personalizado

Abstract

No cancro colorectal (CRC), instabilidade cromossômica (CIN) é tipicamente estudada usando comparativa hibridação -genomic (CGH) arrays. Estudamos emparelhado (tumor e saudável circundante) de tecido fresco congelado de 86 pacientes com CCR usando matriz SNP baseado em Infinium da Illumina. Este método permitiu-nos estudar CIN no CRC, com análise simultânea de número de cópia (CN) e frequência B-alelo (BAF) – uma representação da composição alélica. Estes dados nos ajudou a detectar mono-alélicas e bi-alélicas amplificações /exclusão, copiar perda neutra de heterozigosidade, e os níveis de mosaicismo para as populações de células mistas, alguns dos quais não podem ser avaliados com outros métodos que não medem BAF. Foram identificadas associações entre anormalidades NC e diferentes fenótipos CRC (diagnóstico histológico, localização, grau tumoral, estádio, MSI e presença de metástase linfonodal). Nós mostrou semelhanças entre as regiões da mudança CN observado no CRC e as regiões relatados em estudos anteriores de outros cancros sólidos (por exemplo amplificações de 20q, 13q, 8q, 5p e deleções de 18q, 17p e 8p). Do banco de dados alvo terapêutico, identificamos drogas relevantes e segmentados, aos genes localizados nessas regiões com mudanças NC, aprovados ou em ensaios para outros tipos de câncer e doenças comuns. Estas drogas podem ser considerados para futuros ensaios terapêuticos em CRC, com base no diagnóstico citogenética personalizado. Encontramos também muitas regiões, os genes que abrigam, que actualmente não são alvo de qualquer droga relevantes que podem ser considerados para estudos de descoberta de drogas futuras. Nosso estudo mostra a aplicação de matrizes SNP de alta densidade para o estudo citogenética no CRC e sua utilidade potencial para o tratamento personalizado

Citation:. Jasmine F, Rahaman R, Dodsworth C, Roy S, Paulo R, Raza M, et ai. (2012) Um estudo Genome-Wide de citogenéticos Alterações no câncer colorretal Usando SNP microarrays: Oportunidades para o futuro tratamento personalizado. PLoS ONE 7 (2): e31968. doi: 10.1371 /journal.pone.0031968

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de setembro de 2011; Aceito: 19 de janeiro de 2012; Publicação: 20 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jasmine et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede U01 CA122171, P30 CA 014.599, P42ES010349, R01CA102484 e R01CA107431. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é um tumor maligno comum em países desenvolvidos. Nos EUA é a segunda maior causa de mortes relacionadas ao câncer, com uma estimativa de 102.900 novos casos ocorridos durante 2010 [1], [2]. CRC é tipicamente muito menos comum em países do mundo, incluindo o Sudeste da Ásia em desenvolvimento; no entanto, as taxas estão em ascensão, talvez devido ao envelhecimento da população, tabagismo, mudanças na dieta e uma falta de programas de rastreio [1]. Na população do Sul da Ásia, os pacientes tendem a apresentar CRC em uma idade mais jovem e, normalmente, em fase posterior [3], [4].

As células cancerosas são caracterizadas por anomalias citogenéticas que podem ser usados ​​para definir doença específica entidades e seus marcadores prognósticos e preditivos. Em CRC, anormalidades cromossómicas ocorrer num padrão não aleatório ao longo da via a partir de adenoma para carcinoma e, em seguida, a lesões avançadas e a formação de metástases [5] – [8]. Existem três vias conhecidas na patogénese CRC: a instabilidade cromossómica (CIN), instabilidade microssatélite (MSI), e o CpG island methylator fenótipo (CIMP) Vias [9]. Estas três vias estão intimamente relacionados e os tumores ocasionalmente exibem características de múltiplos caminhos. A maioria dos casos de CRC surgem através da via CIN: por exemplo, através de rearranjos estruturais, amplificações e eliminações [10], com o número de cópias (CN) Variação ser um achado comum [11], [12]. Algumas das consequências acreditavam de CIN são a perda de genes supressores de tumor e amplificação de oncogenes nas regiões afetadas. Em contraste, MSI é menos comum e é mais susceptível de ser associada com CCR hereditário e um melhor prognóstico [8], [13]. CIN e MSI são pensados ​​para envolver dois caminhos no desenvolvimento de CRC [6], [10].

anormalidades cromossômicas em CRC têm sido estudados por vários grupos usando tanto a hibridização genômica comparativa (CGH) ou matriz comparativa hibridação genómica (aCGH) [5] – [8], [10] – [12], [14] – [22]. Isto levou à descoberta de muitas aberrações cromossómicas, incluindo ganhos e perdas, retratando uma imagem complexa de progressão da doença. achados comuns são particularmente ganhos de 20q, 13q, 7P, e 8q e perdas em 17p, 18q, 8p, 4T, e 5q [23] – [29]. matrizes de alta densidade único polimorfismo de nucleótido (SNP) é um método vantajoso e alternativa para a análise de anomalias cromossómicas. Isto é porque uma resolução mais elevada pode ser conseguida ao lado análise simultânea de perda de heterozigosidade (LOH) e variação NC [30]. Para o nosso conhecimento, existem apenas alguns estudos citogenéticos publicados no CRC realizada utilizando relativamente matrizes SNP de baixa densidade [23], [29], [31] – [35], e esses estudos defender um forte argumento para a sua utilização. Em 2007, Andersen et ai., Utilizando uma matriz de SNP (Affymetrix matriz 10 K), encontrado cópia LOH neutro (cnLOH) como uma ocorrência comum em CRC [23]. Middeldorp et ai. genotipados tecidos FFPE de 19

MUTHY

-associated pacientes com CCR usando genotipagem Golden Gate de Illumina e encontraram alterações semelhantes principalmente em 17p, 18q, 15q e 6p região [34]. CGH ou aCGH são incapazes de detectar a ocorrência de cnLOH. As consequências de tal lesão durante o desenvolvimento humano e câncer têm sido recentemente revisto [36]. matrizes SNP, portanto, capturar informações mais detalhadas sobre o mecanismo subjacente possível das anomalias detectadas. Gaasenbeek et ai. [31] A análise de matriz de SNP em comparação com a plataforma Affymetrix (10 K Xba131) com CCG em 45 linhas celulares de CRC não seleccionadas e encontraram muitas anormalidades que eram aparentes utilizando a matriz de SNP, mas não foram detectadas em CGH, confirmando a vantagem de utilizar uma plataforma matriz SNP . Lips et al. em comparação 4 FFPE CRC tecido usando um array GoldenGate SNP da Illumina (contendo 5.861 sondas) com o DNA de leucócitos, FFPE normal e tecido fresco congelado a partir dos mesmos casos e foram encontrados resultados comparáveis ​​[32]. Além disso, Lips et al. [29] utilizado Affymetrix 10 matriz K SNP para 78 tecidos de tumor rectal congelados frescos para mostrar a diferença de CIN de adenoma e carcinoma. Eles encontraram cinco aberrações cromossómicas específicas que poderiam discriminar entre adenoma e carcinoma. Sheffer et al. [35] usou a matriz Affymetrix 50 K XbaI SNP correlacionar variações NC no CRC com a expressão gênica (usando Affymetrix U133A), progressão da doença e os resultados de sobrevivência. Eles testaram 130 SNP perfis de matriz de diferentes tipos de tecido (normal, adenoma, diferentes estágios de CRC e metástases) .Eles encontradas deleções de 8p, 4p e 15q a ser associado com a progressão da CRC e os resultados de sobrevivência pobres.

em contraste com os estudos anteriores, com emparelhados e tamanho de amostra muito maior de um grupo homogéneo de 86 pacientes com CCR, o nosso presente estudo teve por objetivo detectar aberrações cromossómicas usando base Infinium de alta densidade da Illumina (610 K e 300 k) matriz SNP. Foram analisados ​​os dados de correlações entre CIN e vários parâmetros histopatológicos e clínicos. Além disso, foram identificados genes abrigavam dentro das regiões afectadas que podem contribuir para o desenvolvimento do tumor ou podem ter um efeito protector sobre a metástase do tumor. Usando o Therapeutic Targets banco de dados (TTD) que combinavam com os genes das regiões de amplificação e de supressão com drogas que são ou já aprovados ou estão em estágios de desenvolvimento de drogas para direcionar esses genes. Com este romance interrogatório, é possível identificar medicamentos apropriados para pacientes que apresentam estas aberrações particulares e tratamento, portanto, sob medida para o indivíduo. Nosso estudo, ao nosso conhecimento, é o primeiro a relatar os resultados do uso de uma plataforma de matriz SNP de alta densidade em um tamanho de amostra muito maior emparelhado e analisar anomalias cromossómicas em relação ao tipo de tumor, localização, grau, palco e sexo. Nosso estudo também é único em correlacionar os genes alterados com drogas visando os genes para o potencial de identificação de terapia personalizada. Finalmente, o nosso estudo foi realizado em uma população do Sudeste Asiático estudado com CRC.

Resultados

As características dos pacientes e os dados histopatológicos são apresentados na Tabela 1. A análise Emparelhados CN do SNP e Copy Number Variação ( CNV) dados da sonda de 86 tecidos de CRC e as suas correspondentes amostras de tecido saudável circundante do cólon revelou um total de 10.878 segmentos genómicos (autossomas apenas) com amplificação (1501), supressão (1630) e nenhuma mudança NC (7747). Por “amplificação” queremos dizer um aumento do número de cópias de um fragmento de ADN específico e “supressão” queremos dizer uma perda de uma parte do ADN de um cromossoma (https://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome /Glossário /). As localizações cromossómicas destas amplificações (a vermelho) ou deleções (em azul) encontrados nas amostras de CRC são mostrados na Figura 1. A largura da barra é proporcional ao número de amostras que mostram a variação NC. Por exemplo, a amplificação foi mais frequentemente encontrado na região 20q13.2 (21 de 86 amostras de CRC) e eliminação foi mais frequentemente encontrado em 18q21 região (19 de 86 amostras de CRC). Em comparação com o tecido saudável correspondente encontramos amplificação nas seguintes regiões cytoband do tecido CRC: cromossomo 20 (Q11, Q12, Q13, p11), cromossomo 13 (Q12, Q13, Q14, Q21, Q22, Q24, Q32, Q33) , cromossoma 8 (Q12, Q21, Q22, Q23, Q24), cromossomo 5 (p12, p13, p14, p15) e cromossomo 9 (p21, p22, p23, p24). Da mesma forma, foi encontrada deleção no cromossomo 18 (Q21, Q22, Q23, Q11, Q12, p11), cromossoma 8 (p21, p22, p23, p12), cromossoma 17 (p11, p12, p13), cromossomo 9p21 e cromossomo 1p36. A maioria destes achados também são relatadas por outros autores [29], [33], [35].

As amplificações (média CN≥2.5) são mostrados em vermelho, e deleções (média CN≤1.5) são apresentados Em azul. O tamanho horizontal da representação bar quantas amostras (pelo menos 9 amostras, 10%) exibiram a amplificação /exclusão.

Tipos de anomalias citogenéticas identificados

Ao contrário de CGH , que fornece apenas dados NC, chips de SNP fornecer informações sobre ambos CN e BAF. FAB refere-se a uma medida da “composição alélica”, isto é, a contribuição relativa do sinal a partir do alelo B. Em outras palavras, para uma amostra de BAF mostra o valor de teta para um SNP corrigido para a posição de cluster. Portanto, os valores BAF para um local especial para um indivíduo que é homozigoto para o alelo B, homozigotos para o alelo ou heterozigotos para AB são 1, 0 ou 0,5, respectivamente. BAF oferece duas vantagens principais para o uso das plataformas de matriz de alta densidade de SNP em estudos citogenéticos, como descrito abaixo, com ilustração dos resultados relevantes a partir de nosso estudo

.

Primeiro, mosaicismo ou proporções de populações de células diferentes (neste caso, células de tumor) pode ser obtido a partir de um cálculo de volta usando a fórmula descrita na nossa secção de “Métodos estatísticos”. Em outras palavras, os dados de citogenômica derivados de tais chips de alta densidade SNP pode também proporcionar informação quanto à mistura de células normais e anormais cromossomicamente na amostra de ADN estudadas. As Figuras 2-6 ilustram isso em nosso estudo. Em cada uma das figuras, o painel superior mostra a segmentação genómica em amostras diferentes (onde cada linha representa uma amostra, a amplificação é mostrado em vermelho, exclusão em azul e normal CN sem cor); o segundo painel mostra a NC em escala linear para uma única amostra marcada no primeiro e no terceiro painel; o terceiro painel mostra o BAF da mesma amostra; e o painel de fundo ou quarto mostra a localização cromossómica correspondente com informações cytoband. Figura 2 mostra que quase todo o braço 8q de C_10 amostra tiveram amplificação NC (2.9) com separação de heterozigoto (AB) de painel em BAF ~0.34 (representando AAB) e 0,66 (representando a ABB) indicando amplificação mono-alélico, em ~ 90% células (neste caso as células cancerosas) que dão origem a uma mistura de células. A fórmula para o cálculo de mosaicismo é mostrada na seção “Materiais e Métodos”. Pode notar-se que, se 100% das células teve mudança semelhante, em seguida, teoricamente, seria de esperar CN = 3 e BAF ser 0,33 e 0,67 (um quadro típico de trissomia). O mesmo exemplo mostra deleção no 8p em -45% de células. A Figura 3 mostra a amplificação no mesmo braço 8q em uma outra amostra, c_1. Em contraste com a Figura 2, no entanto, BAF, neste caso, não mostra qualquer grupo em todos os apesar aumento em CN sugerindo amplificação bi-alélico, em ~ 30% da população de células. BAF, neste caso parece absolutamente como célula normal, mas os dados de CN mostra claramente amplificação. Somente a combinação de dados NC e BAF poderia sugerir a possível patologia. Se 100% de células tinha essa mudança, seria de esperar CN = 4 e BAF = 0,5 (ou seja, sem divisão). A Figura 4 mostra cromossoma 8p c_1 de amostra e mostra claramente eliminação mono-alélica (e.g. A_ ou _B) em ~ 80% das células. Se 100% de células tinha tal exclusão mono-alélicas, seria de esperar CN = 1 e divisão de BAF para 0,0 e 1,0 (um quadro típico de LOH completa devido à perda de mono-alélicas). A Figura 5 mostra a eliminação mono-alélicas de 8p e amplificação mono-alélicas de 8q, tanto em uma amostra (C_21). O CN e a divisão BAF sugerem esta supressão-amplificação na população de células ~ 65%. Comparação dos eventos de deleção na Figura 4 e Figura 5 mostram claramente a vantagem de análise de dados e os dados de CN BAF em conjunto para obter a proporção de células anormais na amostra tumoral. A Figura 5 também mostra claramente que a divisão do painel AB no BAF enredo pode ser encontrado tanto na eliminação e amplificação estados enfatizando a importância dos dados combinados (NC e BAF) para interpretar a mudança citogenética visto em amostras de tumor. A Figura 6 mostra um exemplo de divisão do painel AB nos dados BAF em 17p cromossomo sem qualquer mudança no status CN (pode ser chamado cnLOH). Este tipo de mudança é possível em caso de UPD ou isodisomy adquirido. Neste caso (C_19 amostra) -50% de células mostram cnLOH no braço 17p única passo que todo o braço 17q é normal. Pode-se notar que este tipo de anormalidade não pode ser detectado por aCGH. A Figura 7 mostra um exemplo de amplificação monoalélicos sobreposto, cnLOH no cromossoma 20q. Um resumo da combinação de mudanças no estado de CN e BAF e sua possível explicação para o mecanismo de anormalidade citogenética é apresentada na Tabela 2.

Em 8q (onde BAF = 0,34, 0,66 e CN = 2.9), cerca de 90% das células têm amplificações monoalélicos (AAB ou da ABB). Em 8p (onde BAF = 0,35, 0,65 e CN = 1,55), aproximadamente 40% das células têm deleções monoalélicos (A_ ou B_).

BAF = 0,5 e CN = 2.6. Aproximadamente 30% das células têm amplificação bialélico (ABAB).

BAF = 0,17, 0,83 e CN = 1.2. Aproximadamente 80% das células têm exclusão mono-alélicas (A_ ou B_).

Em 8q (onde BAF = 0,38, 0,62 e CN = 2,65), aproximadamente 65% das células têm amplificações monoalélicos (AAB ou ABB). Em 8p (onde BAF = 0,26, 0,74 e CN = 1,35), aproximadamente 65% das células têm deleções monoalélicos (A_ ou B_).

Note que 17p mostra o padrão normal heterozigoto em todas as células ( BAF = 0,5 e CN = 2), mas aproximadamente 50% das células mostram cnLOH (AA ou BB) em 17q (BAF = 0,25, 0,75 e CN = 2).

em segundo lugar, com a utilização de matrizes de alta densidade de SNP, possíveis mecanismos, tais como mono-ou bi-alélico alélica amplificação /eliminação, bem como cnLOH (ou adquiridas alterações UPD semelhantes) pode ser detectado, tal como ilustrado nas Figuras 8-10. Usamos CN≥2.5 ou ≤1.5 para marcar um segmento como a amplificação ou supressão. Assim, o software iria considerar qualquer segmento com CN entre 1,6 e 2,4 como cópia neutro, mas para ser conservadora, consideramos apenas as regiões que tiveram CN 1,9-2,1 como cópia neutro. O ideograma na Figura 8 mostra as regiões (em verde) onde detectados possível cnLOH num certo número de casos. Cada linha vertical representa uma amostra. Embora algumas dessas regiões foram relatados anteriormente [23], foram identificados vários novos aberrações no CRC (cromossomo 8p, 10, 11, 12, 13, 14, 16p, 17q, 19p, 21q). O cnLOH podem ser encontrados em todo o cromossoma (Figura 9), em partes do cromossoma (Figura 10, toda a p-braço e de extremidade telomérica do q-braço), ou pode também ser encontrado em combinação com exclusão de outra parte do cromossomo (Figura 11, cnLOH em parte do cromossomo 6p e eliminação em parte do cromossomo 6q).

Cada linha vertical verde mostra o LOH cópia neutra ocorrência em uma amostra.

o cnLOH ocorre em todo o cromossomo.

o cnLOH ocorre em todas 4p e peças de 4T, onde BAF = 0,25, 0,75 e CN = 2. a porção de 4T, onde BAF = 0,5 e CN = 2 mostra padrões heterozigotos normais em todas as células.

O cnLOH ocorre em 6p onde BAF = 0,25, 0,75 e CN = 2. A porção de 6q onde CN = 1 é monossomia mosaico.

Associação de anomalias citogenéticas com as características do tumor

é bem sabido que as anormalidades cromossômicas diferem em CRC pela presença ou ausência de MSI. Em nosso estudo, entre o MSI (n = 24) e MSS (n = 62) dos casos de CRC, houve diferença estatística significativa na freqüência de amplificação /exclusão em um total de 217 regiões genômicas em basicamente quatro cromossomos: chr 13, chr 17 , chr 18 e chr 20 (ver Tabela S1 para detalhes). Em casos MSS, a amplificação foi mais frequente em chr 13q e 20q chr e eliminação foi mais frequente em chr17p e chr18 em comparação com os casos MSI (ver Figura 12). Então, enquanto olha para a associação de anomalias cromossômicas com outras características do tumor, estratificamos as análises por status MSI. Analisamos também o MSS e casos MSI combinadas e os resultados foram muito semelhantes aos MSS única casos (resultados não são mostrados). comparações detalhadas de todas as regiões com amplificação e deleção em 62 amostras MSS CRC no que diz respeito a diferentes características de câncer e pacientes são apresentados na Tabela S2, S3, S4, S5, S6. Um resumo destas análises são apresentados na Tabela 3 e Tabela 4 para os casos MSS e MSI respectivamente. Entre os casos MSS (ver Tabela 3), em relação ao diagnóstico histológico, deleções em 18q12.1 e 15q15.3 foram mais frequentemente encontrados em adenocarcinoma em comparação com adenocarcinoma mucinoso, que apoia as conclusões de Kazama Y et al. [27]. Em relação à localização do tumor, alguns CIN foram exclusivos à esquerda lados CRC, incluindo a amplificação em 20q13.2 e 13q34 regiões. Quando classificação tumor foi considerado, algumas mudanças NC eram quase exclusiva para tumores de baixo grau, por exemplo eliminação na 18q21. região Deleted18q21 codificam um total de 227 transcritos (incluindo múltiplos transcritos do mesmo gene). Considerando apenas os genes com pelo menos 90% de sobreposição nas regiões de aneuploidia, havia três transcritos na 18q21 região eliminada. Essas transcrições são dos oncogenes

RAB27B

e

CCDC68

, sugerindo que a deleção desta região em casos de baixo grau pode ser um protetor mudança, reativa. Da mesma forma, a região amplificada de 13q31.1 contém transcrito a partir do gene da

SPRY2

, que está associada a microtúbulos, mas pode funcionar como um antagonista do factor de crescimento de fibroblastos (

FGF

) em células estimuladas. A amplificação do

SPRY2

em tumores de baixo grau, assim como tumores negativos dos nódulos linfáticos (veja abaixo) pode desempenhar um papel importante através da inibição da função do crescimento do tumor e invasão de

FGF

. Quando olhamos para as alterações citogenéticas associadas com o estadiamento, descobrimos que a amplificação de 20q13 e supressão de 1p35 foram mais frequentes na fase 1 tumores, em comparação com a fase 2 e 3; onde como a amplificação de 5p12 foi mais frequentemente observada em fase 2. Em relação metástases em linfonodos, várias amplificações (5p15.2, 5p13.1, 13q31.1 e 20q13.2) foram mais frequentemente encontrados em casos negativos de linfonodos em comparação com linfonodo casos positivos, possivelmente sugerindo amplificação destas regiões para ser protetor contra a metástase ganglionar. Nós também validou as alterações NC detectados a partir destes dados de matriz de SNP por PCR em tempo real, bem como rodando o produto de PCR no Agilent Bioanalyzer 2100 utilizando ADN 12000 fichas com múltiplos fragmentos amplificados (dados não mostrados). Foram selecionados dois genes para este experimento de validação –

Cyp24A1

da região 20q13.2, amplificação dos quais foi significativamente associada com metástase ganglionar e

RAB27B

contra exclusão região 18q22.2 dos quais foi significativamente associado com o grau do tumor em análises combinadas

regiões de amplificação são mostrados em vermelho.; regiões de exclusão são mostrados em azul; regiões com nenhuma mudança significativa são mostrados em verde. Cada coluna representa uma única amostra.

Comparação de achados citogenéticos em outro câncer

Foram comparadas as regiões genômicas com mudança CN identificados em nosso estudo à genómica regiões relatados por outros investigadores para ter a mudança CN em outros tipos de câncer. Estes estudos utilizaram matrizes CGH, ao invés de arrays SNP usados ​​em nosso estudo. Estudos anteriores sobre o câncer de próstata [37] – [40], o cancro do pulmão [41] – [43] e cancro do estômago [44] – [46] encontraram algumas regiões comuns de amplificação e deleção que também detectados no CRC em nosso estudo. O Diagrama de Venn na Figura 13a e mostra 13c anormalidades cromossômicas em CRC e em pelo menos um outro câncer. Havia 60 regiões comuns de amplificação e 33 regiões comuns de eliminação, respectivamente, cujas localizações são mostradas na ideograma da Figura 13b e 13d. Pode-se notar que as amplificações de 5p, 8q, 20Q e peças de 9p21 e 13q13 eram comuns a vários tipos de câncer. Da mesma forma, deleções de 8p, 17p, uma grande parte do cromossomo 18 e porções de 1p e 9p21 também eram comuns a vários tipos de câncer. Portanto medicamentos direcionados a estas regiões podem apresentar resultados promissores em vários tipos de câncer diferentes

(a) Regiões de amplificação em nosso estudo (círculo vermelho) também foram encontrados em estudos anteriores de outros cancros sólidos (círculo verde).; Vários também são conhecidos por ser regulada por drogas que são aprovados ou em desenvolvimento (círculo azul). (B) Localização das regiões comuns de amplificação em nosso estudo e estudos anteriores de outros cancros sólidos (intersecção dos círculos vermelhos e verdes na Fig. 13-A) são mostrados. (c) Regiões de exclusão em nosso estudo (círculo vermelho) também foram encontrados em estudos anteriores de outros cancros sólidos (círculo verde); Vários também são conhecidos por ser sobre-regulada por drogas que são aprovados ou em desenvolvimento (círculo azul). (D) Locais das regiões comuns de exclusão em nosso estudo e estudos anteriores de outros cancros sólidos (intersecção dos círculos vermelhos e verdes na Fig. 13d) são mostrados.

Alvos terapêuticos banco de dados corresponde

a alvos terapêuticos banco de dados (TTD) (versão 4.3.02, 7 de julho de 2011) [47] é um banco de dados acessível ao público de produtos de genes que são conhecidos por ser alvo de uma ou mais drogas. Temos procurado por genes que se sobrepunham com as regiões de ampliação significativa e exclusão em nosso estudo para identificar drogas que alvejam os genes relevantes. Um total de 1.229 genes foram identificados que residem nas 115 regiões com amplificação (100% de sobreposição com a região de amplificação em pelo menos 10% dos casos de CRC) e 920 genes foram residente identificados nas regiões 60 com deleção (100% do gene sobrepondo-se as regiões deletadas em pelo menos 10% dos casos de CRC). Os detalhes dessas regiões são apresentados nas Tabelas S8 (amplificação) e S9 (supressão).

Para genes localizados em regiões de amplificação, temos procurado por drogas que agem como antagonistas, anticorpos, ou inibidores. Encontramos um total de 29 regiões amplificadas (de 115, consulte a Figura 13a) abrigando 39 genes que estão actualmente a ser alvo de 248 medicamentos diferentes destes tipos. Pode notar-se que 20 destes regiões (em 29) também são amplificados em outros cancros. Depois de excluir os medicamentos para os quais o status de aprovação não é conhecida, ou descontinuadas em qualquer fase do teste da droga, houve um total de 69 medicamentos disponíveis (4 anticorpos, 18 antagonistas e 47 inibidores) em diferentes fases de experimentação para fins diferentes. As drogas relevantes aprovados destinados a estas regiões de amplificação são apresentados na Tabela 5 (para a lista completa, consulte a Tabela S7A).

Da mesma forma, por genes localizados nas regiões de exclusão, temos procurado por drogas que agem como ativadores , agonistas, ou indutores. Encontramos um total de 10 regiões de exclusão (de 60 identificados no presente estudo, veja a Figura 13c) abrigando 11 genes conhecidos que estão actualmente a ser alvo de 29 drogas diferentes. Pode notar-se que a deleção em todas estas 10 regiões também são encontradas noutros tipos de cancro. Depois de filtragem semelhante, como fizemos para regiões de amplificação, encontramos um total de 21 medicamentos disponíveis (1 indutor, 6 ativador e 14 agonistas) em diferentes fases de experimentação para fins diferentes (por lista completa, consulte a Tabela S7b). Apenas os medicamentos relevantes aprovados destinados a estas regiões de exclusão são apresentados na Tabela 6.

Em seguida, identificamos amplificado ou genes que ainda não foram alvo de qualquer droga conhecida na TTD excluído. A Figura 13a mostra que há mais de 40 regiões de amplificação comuns a CRC e outros cancros, o que ainda não são exploradas para o desenvolvimento de drogas. Essas regiões abrigam um total de 207 genes alvos possíveis (incluindo uma série de micro-RNAs e SNO) [dados não apresentados neste documento e serão abordados na publicação posterior]. A Figura 13c mostra também que há mais 23 regiões de exclusão comuns a CRC e outros tipos de câncer, que ainda não são exploradas para o desenvolvimento de drogas.

Nós também olhou para as drogas agonistas que têm como alvo genes, amplificação dos quais podem proteger contra metástase. Encontramos um número de genes mais frequentemente amplificados em nódulos linfáticos casos negativos do que os casos positivos de linfonodos. Depois de pesquisar na TTD para esses genes, encontramos uma série de drogas agonistas em diferentes estágios de desenvolvimento contra

Chrna4, EGFL7, GRIN1, HRH3, NTSR1, PTK6

genes. Como por exemplo, Varenciline (uma droga aprovada para cessação do tabagismo) ou AZD1446 (fase II concluída para o câncer e doença de Alzheimer) são agonistas para

Chrna4

(receptor nicotínico colinérgico) e pode ser testado se seria útil prevenir ou retardar o metástases em linfonodos no CRC.

Discussão

Nosso estudo é um dos primeiros e maiores usar tal matriz SNP de alta densidade sobre o tecido emparelhado fresco congelado (tumor e saudável) de pacientes com CCR de uma população do Sudeste asiático para identificar CIN e correlacionar estas alterações com muitos parâmetros clínicos e histopatológicos. Pela primeira vez, temos ilustrado a interpretação dos dados NC e BAF obtidos a partir destas matrizes SNP no tecido CRC para entender os diferentes mecanismos subjacentes para estes CIN. No entanto, pode notar-se que as matrizes de SNP não pode detectar translocações. anomalias cromossómicas em CRC têm sido estudados principalmente por usando CGH ou aCGH) [5] – [8], [10] – [12], [14] – [22]. Em contraste com matrizes SNP, essas plataformas precisam de células puras e não misturados para a interpretação de anormalidades genómicas e não fornecem dados BAF. No entanto, as matrizes SNP não requerem amostras puras, uma vez que os padrões de BAF indicar claramente a proporção da mistura de células (mosaicismo) no próprio tumor. Nós apresentamos alguns exemplos disso.

Usando o grande número de amostras pareadas, identificamos uma série de ampliações e deleções genômicas no tecido CRC que também foram relatados em estudos anteriores, com o mais frequentemente relatados ganhos de 20q , 13q, 7P, e 8q e perdas em 17p, 18q, 8p, 4T, e 5q [5] – [8], [10] – [12], [14] – [22]. Proporção de amostras que mostram CIN em uma região genômica específica podem variar de estudo para estudo dependendo da seleção do paciente e a resolução de regiões cytoband relatados. Por exemplo, a amplificação em 20q13.2, em nossas amostras não selecionados, foi encontrado em 24% dos casos, em comparação com 43% a 81% em outros estudos [5], [6], [14], [15]. Pode-se notar que na série de Douglas et ai. (Mostrando o ganho de 20q13.3 em 81 amostras%) incluíram apenas os CIN + casos [6]. Em nosso estudo, deleção em 18q foi encontrada em 20% dos casos, em comparação com 36% a 60% em outros estudos [5], [6], [14], [15]. Dentro de nossas amostras também, as proporções de CIN em diferentes regiões genômicas foram maiores nos casos MSS do que no MSI (ver Figura 12).

O nosso estudo sugere que certas aberrações cromossómicas pode ser correlacionada com subtipos histopatológicos para CRC, celular diferenciação, localização do tumor e metástase ganglionar, e assim que este pode ser útil no indicando tratamentos adequados e identificar genes alvos futuros para tratamentos personalizados. Como um estudo anterior [25], em tumores face esquerda, nós também identificou uma deleção em 18q12.1 (23% das amostras de nossa série). Além disso, foram identificados amplificações em 20q13.2 e 13q22 e exclusões em 8p21.3. Sem amplificações ou deleções significativas foram observadas nos tumores do lado direito dessas regiões, sugerindo que essas mudanças são específicas para CRC-esquerdo. tumores esquerda e do lado direito desenvolver através de vias diferentes: tumores com MSI são mais frequentemente encontrados no lado direito do cólon e tumores com CIN um pouco mais frequentemente encontrada no lado esquerdo [11], [28], [48] . Nosso estudo confirmou esta distribuição.

Em nosso estudo, 87% das amostras de tumor foram adenocarcinoma (a maioria localizada no cólon esquerdo) e 13% eram adenocarcinoma mucinoso (localizados principalmente no cólon direito). Descobrimos que as supressões em 15q15.3 e 15q21.1 foram associados com adenocarcinoma. Kazama et ai (2005) mostraram que os adenocarcinomas mucinosos são mais propensos a exibir, em vez de MSI CIN [27]. No entanto, carcinomas mucinosos são mais propensos a desenvolver metástases nos nódulos linfáticos e do peritoneu de adenocarcinoma [49].

Como encontrado em outros estudos [10], [16], [21], [26], [ ,,,0],29], encontramos a amplificação de 20q13.2 e supressão de 17p12 a ser comum na fase inicial I CRC, o que sugere que esses eventos ocorrem no início do CRC carcinogênese. Além disso, verificou-se a amplificação de 5p15.2 e eliminação de 1p36.21 para ocorrer em 25% dos casos I fase, o último dos quais foi previamente encontrado para ser associado com adenomas e doença fase inicial [29]. No entanto, outros investigadores têm correlacionado perdas de 18q e 19p com doença em estágio I [16].