PLOS ONE: ErbB2, EphrinB1, Src quinase e PTPN13 Sinalização complexo regula os MAP Kinase Sinalização na Cancers

Humana

Abstract

Em células não-cancerosas, proteínas fosforiladas existir, transitoriamente, tornando-se de-fosforilada por fosfatases específicas que terminam propagação de vias de sinalização. Nos cancros, a actividade de fosfatase comprometida e /ou expressão ocorrer e contribuem para o fenótipo tumoral. A fosfatase não receptora, PTPN13, recentemente tem sido chamado um supressor tumoral putativo. É menor expressão no cancro da mama correlaciona com a diminuição da sobrevida global. Aqui nós mostramos que PTPN13 regula um novo complexo de sinalização no cancro da mama consiste em ErbB2, Src e EphrinB1. Para o nosso conhecimento, este complexo de sinalização não foi descrito anteriormente. Co-imunoprecipitação e localização estudos demonstram que EphrinB1, um substrato PTPN13, interage com ErbB2. Além disso, a mutação oncogénica V660E ErbB2 aumenta esta interacção, enquanto Src quinase medeia EphrinB1 fosforilação e subsequente sinalização da MAP quinase. Diminuição da função PTPN13 melhora ainda mais a sinalização. A associação de quinases oncogénicas (ErbB2, Src), um ligando de sinalização transmembranar (EphrinB1) e um supressor de tumor fosfatase (PTPN13) sugerem que EphrinB1 pode ser um alvo terapêutico relevante em cancros da mama com mutações de activação de ErbB2 e a diminuição da expressão PTPN13.

Citation: Vermeer PD, Sino M, Lee K, Vermeer DW, Wieking BG, Bilal E, et al. (2012) ErbB2, EphrinB1, Src quinase e PTPN13 Sinalização complexo regula os MAP Kinase Sinalização em cancros humanos. PLoS ONE 7 (1): e30447. doi: 10.1371 /journal.pone.0030447

Autor: Christina Lynn Addison, Instituto de Pesquisa Hospital Ottawa, Canadá |

Recebido: 04 de agosto de 2011; Aceite: 16 de dezembro de 2011; Publicação: 18 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Vermeer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por 7R01DE018386-03 dos Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial e do Estado de Dakota do Sul Cancer Translational sub-concessão 3SB161. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ErbB2 (HER2) amplificação /sobre-expressão ocorre em 20-30% dos cancros da mama, resultando em comportamento do tumor agressivo e mau prognóstico [1], [2]. activação ErbB2 através hetero-dimerização com outros membros da família ou homo-dimerização com si (quando expressa em níveis elevados) inicia sinais intracelulares que culminam na transcrição de muitos genes que regulam a proliferação, sobrevivência, diferenciação, invasão e metástase. Desta forma, a ErbB2 desempenha um papel chave na orquestração de um fenótipo do cancro da mama agressivo [3]. O avanço de terapias-alvo, tais como trastuzumab, um anticorpo anti-ErbB2 humanizado, melhora a sobrevida de pacientes com câncer de mama HER2 [4], [5]. No entanto, a maioria dos pacientes não respondem ao trastuzumab (62-74%), abrigando

de novo

resistência; aqueles que respondem beneficiar muito com uma maior probabilidade de sobreviver ao longo de cinco anos ou permanecer tumor livre. Infelizmente, 25% dos pacientes que respondem inicialmente posteriormente falhar a terapia [6] – [9]. Como

de novo

resistência, as vias que levam à resistência trastuzumab adquiridos permanecem obscuras [10], [11]. Enquanto um progresso significativo tem sido feito na compreensão do papel de ErbB2 na iniciação do câncer de mama e progressão, a esmagadora resistência à terapia trastuzumab sugere que as vias de sinalização adicionais existem que contornar ErbB2 bloqueio mediada por anticorpos. A caracterização destas vias e, mais importante ainda, as proteínas que eles iniciam, vai definir novos alvos para intervenção terapêutica que pode re-sensibilizar os pacientes para Her2 trastuzumab e melhorar a sobrevivência.

Para além de amplificação /sobre-expressão, polimorfismos em ErbB2 no codão 655 (dentro do domínio transmembranar) estão associados com o aumento de desenvolvimento de cancro da mama em algumas populações, sugerindo que as alterações na sequência de codificação de ErbB2 podem também ter consequências funcionais associados com o cancro [12] – [14]. sequências de codificação ErbB2 pode afectar associações com proteínas parceiras e subsequentemente altera a sinalização intracelular mediadas-ErbB2. Assim, como a resistência trastuzumab, identificando essas vias será fundamental para definir terapias que bloqueiam ou contorná-los, melhorar a sobrevivência.

Enquanto as funções pró-oncogênicos dominantes como os descritos para o ErbB2 quinase no câncer de mama ocorrem frequentemente em sólidos tumores, alterações na fosfatases ocorrer da mesma forma e função como supressores tumorais. Por exemplo, o não-receptor de protea-tirosina-fosfatase, PTPN13 (também conhecido como FAP1, PTPL1, PTPLE, PTPBAS, PTP1E; PTP-BL é o homólogo de rato) [15] – [17] tem recentemente sido chamado um supressor tumoral putativo. PTPN13 é um multi-módulo que contém fosfatase. Os seus domínios de interacção proteína-proteína cinco PDZ mediar associações com muitas proteínas celulares e, como tal, sugerem que as mutações PTPN13 podem alterar uma variedade de funções celulares diferentes [18], [19]. mutações PTPN13 têm, de fato, foram identificados em colorectal [16], cabeça e pescoço [20] e cancros do fígado [17], [21]. Importante, a diminuição da expressão PTPN13 no cancro da mama correlaciona-se com a diminuição da sobrevivência geral [22]. Além disso, nós já descobriram que a diminuição da expressão PTPN13 synergizes com uma mutação activado ErbB2 transmembrana (mNeuNT) aumentar o crescimento do tumor e invasão

in vivo

[23]. Enquanto nos humanos amplificação /sobre-expressão de ErbB2 é oncogénica, em animais de activação de mutações transmembranar ErbB2 são necessários para o crescimento do tumor. Assim, os nossos

In vivo

estudos com ratos exigir a utilização de mNeuNT, uma mutação transmembranar ErbB2 constitutivamente ativo. No entanto, a conclusão de que os polimorfismos ErbB2 humanos podem afectar prevalência do cancro da mama sugere que o estudo da activação de mutações transmembranar ErbB2 em animais (na ausência de amplificação /sobre-expressão) pode ser benéfica no contexto de doença humana. Enquanto um estudo realizado por Zhu

et al.

Sugere que PTPN13 regula a função ErbB2 diretamente de-fosforilação do domínio sinal de ErbB2 [24], mas não encontramos que, em nosso sistema sugerindo que PTPN13 e ativado ErbB2 por si só pode não conta para a sinalização a jusante aumentada, crescimento tumoral, invasão e evidente nos nossos estudos publicados [23]. Nós, portanto, a hipótese de que modificadores adicionais funcionar na sinergia PTPN13 /ErbB2 observado. Nós ainda argumentou que um substrato de fosfatase PTPN13 com capacidades de sinalização pode ser uma tal molécula candidata. Assim, analisamos EphrinB1 [25].

EphrinB1 pertence a uma família de ligandos que se ligam e activam quinases de tirosina de receptor Eph. ligantes ephrin são únicos, de ligação e ativação de sinalização dos seus receptores cognatos, e eles próprios se tornem fosforilada e iniciar seus próprios cascatas de sinalização. Esta característica específica Ephrin é chamado de “reverso” sinalização. “Reverse” sinalização seguinte engajamento receptor Eph constitui a via de sinalização convencional. No entanto, Efrinas são promíscuos em suas associações e sinalização ocorre após as interacções receptor não-Ef [26], [27]. Este tipo de sinalização Ephrin é não-convencional.

Dado que EphrinB1 é um substrato de fosfatase de PTPN13, diminuição da expressão PTPN13 ou mutações PTPN13 funcionais (ambos os quais ocorrem em tumores sólidos) poderá resultar em aumento de fosforilação EphrinB1 e subsequente sinalização. No contexto do cancro da mama em que a diminuição da expressão PTPN13 correlaciona-se com a sobrevivência pobre, que define as vias activadas na ausência do PTPN13 pode identificar alvos críticos para a intervenção terapêutica e melhorar a sobrevivência. Assim, a hipótese de que a sinergia entre a diminuição PTPN13 e aumento da ativação ErbB2 que impulsiona o crescimento do tumor e invasão é mediada através EphrinB1 e, ainda, que a sinalização EphrinB1 mediada é aumentada em cancros da mama com a expressão PTPN13 comprometida. Aqui, descrevemos uma associação romance entre ErbB2 e EphrinB1. A expressão de um mutante de ErbB2 activado ou sobre-expressão de ErbB2 tipo selvagem (como em cancros da mama Her2), juntamente com a diminuição da expressão ou função PTPN13, não só aumenta a formação do complexo, mas também conduz a fosforilação e EphrinB1 sinalização a jusante associada. Neste relatório, nós caracterizar este complexo, os sinais mediados partir dele, e sua relevância para o cancro da mama. Além disso, demonstramos que este complexo existe em outras células epiteliais e sugerem que a sinalização do complexo desempenha um papel funcional em outros tumores sólidos.

Resultados

Perda PTPN13 ocorre em cancros epiteliais

Redução da expressão PTPN13 se correlaciona com a diminuição da sobrevida global no cancro da mama [22]. Nós se perguntou se essa correlação existe em todos os tipos de cânceres de mama ou se era específico para um subtipo particular. Assim, analisamos uma matriz de expressão do gene a partir de 200 cancros da mama em fase inicial e 7 amostras normais da mama para PTPN13 com particular atenção ao subtipo especificidade. Enquanto Her2, luminal A, cancros da mama luminal B e amostras normais da mama expressam níveis relativamente elevados de PTPN13, como basal (BL) tumores expressam níveis significativamente mais baixos de ARNm PTPN13 (Figura 1A, p = 0,00044 para basal vs normal). As comparações dos outros subtipos com mama normal não foram significativos. No entanto, enquanto que os níveis de ARNm PTPN13 em Her2, luminal A e cancros da mama luminal B não é diferente de mama normal, os dados não eliminam a possibilidade que PTPN13 mutações funcionais ocorrer nestes subtipos que podem resultar num fenótipo semelhante ao encontrado no seu ausência.

(a) a expressão relativa de mRNA PTPN13 de PTPN13 em tumores de mama caracterizadas molecularmente. cancro da mama expressão PTPN13 (BL) Basal-like é diminuída em relação à mama normal (p = 0,00044 para basal vs. normal). (B) Análise de Western blot de linhas celulares de cancro da mama. MDA-MB231, MDA-MB468, HCC1143, HCC1954 são linhas celulares de cancro de mama com características de câncer de mama BL. A linha de células BT474 tem Her2 /ErbB2 sobre-expressar características de câncer de mama. MCF7 e T47D são linhas celulares de cancro de mama com características luminais. células HEK293 que sobre-expressam PTPN13 serviu como um controlo positivo. linhas celulares de cancro (C) BL da mama, MDA-MB231 e MDA-MB468, expressando baixa ou alta PTPN13, respectivamente, foram analisadas por western blot. células (D) HEK293 batido para baixo para EphrinB1 (sh EphrinB1) ou de controlo foram analisados ​​por Western blot de forma estável. As células MDA-MB468 (E) foram transientemente transfectadas com um plasmídeo de direccionamento shRNA PTPN13 (shPTPN13) ou um não-silenciamento construto shRNA (não-silenciamento) e analisados ​​por Western blot das proteínas indicadas. células (F) HaCaT, uma linha celular de queratinócitos humanos, e células de UM-SCC84, uma cabeça de HPV-negativa e a linha celular pescoço carcinoma epidermóide, estavelmente bateu-se para baixo por PTPN13 (sh PTPN13) ou linhas de controlo foram analisados ​​por Western blot. células (G) HaCaT knocked-down forma estável para PTPN13 (sh PTPN13) ou sobre-expressão da proteína HPV16 E6 (PHV16 E6) ou de controlo foram analisadas por western blot para EphrinB1 fosforilada, fosforilada ERK1 /2, o total de ERK1 /2 e GAPDH. expressão

também examinamos PTPN13 proteína em sub-tipo de linhas celulares de cancro da mama definido [28]. Enquanto expressão PTPN13 variou entre linhas celulares, três em cada quatro das linhas de células BL testados exibiram proteína PTPN13 quase ausente (Figura 1B). Os tumores BL formam um grupo heterogêneo de cancros, mas, em geral, são tumores agressivos com um prognóstico pobre [29]. Assim, nossos resultados são consistentes com os de Revillion

et al

correlacionar a diminuição da expressão PTPN13 e sobrevida global pobres [22]. Estes dados suportam a hipótese de que a perda de PTPN13 impactos expressão fenótipo tumor e sugerem que PTPN13 desempenha um papel na regulação epitelial proliferação, migração e /ou invasão no câncer de mama BL.

PTPN13 perda aumenta fosforilada EphrinB1 e ERK1 /2

cinco domínios PDZ

o PTPN13 mediar associações com muitas proteínas, incluindo EphrinB1 [19]. Após a ligação, PTPN13 de-fosforila EphrinB1, desligando sinalização reversa [18], [19]. Para testar os efeitos de diminuição da /perdido PTPN13 em EphrinB1 fosforilação, examinámos duas linhas celulares de cancro da mama BL: MDA-MB231, que expressam a proteína PTPN13 quase indetectável, e MDA-MB468, que expressam a proteína PTPN13 endógena (Figura 1B). Como esperado, a baixa expressão PTPN13 (MDA-MB231) correlaciona-se com o aumento da EphrinB1phosphorylation enquanto que a expressão endógena PTPN13 (MDA-MB468) correlaciona-se com baixo fosfo-EphrinB1 (Figura 1C). Estes dados são consistentes com EphrinB1 ser um substrato de fosfatase PTPN13 e sugerem que a diminuição da expressão PTPN13 em linhas celulares de cancro da mama aumenta BL fosforilação de EphrinB1.

Dada a capacidade do EphrinB1 para sinalizar, pedimos ainda se EphrinB1 fosforilada correlacionada com aumento de sinalização a jusante. A análise molecular de carcinomas da mama BL mostra que muitos produtos de gene do cluster BL estão associados com a activação de MEK /ERK e, assim, nós escolhemos para analisar o estado de fosforilação de ERK1 /2 nestas linhas celulares BL [30] – [33]. Descobrimos que diminuiu /ausente expressão PTPN13 (MDA-MB231) correlaciona-se com o aumento da fosforilação de ERK1 /2 (Figura 1C); enquanto que a expressão endógena PTPN13 (MDA-MB468) correlaciona-se com a diminuição da ERK1 /2 fosforilação. Estes dados sugerem que a activação EphrinB1 (fosforilação) de sinais através da via da MAP-cinase. Para testar isso, de forma estável knocked-down EphrinB1 em células HEK293, escolhidos devido à sua facilidade de transfecção em relação a linhas celulares de cancro da mama. Knock-down dos resultados EphrinB1 na atenuação proeminente de fosforilada ERK1 /2 (Figura 1D) de acordo com EphrinB1 mediada Erk1 2 activação /. Tomados em conjunto, os dados sugerem que a ausência de PTPN13 resulta em activação aumentada e EphrinB1 concomitante ERK1 /2 fosforilação.

Como um teste adicional, endógena PTPN13 foi transitoriamente bateu-se nas células MDA-MB468 (shRNA mediada , shPTPN13). Como previsto, PTPN13 knock-down aumento da fosforilação de EphrinB1 coerente com o Regulamento PTPN13 de EphrinB1 fosforilação (Figura 1E) [25]. Além disso, o aumento da EphrinB1 associada com ErbB2 em lisados ​​de células shPTPN13 sugerindo que associa mais facilmente EphrinB1 fosforilados com ErbB2 em comparação com EphrinB1 não fosforilada. Surpreendentemente, PTPN13 knock-down não afectou ERK1 /2 fosforilação, sugerindo que quer EphrinB1 não sinalizar através da via da MAP cinase em células MDA-MB468 ou que a sinalização é modulada nestas células através de adicional (como ainda indefinidos) componentes.

as tentativas anteriores de nosso laboratório para sobre-expresso PTPN13 foram mal sucedidos como os seus resultados aumentados de expressão na morte celular, limitando assim a nossa capacidade de analisar os seus efeitos a jusante [34]. Portanto, não fomos capazes de testar os efeitos da sobre-expressão PTPN13 em células MDA-MB231 que carecem de expressão endógena. No entanto, dada a sua influencia sobre a fosforilação EphrinB1 em células de cancro da mama, especulamos que a redução na expressão ou função pode ser um PTPN13 comum e, mais importante ainda, uma alteração de chave em outros cancros epiteliais. Para testar este conceito, nós knocked-down PTPN13 em uma linha de células de queratinócitos humanos (células HaCaT) e analisados ​​seus efeitos sobre a sinalização. Diminuição da expressão PTPN13 EphrinB1 fato reforçada e ERK1 /2 fosforilação (Figura 1F, HaCaT). Da mesma forma, knock-down de PTPN13 na cabeça e pescoço linha de células escamosas carcinoma de células, UM-SCC84, resultou no aumento EphrinB1 e Erk1 2 fosforilação /(Figura 1F, UM-SCC84). Importante, estudos anteriores focada em vírus do papiloma humano (HPV) tipos de cancro da cabeça e pescoço -associated demonstrar que se liga a oncoproteína de HPV16 E6 e tem como alvo para degradação PTPN13 [34], [35]. Assim, as células positivas de HPV serviu como um ensaio adicional da função de PTPN13 na sinalização celular no contexto de

viralmente cancro mediada. Assim, analisamos anteriormente caracterizados rato amígdala células epiteliais de forma estável expressão HPV16 E6 ou aqueles estavelmente knocked-down para PTPN13 [34], [35]. Na verdade, a expressão HPV16 E6 reforçada EphrinB1 e Erk1 2 fosforilação /, consistente com a diminuição /perdido expressão PTPN13. Além disso, knock-down de PTPN13 em rato amígdalas células epiteliais demonstrou um efeito semelhante (shPTPN13, Figura 1G). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a diminuição da expressão PTPN13 aumenta EphrinB1 e ERK1 /2 em células epiteliais de fosforilação. A constatação de que os vírus de HPV de alto risco desenvolveram um mecanismo para eliminar PTPN13 celular, enfatiza ainda mais a importância das funções de regulação PTPN13 críticos em vias de sinalização celular. Os dados sugerem que a expressão PTPN13 pode ser interessante para avaliar em muitos, se não todos, os tumores sólidos.

ErbB2 co-imunoprecipitados e co-localiza com EphrinB1

Os dados acima sugerem que a diminuição /PTPN13 perdido aumenta a activação EphrinB1 que pode, em seguida, a jusante modulam a fosforilação de ERK1 /2. Nosso laboratório tem demonstrado anteriormente que a diminuição /perdido PTPN13 synergizes com ErbB2, potencializando MAP Kinase sinalização [23]. Assim, nos perguntamos se a fosforilação EphrinB1 ea sinalização ERK1 /2 resultante ocorre de forma mediada por ErbB2, não-convencional. Por isso, perguntou se EphrinB1 associados com ErbB2 e completou co-precipitação e estudos de co-localização. Descobrimos que EphrinB1 e co-precipitado de ErbB2 (figura 2A) a partir de lisados ​​derivados de linhas celulares de cancro da mama, bem como células HaCaT. Curiosamente, knock-down de PTPN13 em células HaCaT (shPTPN13) reforçada pull-down de EphrinB1 com ErbB2, sugerindo novamente que os associados EphrinB1 fosforilada mais facilmente com ErbB2 que o estado não fosforilada. Além disso, em todos os casos várias formas de EphrinB1 foram puxados para baixo com ErbB2 (setas Figura 2A). Nós especulamos essas bandas representam diferentes formas fosforilada, como sugerido por Xu

et al

. No seu estudo, a mutação de resíduos de tirosina EphrinB1 resulta na perda específica de bandas EphrinB1 sugerindo que as bandas evidentes por western blot representam formas fosforiladas da proteína [36]. Alternativamente, as bandas podem representar EphrinB1 não glicosilada ou degradados como sugerido por Makarov

et al

[37]. Embora a identidade destas bandas é indefinido no presente estudo, os anticorpos diferentes EphrinB1 verificada a sua co-imunoprecipitação com ErbB2 (dados não mostrados). Importante, enquanto quantidades variáveis ​​de ErbB2 foram puxados para baixo em todos os lisados ​​testados (consistente com as suas diferentes níveis de expressão de ErbB2), uma quantidade similar de EphrinB1 foi associado a ele. Estes dados sugerem que existe um limite para a quantidade de EphrinB1 que se associa com ErbB2; mais expressão ErbB2 não resulta em aumento da associação EphrinB1. Estes dados sugerem que a interacção é fortemente regulada.

(A) análise de transferência de Western de uma linha celular de queratinócitos humanos, células HaCaT (controlo, bem como células bateu-se para baixo por PTPN13), e linhas celulares de cancro da mama ( MCF7, BT474, HCC1953) imunoprecipitada (IP) para ErbB2 e Immunoblot (IB) para EphrinB1. Membrana foi re-sondado para ErbB2. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (B)

en face

imagens confocal de células HaCaT immunolocalizing ephrinB superfície (verde) e ErbB2 total (vermelho). Os núcleos são contrastadas com DAPI (azul). Barra de escala 20? m. (C) Análise de Western blot de linhas celulares de cancro da mama: T47D, BT474 e MCF7. (D) As células HEK293 transientemente transfectadas com o tipo selvagem ou o mutante PTPN13 C /S PTPN13 analisado por western blot. (E) células HEK293 transientemente transfectadas com eGFP quer isoladamente, ou uma combinação de EphrinB1, ErbB2 (do tipo selvagem ou mNeuNT), e PTPN13 (do tipo selvagem ou C /S mutante) e analisados ​​por Western blot. (F)

En rosto

imagens confocal de células transfectadas em E processados ​​para imunolocalização de ephrinB fosforilada (verde) e ErbB2 (vermelho). Núcleos contrastadas com DAPI (azul). Barra de escala 20? m.

Co-imunocoloração de ErbB2 endógena e endógena, ephrinB superfície em células HaCaT mostra que ErbB2 e ephrinB co-localizar nas junções célula-célula (Figura 2B). Superfície ephrinB foi localizada em células não fixadas, utilizando unpermeabilized EphB1-Fc. EphB1-Fc é uma quimera que consiste em a região extracelular do receptor EphB1 (um receptor cognato ephrinB) fundidos à IgG humana

1. Assim, EphB1-Fc liga-se à superfície ligandos ephrinB expressas. Estas interacções são, em seguida, detectados utilizando um anticorpo anti-IgG humana de células-FITC e analisadas por microscopia confocal. Assim, enquanto que a coloração da superfície não é específico para EphrinB1alone, ela sugere que as proteínas ephrinB co-localizam com ErbB2. Juntamente com os dados de imunoprecipitação, estes dados sugerem que EphrinB1 associados com ErbB2

Para avaliar a significância do ErbB2 /interacção EphrinB1 no cancro da mama, que ainda analisados: BT474, uma linha celular Her2 (ErbB2);. T47D, uma linha celular luminal com expressão alta ErbB2; MCF7, uma outra linha celular luminal com baixa expressão de ErbB2 (Figura 1B). Curiosamente, ambos T47D e MCF7 expressam quase indetectável PTPN13, enquanto que as células BT474 expressar PTPN13 endógena (Figura 1B). A imunoprecipitação para ErbB2, seguida por análise de Western blot para EphrinB1 demonstra reforçada EphrinB1 co-PI em células T47D que está correlacionado com níveis mais elevados de EphrinB1 fosforilada. Este resultado é consistente com os nossos dados anteriores sugerindo que os associados EphrinB1 fosforilada mais facilmente com ErbB2. Além disso, as células T47-D demonstraram fosforilação robusta de ERK1 /2, que não foi detectada em células BT474 e MCF7 (Figura 2C). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que em linhas celulares de cancro da mama com expressão baixa /PTPN13 ausente, e a alta expressão de ErbB2, EphrinB1 fosforilação é elevado como é a sua associação com ErbB2 e correlaciona-se com reforçada ERK1 /2 fosforilação. Os dados sugerem ainda que a falta de efeito na ERK1 /2 fosforilação em células MDA-MB468 shPTPN13 (Figura 1E) pode ser devido à expressão de ErbB2 insuficiente e /ou a formação do complexo com EphrinB1.

mNeuNT aumenta a formação do complexo e a sinalização

Dado que ErbB2 é uma tirosina quinase e fosforilação EphrinB1 inicia a sinalização inversa, nos perguntamos se ErbB2 fosforila EphrinB1. Além disso, dada a sua influencia sobre EphrinB1 fosforilação, nós especulamos que PTPN13 regula essa ativação. Para examinar esta, tanto de tipo selvagem PTPN13 (PTPN13

em peso), bem como uma fosfatase mutante nulo (PTPN13

C /S) foram testados. Além disso, os nossos resultados anteriores demonstram que um mutante constitutivamente activo de ErbB2 transmembranar (V660E, daqui em diante referido como mNeuNT) sinergiza com perda de PTPN13 e aumenta a sinalização MAP quinase e crescimento invasivo enquanto que o tipo selvagem (endógeno) não ErbB2 [23]. Portanto, tanto mNeuNT ErbB2 e de tipo selvagem (wt ErbB2) foram também testados. Dada a sua baixa expressão endógena de PTPN13, facilidade de transfecção e expressão robusta de PTPN13 transfectadas, células HEK293 que foram utilizados para estes estudos (Figura 2D). Nestas experiências as células HEK293 foram transfectadas transitoriamente com ErbB2 (quer de tipo selvagem ou mNeuNT), EphrinB1 tipo selvagem e PTPN13 (quer de tipo selvagem ou o mutante S /C) e analisadas por western blot.

lisados ​​de controlo (EGFP) mostram que EphrinB1 co-imunoprecipitados com ErbB2, mas que não é fosforilada EphrinB1 e ERK1 /2 não é activado (pista 1, Figura 2E). Expressão de nem de tipo selvagem (pista 2, Figura 2E), nem C /S PTPN13 (pista 4, Figura 2E) muda estes parâmetros na presença de sobre-expressa ErbB2 em peso e EphrinB1. Em contraste, a expressão de mNeuNT com EphrinB1 aumenta não só a quantidade de EphrinB1 associar com ele, mas também leva a EphrinB1 e Erk1 fosforilação 2 /(pistas 3 e 5, A Figura 2E). células HEK293 que expressam pouco ErbB2 endógena (dados não mostrados); Além disso, o anticorpo anti-ErbB2 utilizado para a precipitação imunitário reconhece tanto de tipo selvagem e de ErbB2 mNeuNT. Assim, enquanto os estudos de co-IP não pode distinguir entre EphrinB1 associada com ErbB2 endógena ou mNeuNT, os dados apoiam fortemente uma associação mNeuNT. Embora se tenha anteriormente demonstrado que sozinho expressão mNeuNT aumenta Erk1 2 fosforilação /[23], a nossa descoberta de que a expressão de PTPN13

C /S não é capaz de reduzir EphrinB1 e ERK1 /2 phosphoryaltion, sugere que EphrinB1 mediada sinalização inverso também contribui para a ERK1 /2 fosforilação (Figura 2E, pista 5, setas). Além disso, a expressão de tipo selvagem PTPN13 (pista 3, Figura 2E), mas não C /S mutante PTPN13 (pista 5, Figura 2F), diminui a quantidade de EphrinB1 fosforilada e P-Erk -1/2, também consistente com EphrinB1 fosforilação afetando sinalização MAP Kinase.

Estes dados bioquímicos foram confirmados por estudos de imunolocalização de fosforilada ephrinB (Figura 2F, verde) e ErbB2 (Figura 2F, vermelho). Apenas expressão de mNeuNT resultados em fosforilada ephrinB presente na superfície da célula (Figura 2F, os painéis 3 e 4, a expressão amarelo indica co-localização de fosforilada ephrinB e ErbB2). Além disso, apenas PTPN13 tipo selvagem diminui a quantidade de ephrinB fosforilada na superfície celular (Figura 2F, comparar amarelo e verde entre os painéis 3 e 4). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que, 1) mNeuNT associados com EphrinB1 e esta associação é reforçada com EphrinB1 fosforilação, 2) EphrinB1 fosforilada correlaciona-se com a fosforilação de ERK1 /2 e 3) que fosforila PTPN13 de-EphrinB1 neste contexto.

mNeuNT co-imunoprecipitados com e ativa Src

sinalização mediada-ErbB2 ocorre diretamente através de sua atividade quinase ou por seu recrutamento de Src em uma sinalização complexo [38]. Além disso, após ligação ao seu receptor cognato Ef, Src fosforila EphrinB1 [25]. Uma vez que tanto o tipo selvagem e de ErbB2 mNeuNT contêm um domínio tirosina-cinase de tipo selvagem, a hipótese de que a fosforilação EphrinB1 reforçada e sinalização das MAP Quinases evidente no contexto da diminuição /perdido PTPN13, envolve Src. Assim, em primeiro lugar estabelecido para determinar se Src associados com ErbB2, como sugerido pela literatura [38]. As células HEK293 foram transfectadas transientemente com o tipo selvagem ou ErbB2 mNeuNT e testado. Embora a co-IP de Src de tipo selvagem activado com ErbB2 foi quase indetectável, activado Src associada com mNeuNT (Figura 3A). O anticorpo anti-Src activado reconhece Src tirosina 416 (pSrc-Y416), quando fosforilada, um site que promove a atividade Src [39], [40]. Estes dados sugerem que os associados mNeuNT com Src activada.

(A), células HEK293 transientemente transfectadas com ErbB2 quer de tipo selvagem ou mNeuNT e analisados ​​por Western blot. (B) As células HEK293 transientemente transfectadas com uma combinação de EphrinB1, mNeuNT, e PTPN13 (do tipo selvagem ou C /S mutante) foram tratados com ou sem PP2 e analisados ​​por Western blot. células (C) untransfected HEK293 tratados com doses crescentes de saracatinib e analisadas por western blot para expressão de activada endógena Src, o total de Src, EphrinB1 fosforilada e imunoprecipitadas EphrinB1.

Src medeia EphrinB1 fosforilação

Ambos mNeuNT Src e quinases são, cada um dos quais pode fosforilam EphrinB1. Além disso, mNeuNT preferencialmente associa com Src activada (Figura 3A). Por isso, testámos se Src activado (em vez de mNeuNT) medeia EphrinB1 fosforilação. As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente com mNeuNT, EphrinB1 e quer de tipo selvagem ou mutante (C /s) PTPN13 e analisados ​​por Western blot. Consistente com os dados anteriores, mNeuNT co-ips com Src activada e EphrinB1 é fosforilada (Figura 3B, pista 1); PTPN13

C /S aumenta EphrinB1 fosforilação (Figura 3B, pista 3). Para testar o papel da Src em EphrinB1 fosforilação, as células transfectadas foram tratadas com PP2, um inibidor potente de Src. Xu

et al

anteriormente demonstrado que o tratamento com 1 PM PP2 eficiente blocos mediada por Src fosforilação EphrinB1 enquanto o tratamento com 25 um PP2 resulta em separação celular [36]. Assim, no presente estudo para garantir a inibição de Src eficiente, as células foram tratadas com 10? M PP2 para um curto período de tempo (4 horas). Em mNeuNT, EphrinB1 tipo selvagem e transfectadas PTPN13 lisados, PP2 tratamento diminuiu a quantidade de Src activado associada com mNeuNT e atenua EphrinB1 fosforilação (Figura 3B, pista 2). Lisados ​​de mNeuNT, EphrinB1 e PTPN13

C /células S transfectadas foram igualmente afetados por PP2 sugerindo que a fosforilação EphrinB1 dentro do complexo mNeuNT, Src, PTPN13 é mediada através de Src. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que Src, em vez de mNeuNT, fosforila EphrinB1 e mais suporta a literatura publicada e as nossas próprias conclusões que PTPN13 é responsável por-de fosforilação EphrinB1 neste complexo.

PP2 é um Src familiar inibidor de cinase, bloqueio da activação da Lck, Fyn, Hck e Src. Além disso, as experiências realizadas utilizando PP2 utilizadas células HEK293 que sobre-expressam PTPN13, ErbB2 e EphrinB1. Assim, para inibir selectivamente mais Src e para testar a sua função na fosforilação de EphrinB1 endógena, também analisamos saracatinib (AZD-0530, actualmente em ensaios clínicos [41] – [44]) em células não transf ectadas. As células HEK293 foram tratados com saracatinib (0, 0,25 ou 1,0 uM) e analisados ​​por Western blot. Saracatinib tratamento inibiu com sucesso a activação de Src e uma resposta à dose foi evidente. Além disso, na dose mais elevada, houve uma diminuição na quantidade de fosforilação EphrinB1 (Figura 3C) consistente com um papel na mediação de Src EphrinB1 fosforilação.

EphrinB1 imunoprecipitados com ErbB2 em uma forma que não necessita o PDZ extracelular ou C-terminal motivo

Nossos dados sugerem que a regulação do complexo ErbB2 /EphrinB1 pode mediar sinais importantes no câncer de mama. Dado que ErbB2 e EphrinB1 interagir, design racional de inibidores de pequenas moléculas para bloquear sua associação pode ser de valor terapêutico. Assim, ErbB2 e EphrinB1 mutantes foram gerados para definir os domínios necessária e suficiente para a sua associação.

ErbB2 contém dois domínios extracelulares grandes que designadas domínios 1 e 2. Os mutantes extracelulares de ligação ao ligando de ErbB2 excluído de qualquer um dos domínios de ligação ao ligando 1 (Δ LBD1 1-174) ou ambos os domínios 1 e 2 (Δ LBD2 1-487) foram gerados. domínio de ligação PDZ de ErbB2 foi excluído num terceiro mutante (Δ PDZBD 1251-1255) (Figura 4A). Todos os mutantes ErbB2, incluindo a proteína de comprimento completo de tipo selvagem, foram HA etiquetado na extremidade N-terminal. As construções foram transfectadas em células HEK293 e analisados ​​para a perda de co-IP com EphrinB1 endógena.

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