Abstract

A nova geração de drogas anti-câncer alvo subjacente eventos excitador genéticas somáticas resultaram em taxas de resposta de alta-agente único ou single-via em pacientes selecionados, mas alguns pacientes a alcançar respostas completas e uma considerável fracção de doentes com recaída dentro de um ano. Assim, existe uma necessidade premente para a identificação de combinações de agentes específicas que induzem respostas mais completas e prevenir a progressão da doença. Descrevem-se os resultados de uma tela de combinação de uma escala sem precedentes em células de mamífero realizadas utilizando um conjunto de agentes alvo, clinicamente tratável através de um grande painel de linhas celulares de melanoma. Achamos que mesmo os pares de drogas mais sinérgicas são eficazes apenas em um número discreto de linhas celulares, subjacente uma forte dependência contexto de sinergia, com, sinergias generalizadas fortes, muitas vezes correspondentes a efeitos não-específicos ou fora do alvo de drogas, tais como proteína de resistência a múltiplas drogas 1 (MDR1) inibição do transportador. Foram identificados drogas sensibilizantes linhas de células que são BRAF

V600E mutante mas intrinsecamente resistentes a PLX4720 inibidor de BRAF, incluindo o endotélio vascular /receptor do domínio de inserção do receptor de factor de crescimento de quinase (VEGFR /KDR) e o receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) inibidor da família cediranib. A combinação de cediranib e PLX4720 apoptose induzida

In vitro

e a regressão do tumor em modelos animais. Esta interacção sinérgica é provavelmente devido ao envolvimento de múltiplos receptores tirosina-quinase (RTKs), demonstrando o potencial da droga, em vez de abordagens de descoberta de combinação específica de gene. Pacientes com elevada biópsia expressão KDR mostrou diminuição da sobrevida livre de progressão em ensaios de proteína quinase ativada por mitógeno inibidores da via (MAPK) quinase. Assim, high-throughput screening imparcial de combinações de drogas-alvo, com a seleção de biblioteca apropriada e mecanicista follow-up, pode produzir combinações de medicamentos clinicamente acionáveis ​​

Citation:. Friedman AA, Amzallag A, Pruteanu-Malinici I, Baniya S, Cooper ZA, Piris A, et al. (2015) Paisagem da Targeted Anti-Cancer da droga Sinergias em Melanoma Identifica uma nova combinação BRAF-VEGFR /PDGFR tratamento. PLoS ONE 10 (10): e0140310. doi: 10.1371 /journal.pone.0140310

editor: Suzie Chen, da Universidade Rutgers, Estados Unidos

Recebido: 22 de Agosto de 2015; Aceito: 24 de setembro de 2015; Publicação: 13 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Friedman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (P01CA163222 e R21CA175907 para DEF; 1K08CA160692-01A1 e U54CA163125 a mandíbula, 1U54HG006097-01 a CHB), a Fundação Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson de Investigação médica (DEF), a Fundação Doris Duke Medical (DEF), uma subvenção de Elsa U. Pardee Foundation (DEF), um Prêmio de Pesquisa e Educação Fred Lovejoy residente (AAF), um Brigham Departamento e da Mulher Hospital de Dermatologia NIH Training Grant T32AR007098-38 (AAF) e subsídios do Wellcome Trust (086.357 e 102.696; CHB, DAH)

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes .

Introdução

Embora as taxas de resposta dentro de subpopulações geneticamente selecionados de pacientes com câncer de tumores sólidos pode ser elevado, como 60-80% entre os

BRAF

V600E

pacientes com melanoma mutantes que receberam o vemurafenib inibidor BRAF [1], alguns pacientes a alcançar respostas completas por agente único. Assim, um número significativo de pacientes tem resistência intrínseca a inibição da via de MAPK. Mesmo entre os pacientes que não respondem, a maioria vai desenvolver a resistência adquirida dentro de um ano, muitas vezes devido a mutações adicionais ou vias de desvio [2, 3]. Recentemente, vários grupos descobriram mecanismos de resistência adquirida à terapia alvo-BRAF, geralmente em linhas de células inicialmente sensíveis, tais como A375 [4-7], apontando para a complexidade da identificação de estratégia terapêutica salvamento e poucos estudos têm abordado

de novo

resistência ao vemurafenib no contexto BRAF

V600E [8]. combinações de medicamentos têm o potencial para tratar

de novo

e resistência adquirida, mas prevendo atividade combinação de fármacos de agentes únicos que ainda não é possível em parte porque existem apenas relativamente pequenos conjuntos de dados de combinação. descoberta baseada candidato da droga metas de combinação, tais como tumores de sequenciamento para mutações adicionais motorista somáticas [8] ou imparciais telas de RNAi ou cDNA pode render metas acionáveis. No entanto, estas abordagens podem perder potenciais interações de alta ordem com inibidores de segmentação várias proteínas e sua relevância clínica pode depender de esforços de descoberta de drogas longas em torno novos alvos. Além disso, com base na forte dependência contexto visto para a atividade de agente único, espera-se que a atividade e sinergismo ‘combinações também será contexto específico. No entanto, não é ainda claro se combinações de agentes direcionados poderia ser eficaz numa vasta gama de subtipos de tumor, tornando-as aplicáveis ​​a mais pacientes do que o seu único componente de agente ou se a resistência tem de ser resolvida por um grande número de combinações específicas de contexto endereçamento pequenos grupos de pacientes do que os agentes únicos constituintes. Vários grupos começaram a identificar interações de droga-droga de uma maneira imparcial nas células cancerosas [9, 10], que produziram insights importantes. Temos anteriormente descrito triagem de drogas de agente único massivamente escalados através de um grande painel de linhas celulares de cancro genotipicamente definidos [11]. Para compreender o panorama global e potencial de interação medicamentosa escalado triagem através de linhas celulares de cancro como uma fase inicial de uma combinação Cancer Cell-line (C

3) do projeto, nós analisamos uma grande coleção de linhas de células de melanoma em toda a vários milhares combinações de inibidores específicos. Melanoma foi selecionado em função da existência de um grande número de linhas de células que abrigam um oncogene comum mutado (BRAF

V600E) e uma terapia-alvo validado.

Resultados

combinação sistemática sinergia de drogas descoberta

Para obter insights sobre a paisagem de combinações sinérgicas clinicamente relevantes agentes direcionados no cancro, montamos uma biblioteca de 108 compostos. Uma vez que estávamos interessados ​​em encontrar combinações de medicamentos com potencial para a tradução clínica e para o qual mecanismo de ação seria tratável, foram selecionados medicamentos oncológicos bem caracterizados aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) ou em ensaios clínicos em atraso; dois terços destes agentes foram em uso clínico (figura 1A e S1 Tabela). Nós, então, selecionou os inibidores de transdução de sinal mais promissoras em desenvolvimento clínico e aqueles que forneceram uma grande diversidade de alvos moleculares para cobrir amplamente câncer vias de sinalização; Esta categoria constitui a grande maioria da nossa biblioteca, em 67/108 drogas. Nós complementado com estes medicamentos destinados reguladores do ciclo celular, moduladores de receptores hormonais, epigenética nucleares, e outros mecanismos novos sob intensa investigação pré-clínica. Finalmente, foi incluído um número limitado de fármacos representativos dos principais quimioterapias citotóxicas tradicionais. Este painel de drogas expande substancialmente para além de um ecrã de combinação relatou recentemente no melanoma utilizando 40 medicamentos [10]. Um painel de 36 linhas de células de melanoma foi selecionado representando as principais classes genotípicas (S2 mesa) e incluiu seis novas culturas derivadas de pacientes de curto prazo de melanoma ( 10 passagens de biópsia). Das 30 linhas de células estabelecidas anteriormente 19 foram caracterizadas ao nível genómico em maior detalhe (Tabela S2). Em geral, este ecrã aborda um número muito maior de combinações de drogas e linhas celulares do que anteriormente relatado [9, 10, 12]. Dadas as restrições práticas de triagem de um grande número de combinações através de matrizes dose completa de combinações, foram selecionadas duas combinações de dose de razão fixa. Foi realizada uma tela de run-in em dez linhas celulares para escolher doses que resultaram em 70% de viabilidade para capturar os eventos letais sintéticos (dados não mostrados). Nós, então, construiu uma biblioteca de todos os 5.778 combinações correspondentes a todas as possíveis combinações de duas drogas em todo os 108 medicamentos e drogas individuais. Foram triados em 1536 bem-formato-ultra-elevado rendimento utilizando-alto teor e de leitura automático com base em análise de imagem da contagem de células através de coloração nuclear (Fig 1B). Além disso a contagem de células por mancha nuclear, também mapeada sistematicamente os efeitos da combinação de drogas em morte celular utilizando simultaneamente anticorpos contra PARP clivada e normalizando a contagem total de nuclear para se obter uma pontuação de morte celular. No total, para todas as combinações de droga em duas concentrações em todas as linhas de células e medindo tanto a contagem celular e a morte celular, foi gerada uma paisagem de 800.000 pontos de dados droga combinatórias (S3 Tabela). Dada a nossa cobertura limitada da matriz dose da droga-droga, foi utilizada a independência métrica Bliss de sinergia para representar os efeitos da combinação inesperados [13-15].

(A) Resumo da fase de desenvolvimento clínico de 108 medicamentos incluídos na painel de combinação de drogas. (B) Exemplo de UHTS brutos gerados dados, demonstrando contagem de células informações recolhidas junto do canal e apoptose dados DAPI de imunofluorescência PARP clivada; controlo positivo de HSP90 inibidor tratamento 17-AAG é mostrado. (C) matriz Resumo dos dados de drogas combinatória, com cada ponto que representa o efeito de uma de 5.778 combinações na concentração do fármaco padrão, como o efeito mediano da combinação de drogas em todas as linhas de células 36 de melanoma na contagem de células em relação (à esquerda) e a pontuação Bliss sinergia calculada para essa combinação (direita). (D) Histograma do número de linhas de células de uma dada combinação de fármacos mostraram sinergia. número máximo de sinergias foram vistos em uma linha celular, indicando muitas sinergias são privados. (E) como em (C), que mostra o efeito mediano da combinação de drogas (a uma concentração padrão) sobre a proporção relativa positiva cPARP (à esquerda) e a sinergia Bliss calculado para esse nível cPARP (à direita). (F) Representação gráfica de combinações de fármacos (pares de medicamento ligada por uma aresta) que mostrou uma significativa inesperadamente alta cPARP ao longo de um nível previsto numa determinada contagem de células. tamanho do nó indica o número de pares de drogas que a droga dada aparece com outros medicamentos na lista “inesperadamente apoptótica”. borda cor indica a concentração par de drogas (standard ou baixa), onde o cPARP elevado foi encontrado; padrão de borda indica se o cPARP elevada foi encontrada no ambiente de baixa contagem de células ou contagem de células normal ( controle de 80%)., com cPARP elevada na definição da viabilidade normais potencialmente representando “lento” cinética de morte para essa combinação

a análise inicial dos valores de sinergia mostrou que um grande número de combinações demonstrado 40% independência Bliss em mais do que uma linha de células, incluindo diversos fármacos com ampla sinergia letalidade e, quando combinado com qualquer outro fármaco através da recolha de linha celular (Figura 1C). No entanto, apenas 0,3% das combinações sinérgicas demonstrou verdadeira letalidade sintética, onde as drogas individuais não teve efeito ( 80% de viabilidade), mas forte viabilidade sinérgica 50%. Assim, a maioria das drogas com interacções sinérgicas mostrar algum efeito mensurável de pelo menos um agente único. Observou-se que algumas drogas células para muitas outras drogas sensibilizados; estas incluíam o bortezomib inibidor de proteassoma, o linfoma de células B pró-apoptótica ABT263 inibidor 2 (BCL2) um membro da família, e a vincristina inibidor de microtúbulos (Fig 1C). Curiosamente, a maioria das combinações de fármacos que mostram uma sinergia mostrou tal sinergia em três ou menos linhas (56%; Fig 1D). Assim, a maioria dos efeitos de combinação de drogas dependem fortemente do contexto celular. Mesmo as combinações que mostram profundas sinergias num subconjunto de linhas celulares não são sinérgicos ou eficaz em outras linhas de células. Curiosamente, isso é verdade mesmo para as combinações que seriam esperados para ser muito amplamente sinérgica porque alvo de dois processos celulares mecanicamente complementares. Por exemplo, a combinação de gemcitabina, um agente causador de dano de ADN, em conjunto com o dano do DNA via de reparação de inibidor de cinase CHK1 AZD-7762, é fortemente sinérgico em apenas um subconjunto (6/36) de linhas de células. Enquanto isto pode ser devido a diferenças na taxa de danos no ADN em todas as linhas celulares, observou-se vários outros casos de sinergias fortes que são vistos apenas em algumas linhas.

Uma série de drogas induzidas aumento da morte celular como medido por cPARP , incluindo ABT263 e a ampla midostaurina inibidor de cinase (Figura 1E). Menos drogas mostra ampla sinergia na indução cPARP em comparação com a contagem de células; uma exceção foi nilutamida, um antagonista do receptor de andrógeno. Em geral, as combinações medicamentosas, reduzindo a contagem de células após 72 horas mostrou também um aumento na percentagem de células positivas para a coloração cPARP (cinética “rápidos”). No entanto, um subconjunto de combinações aumentaram cPARP sem afectar a contagem de células (S1A e S1B figura). Nossa hipótese é que este subconjunto provavelmente representa combinações com cinética de “lento” de indução de morte celular. Nós desenvolvemos um modelo de regressão para essa relação para identificar essas combinações de indução de apoptose discrepantes em cada linha de células. Em geral, 4% combinações mostraram um aumento cPARP excesso em relação ao número de células. Drogas específicas apoptose induzida inesperadamente mais frequentemente neste conjunto de combinações (Fig 1F). Não surpreendentemente, ABT263 induzida alta cPARP amplamente em relação à contagem de células e foi enriquecida em ambos os “rápido” e “lento” combinações de padrões cinéticos. Curiosamente, fingolimod, um agonista parcial de SP1R, um receptor que se pensa ser envolvido no reconhecimento celular por apoptose por células do sistema imunológico, em vez de na regulação autónoma celular de apoptose e bortezomib mostrou um padrão de “fast” de indução de morte. Em contraste, FK866, um inibidor visfatina mostrou um padrão “lento” de indução de apoptose.

sinergia de drogas e off-alvo efeitos

Para priorizar combinações sinérgicas para posterior dissecção mecanicista, primeiro analisados interações medicamentosas com os mais fortes pontuações independência Bliss através do maior número de linhas de células. Várias destas interacções foram previamente descritos na literatura, validando a tela na identificação

fidedigno

interacções sinérgicas. Entre estes incluídos MK1775, um inibidor de WEE-1, e AZD7762, um inibidor de CHK1 2 /(Fig S2A); inibição dupla de ambas as quinases do checkpoint do ciclo celular foram previamente descritos em vários tipos de tumor em cultura de células e

In vivo

[16]. Interacção sinérgica entre os inibidores segmentados e inibição membro da família BCL2 foi previamente descrito [17, 18] e também foi observada uma tal interacção entre doses elevadas de CHIR265, um inibidor da pan-Raf, e ABT263 (Fig S2B). ABT263 também sensibilizados um grande número de linhas de células ( 10) no ecrã primário ao bortezomib e o indole-3-carbinol fitoquímicos. Um particularmente forte interacção sinérgica foi observada entre BI78D3, um inibidor de JNK e TZDZ8, um inibidor GSK3β (Fig S2C). No entanto, não fomos capazes de observar a sinergia por RNAi knockdown de qualquer classe de destino, juntamente com o tratamento medicamentoso (S2D Fig) ou entre uma coleção ampliada de outros compostos de ferramentas JNK e GSK3β (S2E Fig); Além disso, esta sinergia foi visto em toda uma gama de outras células transformadas e não transformadas (S2F FIG), sugerindo que este era um largo, idiossincrática e fora do alvo citotóxico interação sinérgica improvável de ser clinicamente útil, devido à sua actividade contra não transformada células.

Foi selecionado um desses fortes interacções sinérgicas para uma investigação mais aprofundada mecanicista. Observou-se uma forte interacção entre lapatinib, um inibidor da família de EGFR, e vincristina, um inibidor de microtúbulos (Fig 2A). Vincristina é raramente usado em melanoma regimes terapêuticos e membros da família EGFR não são conhecidos por terem um papel condutor em melanomas exceto em resistência adaptável aos inibidores de BRAF [7]. Confirmámos forte sensibilização ~ 10X de algumas, mas não todas, as células de melanoma a vincristina com lapatinib, com um valor Bliss 50% e índice de combinação (IC) de 0,37 [19] (Figura 2B e Figura S3A e S3B), e vários outros inibidores de EGFR um membro da família, incluindo erlotinib (Fig S3C). No entanto, não fomos capazes de sensibilizar células A375 a vincristina seguinte knockdown única ou combinatória de metas lapatinib EGFR e HER2 (S3D Fig). Além disso, a análise do ciclo celular mostraram prisão sinérgico em G

2 /H com a combinação vincristina-lapatinib, como seria esperado com o aumento da dose de vincristina (Figura 2C). Lapatinib e outros inibidores de tirosina-4-anilinoquinazolina-quinase derivada têm sido descritos como inibidores da família P-gp de resistência a múltiplas drogas (MDR) transportadores [20, 21]. O verapamil, um inibidor de MDR1 canónica, resultou numa interacção sinérgico semelhante com vincristina (Fig S3E). Dada a forte sinergia entre vincristina e lapatinib em A375, mas não células WM451Lu, nós investigamos se a expressão diferencial da família MDR podem estar subjacentes a especificidade linha celular da interacção sinérgica. No geral, observou-se uma tendência geral para uma maior sinergia entre vincristina e lapatinib em linhas celulares com maior expressão de mRNA MDR1. (Fig S3F). Porque contexto célula individual pode influenciar a robustez da tendência geral, especificamente em relação a sensível a uma linha de células insensível. Observou-se expressão de 8 vezes de ARNm de MDR1 em células A375 contra células WM451Lu (Figura 2D). Além disso, lapatinib aumento da retenção de um corante de substrato MDR semelhante ao verapamil (Figura 2E). Knockdown de MDR1 por RNAi em células A375 das células sensibilizadas para a inibição do crescimento de células de vincristina (Figura 2F e S3G FIG). A sobre-expressão de MDR1 em células WM451Lu resistência à vincristina induzida numa maneira dependente da lapatinib (Figura 2G e S3H FIG). Assim, apesar da natureza “alvo” de alguns inibidores da quinase, a sua actividade contra membros da família de MDR pode produzir um efeito sinérgico não relacionada com os seus alvos primários. Coerente com isso, observou-se uma sinergia entre vincristina e lapatinib em toda uma gama de outras células de proliferação rápida (S3I FIG). Descobertas similares de interacções sinérgicas promíscuos via biodisponibilidade foram encontrados em telas de combinação de fármacos anti-fúngico de levedura [22]. Um grande número de compostos em toda uma gama de classes estruturais pode exibir inibição MDR, apoiando nossa observação de que vincristina foi sensibilizado por um grande número de outras drogas (Fig 1D).

(A) os resultados do rastreio que mostram os efeitos no ambas as concentrações de vincristina e lapatinib, individualmente, e como uma combinação, que mostra uma forte sinergia entre a maioria das linhas celulares de melanoma, como indicado pelas contagens de sinergia alta Bliss. (B) A confirmação do efeito sinérgico da combinação de lapatinib (5 uM) em A375 (

N

= 19), mas não WM451Lu (

n = 14)

células. As barras de erro representam DP medição de replica. (C) fluxo Representante citometria de dados mostrando lapatinib potencializa G

2 /M deslocamento da população de células A375 consistente com efeito de aumento de vincristina. (D) Log

2 a expressão relativa de um dado transportador de multi-resistência a drogas em células A375 contra WM451Lu, que mostra o aumento da expressão em células A375 MDR1. As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 9). (E) A calceina corantes fluxo experiências que mostram o aumento da intensidade de fluorescência (indicando fluxo diminuiu MDR) na presença de lapatinib ou controlo inibidor MDR verapamil (tanto a 5 uM); quantificação de valores de cinza celulares mostrado à esquerda. As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 4, 200 células por repetição). (F) MDR1 knockdown por siRNA provoca um efeito sinérgico sobre a viabilidade das células na presença de 5 nM de vincristina. As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 7). (G) A sobre-expressão de MDR1 (comparado com o controlo GFP) em WM451Lu diminui a sensibilidade a vincristina, um efeito reversível com 5 uM de lapatinib. As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 4)

/antagonistas PDGFR VEGFR sinergia com BRAF inibidores

Para identificar combinações sinérgicas mais específicos, nós nos concentramos em combinações que possam estudar a resistência intrínseca ao vemurafenib inibidor BRAF. Foram identificados vários

linhas celulares V600E BRAF, incluindo ISTMel1 e RPMI7951, o qual apresentou resistência a PLX4720 mesmo em doses elevadas ( 5 uM, a inibição do crescimento 50%), quando comparados com as linhas sensíveis, tais como UACC62 e SkMel28 (IC

50 500 nM) (Fig 3A). Muitos dos outros 107 droga na nossa biblioteca mostrou interacções sinérgicas com PLX4720 em contextos celulares específicos (S4A FIG). Utilizou-se a análise estatística de abordagem (SAM) microarray [23] para identificar combinações com PLX4720 que foram especificamente sinérgico nas linhas de células resistentes (PLX4720-S4B FIG). Entre estas incluíam o vorinostat inibidor HDAC, recentemente encontrada para sinergia com inibidores de BRAF em algumas linhas celulares de melanoma [24]. Notamos sinergia significativa entre o inibidor cediranib RTK e PLX4720 nestas linhas de células resistentes (Fig 3B), com um IC de 0,35 (Fig S5A), mas não em linhas sensíveis, mesmo a baixas doses de PLX4720. A sinergia foi também observada entre o selumetinib cediranib com inibidor de MEK (AZD6244), e com a combinação tripla de cediranib, PLX4720, e selumetinib, sugerindo uma interacção entre cediranib geral e inibição de sinalização MAPK-driven BRAF (S5B e S5C figura). Os ensaios de crescimento a longo prazo confirmaram uma forte interacção sinérgica (Fig 3C). A combinação de cediranib e PLX4720 apoptose induzida rapidamente em células resistentes, como mostrado por coloração de anexina V e cPARP transferência de Western (Fig 3D). Enquanto único agente de tratamento PLX4720 causada paragem do ciclo celular em linhas celulares sensíveis, não houve efeito significativo da combinação de fármacos no ciclo celular (Fig S5D). Em contraste com os resultados com lapatinib, não encontramos sensibilização de linhas resistentes a PLX4720 com o inibidor de MDR verapamil (Fig S5E).

(A) Efeito da PLX4720 (PLX4720) em células de melanoma no ecrã primário, demonstrando alguns

BRAF

melanomas mutantes exibir resistência intrínseca à inibição BRAF. Resistência (definida como 50% de viabilidade a 5 uM PLX4720) nestas linhas foi confirmada em ensaios secundários (abaixo). (B) cediranib apresentado efeitos sinérgicos com PLX4720 em várias linhas resistentes intrinsecamente no ecrã primário; estes efeitos foram verificados em ensaios de crescimento padrão em telas secundárias (abaixo, com 2¼m cediranib). linhas sensível ao inibidor de BRAF UACC62 e SkMel28 não mostrou nenhuma sinergia em qualquer dose PLX4720, enquanto resistentes linhas ISTMel1 e RPMI7051 mostraram forte sinergia com cediranib (Bliss 30%). As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 3-4). (C) ensaios de crescimento de longo prazo de cristal manchadas de violeta colônia confirmou sinergia permanente entre PLX4720 (PLX) e cediranib (CED) em resistentes linhas ISTMel1 e RPMI7951, mas as linhas não PLX4720 sensíveis UACC62 e SkMel28. (D) Os ensaios de anexina V mostraram que a apoptose induzida cediranib quando combinado com PLX4720 em células ISTMel1 resistentes, quando comparada com sensível UACC62, e tal como foi confirmado por transferência de Western para a PARP clivada (abaixo). As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 3). (E) Western Blot confirmou a expressão de alvos cediranib PDGFRβ, e com níveis variáveis, KDR e PDGFRα em células ISTMel1 e RPMI7951 PLX4720-insensitive, com expressão mais fraca ou ausente em UACC62 sensível PLX4720 e células SkMel28. tratamento de vinte e quatro horas, com PLX4720 moderadamente suprimida KDR e expressão PDGFRβ induzido, um padrão também visto

in vivo

(S9A Fig). (F) Western Blot confirmou a supressão on-alvo de PDGFRα e fosforilação PDGFRβ (este último após imunoprecipitação e blotting para fosfo-tirosina dada baixa abundância). KDR fosforilação estava fraco demais para ser observado por Western rotineiramente na cultura mas foi visto

in vivo

(ver Fig S9A). knockdown (L) RNAi mediada por KDR (esquerda) ou com ARNsi piscinas individuais mostrou sinergia para ~ 30%; sinergia foi proporcional ao KDR knockdown (ver Fig S7A). As barras de erro representam DP de repetições de medição (

n

= 6). À direita, os valores médios Bliss mais de múltiplas repetições mostraram aumento da sinergia com knockdown simultânea de múltiplos alvos cediranib KDR e PDGFRβ, e, mais fracamente, PDGFRα. As barras de erro representam DP repetições de medição (

N

= 5-8).

cediranib é um inibidor potente e selectivo da família PDGFR e VEGFR de tirosina-quinases receptoras, em ensaios clínicos, utilizados principalmente como um agente anti-angiogénese [25]. Enquanto PDGFRα e sobreexpressão β anteriormente tem sido associada com a resistência adquirida vemurafenib [6, 7, 26], esta família não tem sido implicado na resistência vemurafenib primária de células-autónomo. Para melhor compreender o mecanismo da combinação de drogas, foi testada uma lista expandida de inibidores de RTK actualmente em uso clínico ou desenvolvimento. Alguns, mas não todos, os inibidores semelhantes mostraram sinergia com PLX4720, e em algumas mas não todas as linhas resistentes (Fig S6A). Curiosamente, apenas cediranib e Tivozanib, não a inibidores Axitinib mais específico (VEGFR) ou crenolanib (PDGFR), mostrou actividade sinergística consistente e potente com PLX4720 através de uma ampla gama de doses, sugerindo uma actividade inibidora específica destes compostos em um subconjunto de alvos . bancos de dados de expressão de linha de células mostraram expressão de alvos cediranib em linhas de células resistentes (S6B FIG), que confirmou por Western blot (Fig 3E). Em geral, nós também descobrimos que as linhas de células de melanoma expressam níveis mais elevados de KDR que qualquer outra linhagem de uma grande colecção de linhas de células de cancro (Fig S6C), sugerindo um papel de células-autónoma específico para o KDR no desenvolvimento de melanoma. Detectamos supressão no-alvo por cediranib de fosforilação de ambos PDGFRα e PDGFRβ (Figura 3F). Em seguida, temos uma tentativa de recapitular sinergia entre PLX4720 e cediranib por knockdown de seus alvos principais. siRNA knockdown de KDR mostraram uma diminuição no número de células sinérgico quando combinado com um tratamento PLX4720 proporcional à eficiência knockdown; Além disso, knockdown simultânea de múltiplos alvos cediranib incluindo PDGFRα e PDGFRβ maior sinergia com a inibição BRAF (Fig 3G e S7A e S7B Fig). Embora não possamos excluir a possibilidade de que alguma da actividade sinérgica é devida à inibição de outros alvos RTK não incluídos na nossa análise, estes resultados sugerem que a particularmente forte actividade sinérgica de cediranib em combinação com PLX4720 é devido à inibição do KDR e RTK relacionados incluindo PDGFRα e PDGFRβ.

activação ou reactivação das principais vias a jusante de RTKs, tais como proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) e fosfatidilinositol-3-OH-cinase (PI (3) K) -Akt vias anteriormente tem sido implicada na resistência a terapias específicas, incluindo vemurafenib em ambos

in vitro Comprar e estudos clínicos [8, 27-32]. Diferentemente da maioria dos estudos sobre linhas de células resistentes, PLX4720 suprimiu completamente a ativação ERK nas linhas resistentes intrinsecamente; Além disso, a inibição dupla de MAPK via com PLX4720 e selumetinib não mostrou interacção sinérgica (S8A e S8B Fig), e cediranib continuou a mostrar sinergia na combinação tripla com tanto PLX4720 e selumetinib (S5C Fig). Estes resultados sugerem caminhos adicionais para além MAPK estão relacionados com a actividade da cediranib. Cediranib suprimida S6K fosforilação em ambas as linhas resistentes (ISTMel1) sensível (UACC62) e, e a combinação de activação suprimida em linhas resistentes a maioria dos componentes de Akt por matrizes de fosfo-anticorpo pathway S8C (FIG). Para determinar se este era simplesmente um marcador de inibição RTK e /ou sinergia, ou o mecanismo da sinergia observado, foi testado se os inibidores da via PI3K /Akt poderia sinergia com PLX4720. Curiosamente, a inibição Akt mostrou apenas sinergia variável e moderada com PLX4720 apesar da supressão via forte (S8D e S8E Fig). Estes resultados sugerem que a supressão da MAPK ou PI3K a jusante de KDR /PDGFR RTKs apenas parcialmente contribui para a sinergia entre cediranib e PLX4720 e mecanismos de resistência intrínseca terapeuticamente tratáveis ​​estendem para além destas duas vias. Entre potencial via de jusante afectado pela via PI3K /Akt supressão observados com a combinação de drogas, β-catenina é um substrato conhecido de GSK3β, cuja activação pode seguir a fosforilação Ser9 diminuição observada com a combinação. Embora vários moduladores da via β-catenina demonstrou nenhum antagonismo ou sinergia com PLX4720 no nosso ecrã primário (S9A figura), e GSK3β tem uma série de substratos conhecidos [33], esta via pode ser um dos potenciais efectores da combinação de fármacos.

em seguida, testamos se a inibição sinérgica do crescimento de células de melanoma por cediranib e PLX4720 poderia ser recapitulada

in vivo

. Em dois modelos de xenotransplante com as linhas resistentes ISTMel1 e RPMI7951, observou-se uma forte interação entre os inibidores sobre a progressão do tumor (Fig 4A e S9A-S9C FIG). ISTMel1 mostrou sensibilidade inicial moderada a PLX4720, mas cediranib suprimida depois do crescimento de tumores, enquanto em PLX4720; Em contraste, em RPMI7951, a combinação de cediranib vemurafenib e diminuição do crescimento do tumor inicial para além do efeito de qualquer um dos fármacos sozinhos.

(A) ISTMel1 xenoenxertos foram gerados em ratinhos imunodeficientes (

n = 8

por grupo), os quais foram tratados com PLX4720 ou ração de controlo e dada cediranib água ou por sonda oral. xenotransplantes ISTMel1 mostrou uma resposta inicial ao tratamento PLX4720 sozinho após cerca de duas semanas, com alguma resposta adicional, mas não significativa ao tratamento cediranib. Os valores são apresentados como média +/- E.P.M. gamas, com diferenças significativas no tamanho médio do tumor de ambos PLX4720 e PLX4720 e camundongos tratados com cediranib em comparação ao tratamento controle por ANOVA. No entanto, a combinação atrasou significativamente a progressão (definida como 500 mm

3 tamanho) além desta resposta inicial (à direita,

p Art 0,002 entre PLX4720 e PLX4720 + cediranib braços pelo teste de log-rank) . (B) Em contraste com xenotransplantes ISTMel1, xenotransplantes RPMI7951 mostrou uma diferença significativa pelo teste ANOVA na resposta inicial ao PLX4720 contra PLX4720 e tratamento cediranib depois de três semanas, e, à direita, mostrou um atraso prolongado de progressão (definida como tumor 250 mm

3) de tumores completamente PLX4720-resistentes (

p Art 0,0001 entre PLX4720 e PLX4720 e braços cediranib pelo teste de log-rank). As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP As barras de erro representam DP