Abstract

teor de colesterol pode variar distintamente entre normal e câncer células, com níveis elevados em células cancerosas. Aqui, nós investigamos o sequestro de colesterol com metil-β-ciclodextrina (MCD), e poros-formação com o ostreolysin A /B pleurotolysin complexo proteico (OLYA /PlyB) que se liga aos domínios de membrana de colesterol /ricos em esf ingomielina. Foram avaliados os efeitos sobre a viabilidade de T24 invasivo e células de câncer urotelial humanos não invasivos RT4 e células normais urotelial suíno (NPU). teor de colesterol fortemente correlacionada com a transformação cancerosa, como maior nas células cancerosas T24 de alta qualidade invasivos uroteliais, e menor em células NPU. tratamento MCD induzida morte celular proeminente de células T24, enquanto que o tratamento OLYA /PlyB resultou em muito uma redução da viabilidade das células de carcinoma de baixo grau não invasivos RT4. análises de microscopia eletrônica de bioquímica e transmissão revelou que MCD e Olya /PlyB induzir a morte celular por necrose nestas células cancerosas, enquanto que a viabilidade das células NPU não foi significativamente afectada por qualquer tratamento. Concluímos que MCD é mais tóxico para as células cancerosas uroteliais invasivos T24 de alta qualidade, e Olya /PlyB para as células cancerosas uroteliais não invasivas de baixo grau RT4, e nem é tóxico para as células NPU. O colesterol e domínios de membrana de colesterol /rico em esfingomielina em células cancerosas uroteliais, assim, constituir um alvo terapêutico seletivo para eliminação de células cancerosas uroteliais

Citation:. Resnik N, Repnik U, Kreft ME, Sepcic K, Maček P, Turk B, et al. (2015) altamente seletivo actividade anti-cancro do colesterol-Interacting agentes metil-β-ciclodextrina e complexo de proteínas Ostreolysin A /Pleurotolysin B em células de câncer urotelial. PLoS ONE 10 (9): e0137878. doi: 10.1371 /journal.pone.0137878

editor: Marie-Claude Potier, Institut du Cerveau et de la Moelle, França |

Recebido: 02 de dezembro de 2014; Aceito: 24 de agosto de 2015; Publicação: 11 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Resnik et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Agência de Pesquisa esloveno (https://www.arrs.gov.si/en/agencija), as subvenções P3-0108, P1-0207, P1- 0140, e J1-4305. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na maioria das células eucariotas, os conteúdos de colesterol no plasma-membrana representa tanto quanto 90% do colesterol total de células [1,2]. O colesterol é um componente da membrana fundamental, e isso afeta a estrutura da membrana e função, incluindo a fluidez da membrana e atividade da proteína de membrana [3,4,5]. Juntamente com esfingomielina, colesterol acumula-se nos domínios da membrana que são conhecidos como jangadas de membrana. As composições específicas de lípidos e de proteínas de membrana de colesterol estes domínios ricos em esf ingomielina /estão implicados em muitas vias de sinalização importantes associados com o crescimento celular, a migração e a apoptose [6,7].

o metabolismo do colesterol é estritamente regulada, para manter o teor de colesterol apropriado em células saudáveis. Evidências clínicas e experimentais sugerem que as perturbações no metabolismo do colesterol pode ter um papel importante na cancerogenesis e tumor desenvolvimento (revisto em [8,9]). Tais perturbações têm sido demonstrada em vários tumores malignos [10,11,12], e metabolitos de colesterol podem promover ou suprimir cancros [13]. os níveis de colesterol aumentados têm sido observadas em [16] células cancerosas não invasivas [10,14,15] e invasivos, e esses aumentos de colesterol pode modular a dinâmica da membrana-jangada e coordenação relacionadas com a série de várias vias de sinalização em células de câncer [17].

O teor de colesterol das células cancerosas é geralmente aumentado por meio de sobre-regulação de 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG) -COA-redutase, uma enzima reguladora da síntese de colesterol, o que leva à coalescência das jangadas de membrana, e pode estimular as vias cancerígenos [18]. Omega-3 ácidos gordos poliinsaturados suprimir redutase HMG-CoA e têm propriedades anticancerogenic através da indução da necrose celular ou apoptose [19,20]. Outros lípidos anticancerogenic bem conhecidos que interferem com as funções de membrana de jangada através da homeostase do colesterol são os alkylphospholipids, tais como a edelfosina [21]. George e Wu sugeriu que o significado da composição da membrana-jangada e integridade para a viabilidade celular e a proliferação é do tipo de células específico, devido ao ajuste fino das vias de sinalização que podem conduzir à morte celular ou sobrevivência celular [22]. Portanto, os domínios membranares enriquecidas com colesterol são alvos potenciais para agentes que perturbam a jangada, de afectar a proliferação celular e a viabilidade. Os efeitos citotóxicos de tais agentes podem conduzir a, pelo menos, três formas de morte celular: apoptose, morte celular e necrose autophagic, [18,23,24]. depleção de colesterol com metil-β-ciclodextrina (MCD), que sequestra o colesterol no plasma-membrana, torna as células de melanoma sensíveis à apoptose [25] e desencadeia a apoptose em linhas celulares de cancro da mama e da próstata, os quais têm jangadas de membrana abundantes [18].

Em membranas artificiais e biológicos, colesterol /domínios de membrana ricos em esfingomielina pode ser rotulado com o complexo ostreolysin a /pleurotolysin proteína B (Olya /PlyB) ambos muito seletiva e com alta afinidade [26,27]. OLYA PlyB e são produzidos pelo cogumelo

Pleurotus ostreatus

, e eles montam em um complexo de formação de poros, onde cada uma das proteínas tem um papel particular. OLYA serve como o componente de ligação de membrana, e que se liga exclusivamente a domínios de membrana que são enriquecidos em esf ingomielina e esteróis [26,27,28,29]. Esta ligação pode recrutar PlyB à superfície da membrana, conduzindo à formação do poro transmembranar de 13 vezes, em que cada subunidade é composta por uma molécula PlyB posicionado sobre um OLYA dímero ligado à membrana [26,30].

a interacção de OLYA com membranas de colesterol /esf ingomielina é altamente cooperativa com respeito aos níveis de colesterol da membrana acima do limite de 30% mol ~ [28]. Uma vez OLYA é recrutado para estas membranas, e se a concentração de OLYA /PlyB é suficientemente alta, PlyB tem actividade de formação de poros [31]. O pré-tratamento das células com qualquer MCD ou esfingomielinase elimina drasticamente a ligação de Olya [27] (e de Olya /PlyB [3,32]) para as membranas de células diferentes.

Para o melhor do nosso conhecimento, não houve relatos sobre o papel do colesterol da membrana como um alvo potencial para o tratamento de cancro da bexiga. No presente estudo, nós investigamos se as células uroteliais, em diferentes fases de transformação cancerosa, e também as células normais não transformadas urotelial porcino (NPU), diferem nas suas sensibilidades aos agentes interactuantes de colesterol de acordo com as suas diferenças em níveis de colesterol. Para verificar a influência do potencial interespécies variabilidade do conteúdo de colesterol, medimos o teor de colesterol também em linhas de células de rato uroteliais invasivas e não invasivas. Comparou-se a sensibilidade à MCD e Olya /PlyB de células cancerosas uroteliais humanos T24 (como um modelo de carcinoma urotelial invasivo de alto grau), as células cancerosas uroteliais humanos RT4 (como um modelo de carcinoma papilífero não invasivo de baixo grau), e as células NPU, que morfológica e fisiologicamente assemelham urothelium humano normal [33,34,35]. Nós aproveitou o único mecanismo de complexo de proteínas Olya /PlyB para permitir, por um lado, imunomarcação eficiente dos domínios de membrana de colesterol /enriquecido com esfingomielina [3,32,36], e, por outro lado, controlado pore-formação em estes domínios [28,29,32]. Nosso estudo demonstra que estes T24 e células cancerosas uroteliais humana RT4 tem marcadamente maior sensibilidade tanto para o sequestro de colesterol, MCD e pore-formação por Olya /PlyB, em comparação com as células não transformadas NPU. Além disso, esses dados oferecem uma abordagem nova e altamente seletivo para o tratamento de células metastáticas uroteliais risco de vida e as células de câncer de bexiga não invasivos mais frequentes.

Materiais e Métodos

As culturas de células

linhas celulares de cancro O urinária T24 de bexiga humana e RT4 (ATTC, Manassas, VA, EUA) e do rato da bexiga urinária, NUC-1 e células g /g (uma simpática oferta do Prof de Boer, Leiden University Medical Center, The Holanda [37]) foram cultivadas em meio de Eagle modificado avançada por Dulbecco (a-DMEM) /F12 (1: 1), 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U /ml de penicilina, e /ml de estreptomicina (meio de controlo 100 ug para células cancerosas uroteliais) a 37 ° C, numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

culturas secundárias de células NPU do quinto ao décimo segundo passagens foram preparados como descrito previamente [33,38, 39]. As células NPU foram cultivadas em MCDB153 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) /A-DMEM (1: 1), 2,5% de FCS, fosfoetanolamina 0,1 mM (Sigma), 0,5 ug /ml de hidrocortisona, de 5 ug /ml de insulina (Sigma ), Glutamax 4 mM, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (meio de controlo para células uroteliais normais). Os meios de cultura e suplementos foram adquiridos a Invitrogen (Viena, Áustria), salvo indicação em contrário.

metil-β-ciclodextrina e Olya /tratamentos PlyB

metil-β-ciclodextrina (MCD) foi dissolvido no meio de controlo (para o câncer ou urothelial células normais) usando FCS isento de colesterol (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT, EUA) em vez de FCS com o colesterol.

Uma mistura de Olya /PlyB (relação 9 molar : 1) foi preparado a partir de corpos de frutificação frescos de

P

.

ostreatus

como descrito anteriormente [26,40]. Antes do tratamento de células, o OLYA /PlyB foi diluída em meio de controlo sem colesterol (para o cancro ou células uroteliais normais). Para marcação da membrana-jangada, uma concentração de nonlytic OLYA /PlyB (2,5 ug /ml) foi aplicada às células uroteliais durante 1 h e 3 h a 37 ° C. Para os estudos de citotoxicidade, OLYA /PlyB foi utilizado a 30 ug /ml durante 1 h e 3 h a 37 ° C.

colesterol celular total conteúdo

A T24, RT4, nuc-1 e células g /g foram semeadas a 1 x 10

4 células /cm

2, e as células NPU em 1 × 10

5 células /cm

2, e foram cultivadas em meio de controlo para 100% de confluência. As células T24, RT4 e NPU também foram tratados com MDC 7 mM durante 6 h, e foram preparadas suspensões de células de 250 ul. Os lípidos foram extraídos a partir de 200 ul de suspensões de células, estas seguindo o método de Bligh e Dyer [41]. Estes extractos lipídicos foram secos com N

2, e os lipidos foram dissolvidos em 50 ul de álcool isopropílico. A quantificação do colesterol livre nestes extractos lipídicos baseou-se no uso de colesterol oxidase e o acoplamento do peróxido de hidrogénio produzido com ácido 4-hidroxibenzóico e 4-aminopiridina com a reacção de peroxidase. O corante quinoneimina que se formou como resultado da peroxidase foi quantificada a 560 nm (kits de colesterol Konelab, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). concentrações de proteína total foram determinados a partir de alíquotas de 50 ul de suspensão de células utilizando o ensaio de Bradford [42]. O teor de colesterol total de células é dado como proteína celular mg de colesterol /mg.

Olia e HMG-CoA redutase immunolabelings e medições de intensidade de fluorescência

As células T24 e RT4 foram cultivadas em lamelas eo NPU células em membranas porosas 0,4 mícrons (BD Falcon, Pharmingen, San Diego, CA, EUA). Para OLYA imunomarcação, as células foram incubadas com 2,5 ug /ml OLYA /PlyB durante 30 min a 37 ° C. As células foram então lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e fixadas em formaldeído a 4% (FA) durante 10 min a 4 ° C. Após 30 min de bloqueio com 2% de albumina de soro bovino (BSA) a 37 ° C, as células foram incubadas com anticorpos de coelho anti-OLYA policlonal (1: 2500) durante 1 h a 37 ° C, em seguida, lavadas com PBS e incubadas com Alexa Fluor 488 conjugado com anticorpos anti-coelho secundário (1: 600, Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) durante 30 min a 37 ° C. Para HMG-CoA redutase imunomarcação, as células foram fixadas em 4% de FA durante 10 min a 4 ° C, e colocar no bloqueio de BSA a 2% a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, as células foram incubadas com anti-coelho de HMG-CoA redutase anticorpos policlonais (1: 200, a Merck Millipore 09-356) durante 1 h a 37 ° C, lavadas com PBS e incubadas com Alexa Fluor anticorpos secundários anti-coelho conjugados para 488 30 min a 37 ° C

As células foram colocadas em Vectashield contendo 4,6-diamidino-2-fenilindol. (DAPI; Vector Laboratories, Burlingamme, CA, EUA) e analisadas por microscopia de fluorescência (AxioImager Z1) utilizando uma objectiva de imersão em óleo (63 × óleo /NA 1,40), e com um dispositivo de ApoTome para a geração de secção óptica. As imagens foram obtidas usando o programa AxioVision (Carl Zeiss, Alemanha).

Foram analisados ​​13-20 imagens por condição de cultura e mediu a intensidade de fluorescência verde médio por campo de visão (programa AxioVision). As imagens foram tiradas ao mesmo tempo de exposição (469 ms) para cada condição de cultura de células.

análise de imunotransferência

Após o tratamento MCD, as células foram lisadas com 2 mM de EDTA, 150 mM de NaCl , Tris 100 mM, 1% de Triton X-100, 1 mM de aprotinina, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM e 1 mM de na

3VO

4, durante 30 min a 4 ° C. Quantidades iguais de proteína (20 ug) foram resolvidas usando SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose, que foram então sondadas com anticorpos policlonais de coelho anti-LC3 (1: 1000; MBL; PM036), anticorpos policlonais de coelho anti-PARP (1: 1000; Roche Life Science; 11835238001), e anticorpos policlonais de coelho anti-p-actina (1: 1000; Sigma; A2066). -anticorpos secundários de rábano conjugado com peroxidase anti-coelho policlonal (1: 1000; Sigma) foram detectados utilizando a técnica de quimioluminescência aumentada (ECL substrato blotting Pierce Ocidental, Thermo Scientific)

Medição da actividade de caspase

A actividade de caspase foi determinada medindo a clivagem de acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (Ac-DEVD-AFC; Bachem, Bubendorf, Suíça) em não tratadas (controlo) e MCD tenha sido tratada com T24, RT4, e células NPU como descrito anteriormente [43]. Para o controlo positivo da activação de caspase, células RT4 foram expostas a irradiação UV durante 30 segundos para induzir apoptose, e, em seguida, incubou-se durante mais 6 h. A actividade DEVD-fosfatase foi medida utilizando um leitor de microplacas (Safire; Tecan, Mannedorf, Suíça). As taxas iniciais das reacções foram calculados e são apresentados como unidades fluorescentes relativas por segundos (RFU /s).

citometria de fluxo

As células uroteliais tratado e não tratados foram cultivadas em placas de 24 poços (1 × 10

5 células /poço) e cultivadas até à confluência para o MCD e tratamentos OLYA /PlyB. As células colhidas foram incubadas com a anexina V-PE reagente (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, EUA) e com /mL de iodeto de propídio 0,2 ug (PI; Sigma) .As células foram analisadas por anexina V-PE e PI a fluorescência com um citómetro de fluxo FACSCalibur e o software CellQuest (Becton Dickinson tanto San Jose, CA, EUA). Nós discriminaram as frações de populações de células (positivo PI) viáveis ​​(anexina V negativos e PI negativo), no início de apoptose (anexina V positiva, PI negativa) e mortas. Três experimentos independentes foram realizados, com cada realizada em duplicado.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

As células tratadas com MCD e Olya /PlyB e as células não tratadas foram fixadas com glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato durante 3 h a 4 ° C. Após lavagem, as células foram incubadas com 1% de OsO

4 e 3% K

4Fe (CN)

6, preparado em tampão cacodilato, durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, 0,3% em tampão de cacodilato thiocarbohydrozide foi adicionado durante 5 min à temperatura ambiente. Após a lavagem, 1% de OsO

4 foi adicionada durante 20 min a temperatura ambiente. As células foram então desidratados e embebidos em Epon (Serva, Heidelberg, Alemanha). Secções ultrafinas foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo (ambos a partir de Merck, Darmstadt, Alemanha). Estas secções foram examinadas sob microscopia eletrônica de transmissão (TEM), utilizando um microscópio eletrônico de Phillips CM100.

Estatísticas

Os dados são apresentados como médias ± erro padrão de dois ou três experimentos independentes, cada uma realizada em em duplicado ou triplicado, e foram avaliados usando t-testes dos alunos, e ANOVA one-way ou Kruskal-Wallis análise de variância unidireccional. Quando foram necessárias múltiplas comparações de pares, o método de Holm-Sidak ou método de Dunn foram usadas (software Sigma Plot, Systat Software Inc, CA, EUA). Os valores P 0,05 foram considerados como sendo estatisticamente significativo. coeficiente de correlação de Pearson entre o teor de colesterol e expressão da proteína HMG-CoA redutase foi calculada (Microsoft Office Excel).

Resultados

teor de colesterol é maior em células cancerosas uroteliais invasivos em comparação com células uroteliais não invasivas de origem

humana e mouse

Para os urothelial células humanas, a análise do conteúdo de colesterol revelou os níveis mais altos em T24 células cancerosas urotelial invasivo, que foram significativamente mais baixos em células cancerosas uroteliais não invasivo RT4, e menor em células NPU ( 28,0 ± 0,51; 22,9 ± 1,3; /proteína de 16,6 ± 1,9 ug de colesterol mg de células, respectivamente; Figura 1A). Houve uma correlação positiva entre o teor de colesterol e expressão da proteína HMG CoA, calculada como coeficiente de correlação de Pearson sendo r = 0,945 medida da intensidade média da imunofluorescência (Fig 1B). Este imunofluorescência foi a mais alta em células T24 e mais baixa em células NPU.

A. Quantificação de conteúdo de colesterol em células de ratinho invasiva NUC-1 humana e T24, não invasivo, em células de rato L humana e RT4 g /L, e em células NPU. B. secções ópticas representativos de HMG-CoA redutase de imunomarcação (verde) em células T24, RT4 e NPU. coloração nuclear DAPI também é visto (azul). Escala das barras 20 uM. C. Quantificação de a intensidade média da HMG-CoA imunofluorescência de células humanas T24, RT4 e células NPU, como se ilustra na (B). A, C. Os dados são médias ± erros padrão de três experiências independentes. NS, não significativo; * P 0,05, ** p . 0.005

Como estas células não transformadas NPU são de origem suína, para avaliar as diferenças entre espécies no teor de colesterol, analisamos o conteúdo de colesterol de urotelial invasivo e não-invasivo células de origem mouse. Aqui, testamos G células NUC-1 e g /uroteliais, que refletem as fases distintas no cancerogenesis urothelial em ratos [37]. células NUC-1 são tumorigénico e invasivo, e, como tal, eles fornecem uma comparação perto de T24 células humanas e de g urothelial células /G do mouse são não-invasivo, e são, portanto, comparável às células humanas RT4. O teor de colesterol nas células invasoras NUC-1 foi significativamente maior do que no g não invasivo /células G (26,3 ± 1,5; /proteína de célula de 21,8 ± 1,4 ug de colesterol mg, respectivamente; Figura 1A). Por outro lado, o teor de colesterol das células uroteliais invasivos T24 humanas e NUC-1 de ratinho não diferiram de forma significativa, como também se verificou para o teor de colesterol em células RT4 uroteliais não invasivas humano e ratinho g /L. Estes dados indicam que o teor de colesterol tem uma correlação inversa com o nível de transformação do cancro urotelial (Fig 1A).

MCD induz e dependente da dose dependente do tempo de morte de células cancerosas uroteliais

o efeito do tratamento MCD sobre a viabilidade celular foi investigada utilizando anexina V e coloração de PI em combinação com análise de citometria de fluxo. Os gráficos de pontos representativos na Figura 2A mostra T24, amostras de células RT4 e NPU tratada com MCD 7 mM durante 6 h, e estes são acompanhados por quantificação dos efeitos de diferentes concentrações de MCD (3, 5, 7 mM) aplicado para aumentar a incubação vezes (1, 3, 6 h). No MCD 3 mM, não ou foram observados apenas efeitos mínimos sobre as viabilidades em todos os três tipos de células, independentemente do tempo de incubação (Fig 2A).

A. Esquerda: gráficos de pontos representativos de análise de citometria de fluxo de células T24, RT4 e NPU cultivadas em meios de controlo e de tratamento após 7 MCD mM durante 6 h. Anexina V-PE e PI foram usadas para discriminar entre células viáveis ​​(Double Negative), no início apoptóticos (single anexina V positiva) e mortos (PI positivos). Direita: A quantificação da viabilidade das células a partir da análise de citometria de fluxo de células T24, RT4 e NPU depois de 3 mm, 5 mm, e 7 tratamentos MCD mM durante 1 h, 3 h e 6 h. B. Quantificação de depleção do colesterol celular em células T24, RT4 e NPU após tratamento MCD 7 mM durante 6 h. Os dados são médias ± erros padrão de medições em duplicado de três experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001

Nas células T24, que eram os mais sensíveis a MCD destes três tipos de células, a viabilidade celular foi. significativamente reduzida após 5 mM e 7 mM de tratamento MCD durante 3 h, a 92% e 89%, respectivamente. Seis horas após a viabilidade do tratamento foi reduzida para 77% em MCD 5 mM e a apenas 47% em MCD 7 mM (Fig 2A). Em células RT4, a única redução significativa na viabilidade ao longo de um intervalo de concentrações de MCD e tempos de incubação foi depois de 6 h com MCD 7 mM (a 82%; Figura 2A). Observou-se um efeito ainda mais pequenos para as células NPU, em que apenas o tratamento com MCD 7 mM durante 6 h apresentavam uma ligeira redução na viabilidade das células (a 92%; Figura 2A). Quando comparado com as células T24 e RT4, o efeito de 6-h tratamento com MCD 7 mM sobre a viabilidade celular foi estatisticamente menor em células NPU (Fig 2A). Além disso, pudemos observar que moribunda, as células positivas PI foram anexina V negativo ou positivo, ao passo que uma população de células positivas única anexina V nunca foi proeminente, o que sugere que a morte celular é necrótica em vez de apoptose (Fig 2A).

Curiosamente, após 7 tratamento MCD mM durante 6 h, o teor total de colesterol de T24, RT4, e células NPU foi reduzida em comparação com as respectivas células não tratadas, por 86%, 57%, e 29%, respectivamente ( Fig 2B).

a análise de viabilidade celular, assim, mostrou que o grau de citotoxicidade de MCD aumentou com a concentração e a duração do tratamento. Para definir melhor as diferentes sensibilidades ao tratamento MCD destes três tipos de células uroteliais, a morfologia das células foi avaliada após 7 tratamento MCD mm, em que diminui significativamente a viabilidade das células foram vistos. células T24 tratadas com MCD 7 mM durante 3 h, e as células RT4 tratados com MCD 7 mM durante 6 h, tornou-se arredondado e foram fracamente ligado (Fig 3). células T24 destacada depois de 7 de tratamento MCD mM durante 6 h (Fig 3). A extensão do arredondamento celular foi mais pronunciado em células T24, e menos pronunciada em células RT4 e NPU, onde foram observados efeitos morfológicos apenas pequenas. Estes dados correlacionam bem com a análise de morte celular.

T24, células RT4 e NPU (como indicado) foram tratados (controlo) ou tratados com MDC 7 mM durante 3 h e 6 h, e, em seguida, examinadas sob uma microscópio invertido. arredondamento celular era dependente do tipo de célula (T24 NPU; RT4 3 H 6 h). células T24 e RT4 mudou de forma plana e poligonal (controlo) a (células T24, 3 h, 6 h de tratamento, as células RT4, 6 h de tratamento, pontas de seta) esféricas. Barra de escala, 20 ^ m.

Em todos os casos, com a coloração PI-positivas indicando que a viabilidade das células foi reduzido devido à necrose, análise ultraestrutural por MET forneceu mais evidências de morte celular por necrose (figura 4) . As membranas plasmáticas de células RT4 T24 e após tratamento MCD 7 mM durante 6 h foram rompidas e o citoplasma foi libertado, embora o envelope nuclear permaneceu intacta (Figura 4). No entanto, as células NPU não apresentaram características de necrose após este tratamento MCD (Figura 4).

T24, células RT4 e NPU não foram tratados (controlo) ou tratados com MDC 7 mM durante 6 h, e então processada para MET . alterações necróticas foram observadas em células individuais T24 (estrela) e células RT4, incluindo perturbação membrana plasmática (pontas de seta) e liberação de conteúdo da célula. células NPU permaneceu intacta após este tratamento MCD, com glicocálix ainda presentes (setas abertas). N, núcleo. Barras de escala, 1 mm.

Para investigar mais especificamente envolvimento da apoptose após o tratamento MCD, foi analisada a ativação de caspases. Através da monitorização da clivagem do substrato fluorogénico Ac-DEVD-AFC foi observada nenhuma activação da caspase significativo sobre 6 h de incubação com 3 mm, 5 mm ou 7 MCD mM quer em T24, RT4 ou células NPU. (Figura 5A). Também não foram capazes de detectar a activação da caspase em células incubadas com 5 e 7 mM MCD durante 6 horas por imunotransferência do fragmento p85 PARP (Fig 5B), o qual é produzido por caspases activadas [44]. Para comparação, a radiação UV causou a clivagem de ambos o péptido e a proteína DEVD PARP em células T24 e RT4. A falta de activação da caspase combinada com a ausência de sinal de anexina V e alterações ultra-estruturais característicos da necrose colectivamente sugerido que o tratamento de células uroteliais MCD desencadeada a morte celular por necrose, em vez de apoptose.

T24, células RT4 e NPU foram tratados com 3 mM de (a), 5 mM (a) ou 7 mM MCD (CA) durante 6 h. A. caspase medições da actividade de clivagem Ac-DEVD-AFC não mostraram qualquer aumento na atividade da caspase. Os controlos positivos (30s UV) mostrou actividade de caspase relacionada com apoptose induzida em células T24 e RT4 em 6 h. B. A análise de imunotransferência, não mostram a clivagem de PARP de comprimento completo (120 kDa) num fragmento de 85 kDa. C. Análise de imunotransferência, não mostrou conversão de LC3-I (18 kDa) a LC3-II (16 kDa). Actina foi utilizado como controlo de carga. Os dados são médias ± erro padrão de medições em triplicado.

Western blot de células T24, RT4 e NPU após o tratamento com MCD 7 mM durante 6 h não revelou qualquer conversão de LC3-I para LC3-II (Figura 5C). Isto indicou que MCD não induziu a autofagia. Além disso, a observação de T24, RT4 e NPU células por TEM não revelou quaisquer estruturas autofágicos típicos, tais como vesículas de dupla membrana ou autofagossomas (Fig 4).

Olia /PlyB-tratamento induz a necrose das células cancerosas uroteliais

Olia /PlyB foi usado para duas aplicações diferentes. Uma concentração de nonlytic OLYA /PlyB (2,5 ug /ml) foi usada para domínios etiqueta de colesterol /ricos em esfingomielina de as membranas plasmáticas (Figura 6C), e uma concentração lítica (30 ug /ml) foi aplicado para permeabilizar as membranas de plasma. A imunomarcação Olia mais proeminente (anticorpos foram levantadas contra Olya respectivamente) foi observada para células RT4 e revelou pela quantificação de Olya de fluorescência (Fig 6C ‘). Esta rotulagem OLYA era mais uniforme através da membrana plasmática em células RT4. Em contraste, a distribuição OLYA em células T24 foi menos uniforme, e a sua distribuição era descontínuo. Rotulagem de células NPU mostrou menos células Olya-positivos que difere significativamente do T24 e RT4 células (Fig 6C).

A. Representante de distribuição de coloração de PI T24, RT4 e células NPU tratadas com 30 ug /ml Oly /PlyB durante 1 h. histogramas abertos representam células não tratadas, enquanto histogramas a cheio indicam células tratadas com PlyB Olya /. As percentagens de células vivas e mortas são mostrados na parte esquerda e direita dos histogramas, respectivamente. B. Viabilidade de T24, células RT4 e NPU seguinte 1-H e 3-h tratamentos com 30 ug /ml OLYA /PlyB, tal como determinado por análise de citometria de fluxo. Os dados são médias ± DP de medições em duplicado a partir de duas experiências independentes. C. imunomarcação de domínios ricos colesterol de membrana /esfingomielina nas células uroteliais com OLYA. A imagem sobreposta de secções ópticas através de células inteiras representam a extensão ea distribuição de Olya immunolabeled domínios de membrana ricos colesterol /esfingomielina em células T24, RT4 e NPU. Verde, Olya-rotulagem; azul, DAPI coloração de núcleos. Barras de escala, 20 um. C. A quantificação de Olya imunomarcação é apresentado como a intensidade de fluorescência média por campo de visão (em unidades arbitrárias; A.U.). * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001

A viabilidade das células após 1 h e 3-h-tratamento com 30 ug /ml OLYA /PlyB foi. analisadas por citometria de fluxo. As viabilidades de células após 30 tratamentos ug /ml OLYA /PlyB durante 1 h e 3 h foram determinados como acima, por análise de citometria de fluxo. À medida que a rotulagem anexina-V foi negativo em todas as células, as fracções das células PI-positivos (i.e., mortos) e PI-negativas foram determinadas como indicado pelos histogramas representativos mostrados na Figura 6A. Depois de 30 tratamento ug /ml OLYA /PlyB durante 1 h, a viabilidade celular das células T24 foi significativamente reduzido a 75% (p 0,005), e depois de 3 h, a 65% (p 0,001). Da mesma forma, a viabilidade celular das células RT4 diminuiu para 58% (p 0,001) após 1 h, ainda que esta não se alterou mais para o 3-h tratamento. Em contraste, a viabilidade celular das células NPU não foi significativamente afectada pela 30 ug /ml OLYA /PlyB tratamentos para qualquer um h ou 3 h (Fig 6B). Entre todos estes três tipos de células testadas, as diferenças entre as viabilidades celulares entre a 30 ug /ml de tratamentos /PlyB OLYA durante 1 h e 3 h não atingiu significância. Os resultados de imunomarcação de domínios de membrana rica colesterol /esfingomielina com OLYA estavam de acordo com a análise de viabilidade celular.

a morte celular por necrose de células RT4 T24 e depois de 30 ug /ml OLYA /PlyB tratamento durante 1 h, foi indicado pelas células PI-positivos (Figura 6A) e as suas alterações ultra-estruturais característicos (Fig 7). Para estas células, as modificações mais proeminentes eram vistos como um aumento da permeabilidade da membrana plasmática e fugas de citoplasma, juntamente com organelo inchaço (Fig 7). A ultra-estrutura das células NPU não foi afetada pela 30 ug /ml Olya /tratamento PlyB durante 1 h, com estes células tratadas controle e mostrando a morfologia similar e com membrana plasmática intacta (Fig 7).

T24, RT4 e NPU células foram tratadas com 30 ug /ml OLYA /PlyB durante 1 h e em seguida processada para MET. células RT4 e T24 mostram perda da integridade da membrana (setas), liberação de citoplasma e organelas inchaço (estrelas), que indicam necrose celular. A ultra-estrutura das células NPU tratados se assemelha ao de células NPU não tratados, com abundante glicocálice (setas abertas). N, núcleo. Barras de escala, 1 mm.

Discussão

O câncer de bexiga é o quarto diagnóstico de câncer mais comum em homens [45]. No entanto, por causa da alta taxa de recorrência e a necessidade de monitoração invasiva contínua, tem os mais altos custos de tratamento vida por paciente de todos os cânceres [46]. Com efeito, até 70% dos pacientes têm recidivas locais após a quimioterapia ou imunoterapia intravesical [47]. É provável que a taxa de cura baixa é devida à doença micrometastática que pode ser induzida no momento da ressecção transuretral ou cistectomia, o que resulta em recaídas dos tumores uroteliais ou em metástases nos gânglios linfáticos, ossos, pulmão, pele e fígado [48]. Além disso, a mortalidade é causada principalmente por invasivos, carcinomas uroteliais metastáticos que se tornaram resistentes à quimioterapia.