17]. Expressão de ARNm de autotaxina foi detectada a um nível basal em quase todos os tecidos humanos [18]. Curiosamente, a regulação positiva do gene de autotaxina foi relatada em uma grande variedade de cancros, tais como o glioblastoma [19], neuroblastoma agressivo [20], o cancro do pulmão de pequenas células não [21], melanoma uveal associados com prognóstico pobre [22], carcinoma da tiróide [23 ], carcinoma hepatocelular com metástases [24], e câncer de mama [16]. MMTV-

ATX

ratinhos transgénicos com expressão aumentada especificamente de autotaxina na glândula mamária mostraram um aumento da incidência de tumores mamários espontâneos ao longo de um período de dois anos, que ilustra a função pró-oncogénica de autotaxina [25].

Aqui, nós fornecemos evidência experimental que as células de cancro da mama que expressam autotaxina têm uma vantagem selectiva para induzir a formação de metástases ósseas osteolíticas como um resultado de uma função pró-osteoclástica romance de produto derivado de autotaxina LPA. Estes resultados ilustram o papel de autotaxina em cancros da mama avançados e sugerem que a segmentação do autotaxina faixa /LPA pode trazer benefícios adicionais para os pacientes que sofrem de metástases ósseas.

Resultados

De novo

autotaxina expressão aumenta a proliferação e invasão de células de cancro da mama MDA-B02 humanos

in vitro

Nós temos mostrado previamente que as células MDA-B02 não expressam autotaxina no estado estacionário [4]. Para avaliar se ou não autotaxina desempenha um papel na disseminação de metástase das células tumorais da mama, nós introduzimos o cDNA de autotaxina rato em células MDA-B02. Utilizou-se o sistema de expressão de tet-regulado-off em que autotaxina expressão, juntamente com a luciferase é alcançada especificamente na ausência do repressor, doxiciclina [4]. Como um membro único da família NPP, autotaxina exposições tanto lysoPLD e atividades fosfodiesterase [26], [27]. Portanto, como uma linha celular de controlo que transfectadas células MDA-B02 com um vector de expressão de codificação para o rato NPP1, que actua como uma fosfodiesterase de nucleótidos, mas que carece de actividade para o lysoPLD.

Para cada construção, foram selecionados dois estáveis Os clones: clone de MDA-B02-ATX não. 30 e n. 38, e MDA-B02-NPP1 clones não. 10,5 e não. 42. A expressão de autotaxina como uma proteína secretada e NPP1 como uma proteína ligada à membrana foi confirmada por transferência Western usando anticorpos específicos (Figura 1A). Clone selecções foram baseadas em alta a expressão de luciferase na ausência de doxiciclina (Figura 1B). Como esperado, observou-se que na ausência de doxiciclina apenas os clones MDA-B02-ATX adquirido uma actividade lysoPLD (Figura 1B), enquanto que ambos os clones de células MDA-B02-ATX e MDA-B02-NPP1 tiveram um aumento da actividade de PDE, em comparação com . células parentais (Figura 1B)

(a) células transfectadas com expressão bidirecional vetores PBIL-ATX ou PBIL-NPP1 foram semeadas com (+) ou sem (-) doxiciclina (Dox). Proteínas a partir de meios condicionados (CM) ou lisados ​​de células tumorais (CL) de dois clones estáveis ​​(n. 30 e n. 38 a ATX, não. 10.5 e no. 42 a NPP1) foram electrophorezed então imunotransferidas com um anticorpo anti-ATX (painel esquerdo) ou anticorpo anti-Myc (painel direito). (B) quantificações de atividade luciferase (painel esquerdo), atividade lysoPLD (painel do meio) ea actividade PDE (painel direito) em cada clone e células MDA-B02 parentais. (C) A proliferação celular foi estimulada com LPC (10 uM) na ausência ou presença Ki16425 (10 uM). Os resultados são expressos como a% de incorporação de BrdU em comparação com as células parentais MDA-B02 não estimuladas. Os dados correspondem à média ± SD de 6 réplicas e são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. (D) invasão celular foi estimulada com FBS a 10% usado como quimioatractor. Os resultados são a média ± DP de 3 replicados de células e são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. Os dados são expressos como o número de células /mm

2. *,

P Art 0,05. **,

P Art 0,01

Nós temos mostrado previamente que o tratamento com LPA aumenta a proliferação de células MDA-B02 [4]. Aqui, observa-se que, na ausência de doxiciclina, LPC tinha uma actividade mitogénica pelo próprio em ambos as células MDA-B02 parentais e de clones transfectados (Figura 1C). Este resultados podem reflectir os receptores expressão LPC (GPR4, TDAG8) em células MDA-B02, bem como em tumores da mama [28]. No entanto, a proliferação dependente de LPC foi ainda aumentada em células MDA-B02-ATX, mas não em células MDA-B02-NPP1 ou células parentais. Além disso, o tratamento de células com Ki16425, um antagonista de LPA

1 e LPA

3 receptores, bloqueou totalmente dependente de autotaxina mas a proliferação de células não LPC-dependente (Figura 1C). Isto indicou que ATX recombinante expressa por células MDA-B02-ATX produzidos LPA activo que estimularam a proliferação de células através de um

1-3 via dependente de receptores do LPA.

Autotaxina tem sido implicada na invasão de ras- fibroblastos transformadas e células de cancro da mama [16], [17]. Observou-se que, na ausência de doxiciclina, os clones de células MDA-B02-ATX tinha uma capacidade significativamente maior de invadir o Matrigel ™ em resposta a FBS do que na presença de doxiciclina (Figura 1D). Também foi observada a ganho de invasividade de clones de células MDA-B02-ATX quando comparado com as células parentais e clones MDA-B02-NPP1, colocados quer na ausência ou na presença de doxiciclina. Estes resultados confirmaram que autotaxina aumentou o potencial invasivo de células de cancro da mama por um mecanismo que exigia a sua actividade lysoPLD.

De novo

autotaxina expressão aumenta

in vivo

MDA-B02 formação de metástases ósseas

Temos anteriormente demonstrado que o LPA proveniente de plaquetas suporta a progressão de metástases ósseas mediadas por células MDA-B02 em ratinhos [4]. Trabalhamos com a hipótese de que a atividade lysoPLD derivadas de células tumorais elevada pode também promover a metástase óssea. Trinta e dois dias após a inoculação intravenosa de células tumorais em

ratinhos nus

, análises radiográficas revelou que animais portadores de clones de células MDA-B02-ATX exibiram um aumento de 40% para 70% na extensão das lesões osteolíticas, em comparação com que a observada com clones de células MDA-B02-NPP1 e células parentais (Figura 2A). exames histológicos e histomorfométrica confirmou as observações radiográficas e mostrou que

de novo

expressão de autotaxina por células de cancro da mama resultou em uma redução de volume ósseo (BV /TV) e aumento da carga tumoral esquelético (Figura 2A). Não se observou diferença nas pernas de animais portadores de clones de metastáticos MDA-B02-NPP1 comparação com as células parentais MDA-B02 a nível histológico (Figura 2B). Nós mostramos anteriormente que o LPA estimula a potência de células tumorais para aumentar o recrutamento de osteoclastos no sítio ósseo metastático [4]. Aqui, observa-se que a superfície dos osteoclastos activos por área óssea trabecular, localizada na interface celular óssea /tumoral foi aumentada em animais portadores de clones de células MDA-B02-ATX, como comparação com a observada em ratinhos com células de tumor progenitoras ou NPP1-expressam ( Figura 3).

(A) (painéis à esquerda) radiografias representativos de membros posteriores de ratos metastáticos rolamento células MDA-B02 ou clone MDA-B02-ATX não. 30 ou MDA-B02-NPP1 clonar não. 42, 29 dias após inoculação das células tumorais. lesões osteolíticas estão indicados por setas (barra de escala: 0.5 cm). (Painel direito) Quantificação de áreas de lesão osteolítica em radiografias em animais metastáticos. Os dados correspondem à média ± DP de duas experiências independentes de 7 a 10 animais por grupo. (B) (painéis à esquerda) histologia óssea Representante da metáfise tibial manchado de tricromo de Goldner de animais metastáticos. O osso é manchado em azul; células da medula óssea e tumorais estão manchadas de vermelho. (Barra de escala: 1 mm). (Painel direito) Análise histomorfométrica de membros posteriores metastáticos usando a ração de volume ósseo /tecido de volume (BV /TV, barras pretas e eixo esquerdo) e a relação de volume do volume tumoral /tecido (TumV /TV, bares abertos e eixo direito), como referentes. Os valores são a média ± DP de 7-10 animais por grupo representativo de duas experiências independentes. *,

P

. 0,05

(Superior esquerdo painéis) exame imuno Representante seções tíbia proximal de animais metastáticos 29 dias após a inoculação de células tumorais, utilizando o anticorpo anti-ATX 4F1. T indica células tumorais. (Inferior esquerdo painéis) exame histológico Representante seções tíbia proximal manchado armadilha de animais metastáticos. T indica células tumorais. O osso é manchado em azul escuro e osteoclats estão manchadas em vermelho (setas). (Painel direito) Quantificação da superfície reabsorção activa-osteoclastos por superfície de osso trabecular (Oc.S /BS). Os resultados são a média ± SE de 8-9 animais por grupo. *:

P Art 0,05. Barras de escala:.. 200 um

No total, nossos resultados indicam que a expressão aumentada de autotaxina por células MDA-B02 reforçada a formação de metástases ósseas osteolíticas

regulação negativa da expressão autotaxina inibe a invasão mas não a proliferação de rato 4T1 células de cancro da mama

Para abordar o papel de autotaxina na formação de metástases de osso em um contexto imunocompetente, que exploraram a linha de células 4T1 que é derivado a partir de um único tumor mamário de ratinho e recapitula as etapas distintas de metástase quando enxertados na glândula mamária de ratos singénicos BALB mulher /C [29]. Em primeiro lugar, verificou-se que 4T1 células expressaram o mRNA de todas as formas de receptores de LPA e responderam à estimulação LPA (Figura 4A e 4B). Além disso, verificou-se que as células 4T1 expressa a transcrição autotaxina e proteína (Figura 4A e 4C), representando a secreção de uma proteína enzimaticamente activa autotaxina (Figura 4C). Para analisar a função de expressão endógena de autotaxina por células de câncer de mama na formação de metástases ósseas foi utilizado o método de interferência de RNA para estabelecer uma série de três clones de 4T1 células com expressão autotaxina forma estável regulada para baixo (4T1-siATX), juntamente com três de controle Os clones 4T1 com expressão inalterada de autotaxina (4T1-sbATX) (Figura 4C). Seguinte caracterização individual de cada clone para os níveis de expressão de proteínas e atividades lysoPLD, posterior

in vitro

e

In vivo

experimentos foram realizados utilizando conjuntos dos três clones para o 4T1-siATX e as linhas de células 4T1-sbATX, respectivamente.

(a) produtos de amplificação RT-PCR para receptores de LPA, LPA

1 (1), LPA

2 (2), LPA

3 (3), o LPA

4 (4), o LPA

5 (5), GPR87, P2Y5, e autotaxina (ATX) a partir de células 4T1 ARNs totais foram analisados ​​num gel de agarose a 2%. MW, marcador de peso molecular. invasão (B) celular foi estimulado com o aumento das concentrações de LPA utilizados como quimioatractor. Os resultados são a média ± DP de 3 replicados de células e são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. Os dados são expressos como o número de células /mm

2. (C) Autotaxina expressão em 3 clones de 4T1 culas transfectadas com um vector que codifica pStrike para irrelevantes pequena hairpin RNAi (sbATX, os clones não. 14, n. 16, no. 20) ou específico pequeno hairpin RNAi (siATX, os clones não. 1, n. 17, n. 52). (Painel superior) de imunotransferência utilizando anticorpos policlonais anti-ATX ou anti-? Tubulina como controlo de carga. (Painel inferior) actividade lysoPLD (LPA pmol /ml) medido em meios de cultura de células condicionado. (D) A proliferação celular avaliada pela BrdU incorporação de 4T1 células e uma piscina de três clones 4T1-sbATX (no. 14, n. 16, n. 20) ou três clones 4T1-siATX (no. 1, no. 17, não . 52), em resposta ao aumento das concentrações de LPC. Os resultados são expressos em média ± SD de 6 réplicas e são representativos de três experiências separa. ensaio (E) Invasion. As células foram colocadas em presença ou ausência de LPA (0,1-1 uM) na câmara superior e FBS, utilizado como quimioatractor, foi colocada na câmara inferior. Os resultados são a média ± DP de 3 replicados e são representativos de pelo menos 3 experiências independentes. Os dados são expressos como o número de células /mm

2. *,

P

. 0,05

Tal como observado anteriormente para as células MDA-B02

in vitro

(Figura 1C), LPC exibiu uma ação mitogênica em 4T1 células (Figura 4D). No entanto, o silenciamento de expressão autotaxina não alterou a proliferação de células 4T1-siATX comparação com a observada para o controlo e as linhas celulares parentais (Figura 4D). Este resultado foi bastante surpreendente e pode ser a consequência da actividade lysoPLD permanecendo em clones 4T1-siATX. Uma explicação alternativa seria que a proliferação de células 4T1 já foi estimulada ao máximo por LPC. Em contraste, usando transpo� câmaras de migração revestidas com Matrigel ™, observou-se que o silenciamento expressão autotaxina inibiu a invasão FBS-driven de células 4T1-siATX (Figura 4E). Esta inibição foi eliminada pela adição de LPA no compartimento da célula das câmaras de migração que demonstram que a invasão de células 4T1 foi controlada por autotaxina através da sua actividade lysoPLD.

A regulação negativa da expressão de autotaxina endógeno em células 4T1 inibe osteolíticas óssea formação de metástases independentemente do crescimento do tumor primário

in vivo

para saber se a expressão endógena de autotaxina em células de câncer de mama foi importante para a formação de metástases ósseas, 4T1-siATX e celulares controle linhas foram injetados para o ventrículo esquerdo do coração de ratinhos fêmea singénicos BALB /C. Esta estratégia permite ignorar os pulmões e para alvejar as células a outros órgãos viscerais e osso. Duas semanas após a inoculação de células, análises radiográficas revelou que animais com células 4T1-siATX tiveram uma diminuição de 50% na extensão das lesões osteolíticas, em comparação com os animais injectados com 4T1-sbATX 4T1 ou células parentais (Figura 5A). As análises histológicas revelaram que a superfície dos osteoclastos activos por área óssea trabecular, localizada na interface celular óssea /tumor foi significativamente diminuída em animais portadores de células 4T1-siATX, em comparação com a observada em ratinhos com células de tumor progenitoras ou 4T1-sbATX (Figura 5B ). Foi anteriormente demonstrado que o LPA produzido no microambiente tumoral por plaquetas [4]. Para analisar o papel da autotaxina endógena em células de cancro da mama

in vivo

independentemente do microambiente ósseo, as linhas celulares de controlo 4T1-siATX e foram inoculadas em gordura-pad de camundongos fêmeas singênicos BALB /C. Após duas semanas, o que correspondeu ao mesmo período de tempo do crescimento do tumor do que a usada para as experiências de metástase óssea, tumores primários foram recolhidos. Observou-se que o silenciamento de expressão autotaxina não alterou o crescimento de tumores primários, uma vez que não houve diferença significativa no tamanho dos tumores 4T1-siATX, em comparação com os de 4T1-sbATX e tumores parentais (Figura 6A).

In situ

imunodetecção do antígeno nuclear Ki-67 nas secções de tumor não mostraram qualquer diferença na proliferação de células de controlo (Figura 6B) 4T1-siATX e. Em conjunto, esses resultados indicam que a expressão endógena de formação de metástases ósseas controlada autotaxina mas não o crescimento de células 4T1

in vivo

.

(A) (painéis à esquerda) radiografias representativos de membros posteriores de BALB /C ratinhos 14 dias após a injeção intracardíaca de 4T1 células parentais ou conjuntos de clones 4T1-sbATX (no. 14, n. 16, n. 20) ou clones 4T1-siATX (no. 1, no. 17, n. 52) . lesões osteolíticas são indicados por setas. (Painel direito) Quantificação de áreas de lesão osteolítica. Os valores são expressos como a% de áreas de lesão em comparação com células 4T1 parentais. Os dados correspondem à média ± DP de duas experiências independentes de 8 a 10 animais por grupo. *,

P Art 0,05. (B) (painéis superior esquerdo) análise imuno-histológica de secções representativas da tíbia proximal a partir de animais metastáticos de 14 dias após a inoculação de células de tumor, utilizando o anticorpo anti-4F1 ATX. T indica células tumorais. (Inferior esquerdo painéis) exame histológico Representante seções tíbia proximal manchado armadilha de animais metastáticos. T indica células tumorais. O osso é manchado em azul escuro e osteoclats estão manchadas em vermelho (setas). (Painel direito) Quantificação da superfície reabsorção activa-osteoclastos por superfície de osso trabecular (Oc.S /BS). Os resultados são a média ± DP de 8-10 animais por grupo. *:

P Art 0,05. Barras de escala: 200 mm

4T1 células parentais, clones 4T1-sbATX e clones 4T1-siATX foram injetadas na glândula mamária de fêmeas singénicos ratos normais BALB /c.. No dia 14, os tumores primários foram ressecados e pesado. parcelas (A) da caixa representam o peso de tumor (em mg). (B) Os tumores primários foram embebidos em parafina. secções de tecido de tumor foram analisados ​​por mmunohistochemistry utilizando um anticorpo específico dirigido contra o antigénio nuclear Ki-67. Calculou-se o índice mitótico (números em cada painel) como a percentagem de núcleos positivos para o Ki-67 (os resultados são a média ± DP, barra de escala: 50 mm). (C) Os animais foram sacrificados 35 dias após a injecção das células tumorais e os pulmões foram recolhidos para quantificar espontaneamente metástase formação de células 4T1. (painéis superiores) fotografias representativas de cortes de tecido do pulmão corado com eosina. (Painel inferior) quantificação de focos de metástases do pulmão. O número de focos metastáticos era enumerada sob o microscópio. P 0,05. T indica focos metastáticos. Barra de escala:. 200 um

A fim de analisar a capacidade de autotaxina endógena para apoiar a formação de metástases espontâneas por 4T1 células

in vivo

, as células foram injetadas na gordura mamária almofada de ratinhos fêmea BALB /C. Os tumores primários foram cultivadas durante duas semanas, altura em que foram ressecados, permitindo o aparecimento de metástases espontâneas. Três semanas após a ressecção dos tumores primários, os animais foram sacrificados. Os pulmões foram recolhidas, fixadas e incluídas em parafina. secções de tecido de pulmão foram examinadas sob um microscópio para a presença de focos metastáticos. Verificou-se que os ratinhos inoculados com células 4T1-siATX tinham um número significativamente menor de metástases do pulmão (redução de 80%) quando comparado com os ratinhos inoculados com células 4T1 parentais (Figura 6c).

No seu conjunto, estes dados indicaram que o expressão de autotaxina endógena controlada a capacidade de células cancerígenas da mama 4T1 para metastizar e para induzir a formação de metástases ósseas osteolíticas independentemente da proliferação celular.

a expressão de ARNm de autotaxina em tumores primários de pacientes com cancros da mama

em seguida, perguntou se os efeitos da expressão autotaxina observado no rato modelos pré-clínicos de câncer de mama pode correlacionar com a doença humana. Analisou-se a expressão do gene que expressa autotaxina (

ENNP2

) por PCR em tempo real quantitativa de uma série de 167 biópsias de tumor da mama a partir de doentes sem (n = 145) ou com (n = 22) metástases identificadas, no tempo de diagnóstico. Observou-se que a expressão de

ENPP2

normalizados para os genes que codificam a proteína de ligação de L32 (L32) ou a caixa TATÁ proteína ribossomal (TBP, dados não mostrados), não foi significativamente alterada em doentes com metástases de osso ou de tecidos moles no momento do diagnóstico, em comparação com pacientes não metastáticos (figura 7). Também encontramos níveis semelhantes de

ENPP2

mRNA em tumores primários de pacientes não-metastáticos que desenvolveram metástases ósseas ou tecidos moles ao longo de um período de cinco anos (Figura 7). Em seguida, foi investigada a expressão de

ENPP2

em relação às características clínicas, patológicas e biológicos, como definido na Tabela 1. Descobrimos que, mesmo se os valores medianos absolutos de

ENPP2

níveis de transcrição foram consistentemente aumentou juntamente com as características dos prognósticos pobres, as diferenças não atingiram significância estatística. Isto indicou que a expressão de

ENPP2

em tumores primários de pacientes de cancro da mama foi independente do tamanho do tumor, grau, nó, receptor de estrogénio (ER) e o estado do receptor de progesterona (PgR) (Tabela 1).

o ARN total foram extraídos a partir de biópsias de tumores primários da mama de pacientes sem ou com metástases no momento do diagnóstico. Macio e osso representam subgrupos de pacientes metastáticos com tecido mole somente e metástases ósseas, respectivamente. W /O Rec representam um subconjunto de pacientes não metastáticos sem recorrência de metástase durante um período de cinco anos. Macio Rec and Bone Rec representam subconjuntos de pacientes com recorrência de metástase para tecidos moles única e para o osso ao longo de um período de cinco anos, respectivamente. n indica o número de pacientes em cada grupo. Expressão de ARNm Enpp2 /ATX foi medida por quantitativo em tempo real por PCR em tempo real. Quantificações foram normalizados para os valores de ARN correspondente L32. Os dados são apresentados como gráficos de caixas com a mediana. A caixa inclui o 25

th a 75

th percentis. A 5

th percentis são exibidos como barras de erro.

LPA controla diretamente osteoclastos diferenciação

Nós mostramos anteriormente que a LPA aumenta a potência das células tumorais para induzir a diferenciação de osteoclastos

in vitro

e seu recrutamento

in vivo

no local metastático ósseo [4].

In vitro

, meios condicionados colhidos a partir de clones de células MDA-B02-ATX aumentou significativamente a diferenciação de osteoclastos maduros a partir de precursores de células de medula óssea, em comparação com meios condicionados preparados a partir de células ou clones parentais MDA-B02-NPP1 (Figura 8A). Além disso, autotaxina recombinante aumentou significativamente M-CSF /RANK-induzida por L diferenciação dos osteoclastos

in vitro

(Figura 8B). Para determinar se o efeito de autotaxina foi devido à sua actividade lysoPLD, foi utilizado um análogo substituído-β de LPA (vpc8a202) descrito como um inibidor específico [30]. Observou-se que inibiu o aumento vpc8a202 osteoclastog�ese dependente de autotaxina a partir de células de medula óssea tratados com M-CSF e G-RANK (Figura 8B). Nós mostramos anteriormente que controla LPA-cancro de células de indução de osteoclastogénese indirectamente da mama através da secreção de citoquinas pró-osteoclástica, IL-6 e IL-8, por células [4] tumorais. Soro é necessário para a diferenciação de osteoclastos em cheio sobre precursores estimulação osteoclastos com M-CSF /RANK-L

in vitro

[31]. O soro contém quantidades elevadas de ambos LPA e LPC [32]. Por conseguinte, os nossos resultados sugerem que o LPA gerado por autotaxina na presença de soro pode controlar directamente a diferenciação de osteoclastos. Para testar esta hipótese, soro fetal de bovino tratado com carvão activado a fim de remover todas as fracções lipídicas. Observou-se que o soro empobrecido-lipídico não foi capaz de suportar osteoclastog�ese induzida por M-CSF /RANK-L (Figura 8C). Este efeito inibidor de soro empobrecido em lípidos foi resgatada pela adição de LPA purificada nos meios de cultura (Figura 8C). Este resultado indicou que o LPA foi necessário para soro /M-CSF /RANK-L induzida osteoclastogénese.

células de medula óssea (A) foram cultivadas na presença de FBS (10%), M-CSF de rato, rank L e células MDA-B02 ou MDA-B02-ATX clone # 30 ou MDA-B02-NPP1 # 10.5 meios condicionados clone. (B) células de medula óssea foram cultivadas na presença de FBS (10%), M-CSF de rato, RANK-L e ATX recombinante, na ausência (-) ou presença de concentrações crescentes de inibidor de ATX, vpc8a202. (C) Células da medula óssea foram cultivadas na presença de rato M-CSF, G-RANK e FBS (Controlo) ou com depleção de lípido de FBS (Dep. De FBS) na ausência ou presença de 1-oleoil-LPA (1 uM). (painéis à esquerda) Imagens representativas de células multinucleadas coradas para a actividade armadilha. (Painéis da direita) Quantificação do número de osteoclastos foi baseada na multinucleação de células TRAP-positivas. Os resultados são a média ± desvio padrão de 3 experiências separadas. *:

P Art 0,05. Barras de escala: 200 mm

Discussão

Neste estudo, demonstraram que a expressão de autotaxina controlada a progressão das metástases ósseas osteolíticas induzida por células de cancro da mama.. Nós mostramos anteriormente que o ácido lisofosfat�ico (LPA) produzido no microambiente do tumor controla a progressão das metástases ósseas osteolíticas de células de cancro da mama e destacou o importante papel das plaquetas sanguíneas neste processo [4]. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos na produção de LPA e o papel directo de LPA em células de osso no sítio do osso metastático ainda são desconhecidos. análises animais knockout autotaxina revelou que controla os níveis de AFL na circulação sanguínea [8], [9]. A expressão forçada de autotaxina humana em células de cancro da mama MDA-B02 aumentou a formação de metástases ósseas osteolíticas em ratos, enquanto que a expressão do knockdown de autotaxina endógena no tumor mamário de rato 4T1 células diminuiu a extensão das lesões osteolíticas. Sabe-se há duas décadas que as plaquetas são uma fonte abundante de LPA no soro [33], [34]. No entanto, o grupo de Aoki demonstrou que LPA liberado diretamente pelas plaquetas representa apenas uma pequena parte da LPA soro [32]. Derivado de plaquetas LPA é produzido principalmente através da ação de plasma lisofosfolipase D (por exemplo autotaxina) sobre precursores LPA (LPC, lisofosfatidiletanolamina e lisofosfatidilserina) liberados por plaquetas activadas [32].

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