Abstract

Fundo

O câncer colorretal (CCR) é a segunda principal causa de mortes por câncer, apesar do fato que a detecção de cancro da presente nos estágios iniciais resulta na taxa de sobrevivência de mais de 90%. Atualmente, menos de 45% dos indivíduos em situação de risco em os EUA forem rastreadas regularmente, expondo a necessidade de melhores testes de triagem. Foram realizados dois estudos caso-controle para validar um teste à base de sangue que identifica DNA metilado no plasma de todas as fases do CRC.

Metodologia /Principais Achados

Usando um ensaio de PCR para análise de

Septin 9

(SEPT9) hipermetilação em DNA extraído de plasma, desempenho clínico foi otimizado em 354 amostras (252 CRC, 102 controles) e validado em um estudo cego, independente de 309 amostras (126 CRC, 183 controles). também foram avaliados 168 pólipos e 411 controlos de doença adicionais. Com base no estudo da formação de classificação baseado em SEPT9 detectado 120/252 CRCs (48%) e 7/102 controlos (7%). No estudo de teste CRCs 73/126 (58%) e 18/183 amostras de controlo (10%) foram positivos para SEPT9 validar os resultados do conjunto de treinamento. A inclusão de uma réplica de medição adicional aumentou a sensibilidade do ensaio no conjunto de teste a 72% (90/125 CRCs detectadas), mantendo a especificidade de 90% (19/183 para controles). taxas positivas para plasmas de outros cancros (11/96) e condições não-cancerosas (41/315) foram baixos. A taxa de detecção de pólipos ( 1 cm) foi ~ 20%

Conclusões /Significado

Análise de metilação do DNA SEPT9 no plasma representa um método simples e minimamente invasivo para detectar todas as fases da. CRC com potencial para satisfazer necessidades não atendidas para uma maior adequação na população de triagem. Mais testes clínica é justificada

Citation:. Grützmann R, Molnar B, Pilarsky C, Habermann JK, Schlag PM, Saeger HD, et al. (2008) detecção sensível de câncer colorretal em sangue periférico por Septin 9 DNA metilação de Ensaio. PLoS ONE 3 (11): e3759. doi: 10.1371 /journal.pone.0003759

editor: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de agosto de 2008; Aceito: 21 de outubro de 2008; Publicação: 19 de novembro de 2008

Direitos de autor: © 2008 Grützmann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi patrocinado pela Epigenomics AG, Berlin. O patrocinador do estudo participaram no desenho do estudo e da análise das amostras. Interpretação dos dados e redação do papel, bem como a decisão de enviá-lo para publicação foi realizada pelas todos os autores, incluindo os autores empregados pelo patrocinador

Conflito de interesses:. Fabian modelo, Volker Liebenberg, Theo Devos, Xiaoling Song, Robert H. Dia, Andrew Z.Sledziewski e Catherine Lofton-Day são empregados na Epigenomics, o patrocinador do estudo.

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos a maioria das neoplasias comuns encontrados em homens e mulheres nos Estados Unidos. A American Cancer Society tinha estimado que 154.000 novos casos de CRC iria ocorrer em 2007, resultando em mais de 52.000 mortes. Os programas de rastreio para a identificação de condições CRC fase inicial e pré-neoplásicas pode melhorar significativamente a evolução da doença por causa do benefício do tratamento da detecção precoce [1]. procedimentos de triagem não-invasivos atuais não são muito eficazes, uma vez que exigem a adesão do paciente a amostra de fezes auto-coleta analisada anualmente para a presença de sangue oculto (FOBT) [2]. Até à data, as melhorias em testes, tornando-os mais sensíveis e mais amigável não aumentaram o cumprimento na triagem CRC fezes-based. testes de rastreio invasivos como a colonoscopia ou sigmoidoscopia, embora mais eficaz, requerem uma preparação extensa do intestino, invasão de privacidade, e sedação, e não superar questões de conformidade atuais no CRC rastreio. Há uma crescente expectativa de que a nova geração de testes de rastreio baseados em biomarcadores moleculares presentes no sangue deve melhorar a adesão do paciente na triagem CRC como evidenciado pelo sucesso de outros programas de rastreio, tais como colesterol /lipídios e antígeno prostático específico (PSA) [5] – [7].

Determinação de eventos epigenéticos é um forte candidato para a detecção precoce da doença pois a regulação da expressão gênica por metilação do DNA aberrante é um evento bem caracterizada na biologia tumoral [8], [9], e é extensamente descrita em CRC [10] – [12]. Aumento dos níveis de ADN metilado livre circulante-no sangue de pacientes com cancro, em comparação com controlos saudáveis ​​foram relatados [13], [14]. Diversos laboratórios relataram também de ADN de marcadores candidatos promissores à base de metilação para a detecção de CRC [15] – [19]. Traduzindo esses candidatos marcador em testes viáveis ​​clinicamente validados e comercialmente tem sido extremamente lenta e inadequada. Para facilitar melhorias na tradução biomarcador medicina Pepe

et al.

Propôs um processo sistemático para validação de biomarcadores para a detecção precoce do câncer com 5 fases distintas, cada fase proporcionando maior nível de evidência de validação marcador [20]. Em um estudo inicial que apresentou o primeiro nível de evidência que SEPT9, um biomarcador baseado em metilação do DNA, discrimina de forma eficaz CRC a partir de amostras normais [21]. O gene Septin 9 pertence a uma classe de GTPases envolvido em numerosos processos celulares [22] .A gene tem sido demonstrado ter múltiplos transcritos de splicing alternativo que codifica pelo menos 5 polipéptidos caracterizados designado V1-V5 [23], alguns dos quais têm sido associados com câncer. O rácio de expressão e V4 V4 *, proteínas idênticas codificados por diferentes transcritos, foi mostrado para ser alterada no cancro do ovário com v4 sendo a forma predominante expressa em células normais e V4 * expressa em tumores [24]. Estudos recentes da isoforma V1 sugerem que a sobre-expressão deste polipéptido pode promover a progressão do tumor no tecido mamário [25]. O nosso trabalho anterior descreve a metilação aberrante da região promotora da transcrição V2 indica que a metilação nesta região está associada com cancro colorrectal [21]. Avançando no processo de proposta por Pepe

et al

, neste relatório nós fornecemos o segundo nível de evidência, apresentando resultados de validação do ensaio clínico para SEPT9 em dois grandes conjuntos de plasma independentes demonstrando o potencial deste marcador para detecção precoce do CRC. O aumento do número de repetições do ensaio testados resultou em elevada sensibilidade para CRC com excelente especificidade em controlos saudáveis. A especificidade foi ainda avaliada num certo número de controlos de doença. Finalmente, a metilação SEPT9 de lesões pré-malignas é relatado.

Métodos

Os pacientes

700 amostras de pacientes coletadas em 9 locais foram medidos no estudo da formação. É incluiu doentes com todas as fases do cancro colo-rectal, indivíduos sem doenças do cólon conforme verificado por colonoscopia, controlos de doença adicionais e um número de pacientes com pólipos adenomatosos (Tabela 1). Um subconjunto de 354 amostras (apenas CRCs e normais com medição completa SEPT9) foi usado para gerar o algoritmo conjunto de treinamento. O estudo consistiu de teste de 547 amostras de doentes (um subconjunto de 309 CRCs e normais com medição completa SEPT9 foi usada como um conjunto de ensaio) recolhidas em 14 locais e incluiu categorias de amostras clínicas semelhantes como utilizado no estudo da formação. controlos de doença adicionais foram coletadas de indivíduos com cancros não-colorretais e várias doenças não-cancerosas para testes de especificidade adicional. Nem todos esses assuntos foram verificados com a colonoscopia como CRC-e /ou adenoma-free. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo que aderem às diretrizes éticas locais.

Todos os pacientes com câncer e controles saudáveis ​​matriculados em ambos os estudos foram pelo menos 40 anos de idade com uma preferência para os pacientes de 50 anos ou mais e derivada predominantemente a partir das mesmas clínicas. Todos os participantes tinham nem uma história pessoal de HIV, HBV ou HCV ou história prévia de câncer com exceção do carcinoma basocelular, nem sintomas de doença crônica aguda nem agravada grave.

O sangue de todos os participantes foi elaborado quer antes ou mais de 2 dias e até 6 meses após a colonoscopia e antes de se iniciar qualquer tratamento específico do cancro. diagnóstico de câncer foi confirmado histologicamente da peça cirúrgica e apenas adenocarcinomas foram incluídos neste estudo.

fluxo de trabalho de processamento da amostra

Um fluxo de trabalho de 3 partes foi desenvolvido para o teste SEPT9 (Figura 1). Extração de DNA: Free-flutuante que circula DNA foi extraído do plasma, utilizando o grande volume kit de extração de DNA total Ácido Nucleico (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) e um dispositivo de Roche MagNaPure. Oito ou 16 ml de plasma foram distribuídas em poços MagNaPure (1 mL por cavidade), extraiu-se a seguir o protocolo do kit, e o ADN foi eluído em aliquotas de 100 uL. Os eluatos a partir de cada paciente foram reunidas e concentradas para um volume final de 100 ul utilizando Microcon YM-30 (filtros Millipore). Uma alíquota de 5 ul de cada amostra foi retida para medir o ADN genómico total, utilizando o ensaio de PCR em tempo real (CFF1) descrito na Tabela Suplementar S1. Tratamento com bissulfito: As amostras de ADN foram concentrado tratado com bisulfito usando métodos para alcançar a conversão máxima e a recuperação de ADN [35]. Uma alíquota de 5 ul de cada amostra foi retida para medir o ADN total tratado com bisulfito, utilizando o ensaio de PCR em tempo real (HB14) descrito na Tabela Suplementar S1. Tempo real A análise de PCR: O SEPT9 tempo real ensaio de PCR é desenhado em torno do local de início da transcrição do transcrito V2. O processo de sequências de ensaio em tempo real, as condições de ciclismo e controle de qualidade são descritos no texto complementar S1 e Suplementar Figura S1. Para totais bissulfito convertido medições de ADN genómico total e, por PCR foi realizada em uma diluição de 1:10 (em tampão de eluição) dos respectivos materiais. Para medições SEPT9 em amostras, as reacções foram realizadas em 10-12,5 ul de ADN não diluído dependendo experimento. A PCR foi realizada utilizando o dispositivo Roche LightCycler 2.0 com o mestre de mistura FastStart DNA mestre HybProbe (Roche Applied Science). Cada execução PCR incluiu uma curva de DNA padrão preparada com bissulfito tratado CpGenome Universal metilado DNA (Millipore (Chemicon), Billerica, MA) em concentrações entre 50 pg /rxn-20 ng /rxn. Cada ensaio também incluiu um controlo sem modelo que foi deixado destapado durante todo o processo para controlar a contaminação, e 3 controlos não moldes que foram utilizadas para estabelecer a linha de base da reacção de PCR. As amostras foram executados como capilares individuais em cada run PCR e repetições foram realizadas em PCR em separado é executado. curvas de amplificação para cada reação foram verificados manualmente por 2 revisores independentes.

O diagrama mostra as principais etapas de processamento da amostra e de fluxo de trabalho de laboratório. Ele mostra que as amostras de controlo de processo são introduzidos no fluxo de trabalho e o que os ensaios foram usados ​​para medir a saída de cada etapa do processo. caixas cinzentas indicam teste definir etapas de fluxo de trabalho específicas.

A análise dos dados

As amostras dos pacientes para o estudo da formação e teste foram agrupados de acordo com o diagnóstico e sexo e distribuídos aleatoriamente em lotes de extração de DNA. Além disso amostras do estudo de teste eram cegos antes do processamento na análise de laboratório e dados. Em tempo real A análise de PCR quantitativa de amostras de plasma foi realizada como descrito anteriormente e medições repetidas se a média. [21] teste do Qui quadrado foi utilizada para comparar as taxas de detecção entre diferentes locais de tumor, a idade, sexo e estádio do tumor. teste de Wilcoxon-Mann-Whitney e teste de Kruskall-Wallis foram utilizados para comparar quantitativamente concentrações metilados Septin 9 de ADN entre diferentes locais do tumor, idade, estágio do tumor e sexo. intervalos de confiança para proporções de amostras detectadas foram de 95% e com base na distribuição binomial. Todos os valores P são frente e verso.

Resultados

O objetivo deste estudo foi validar o uso de SEPT9 hipermetilação como um biomarcador para o câncer colorretal, determinando o classificador ideal usando um conjunto de amostras (estudo de formação) e confirmando o classificador selecionado em um conjunto de amostras independentes (estudo de teste). Cada amostra de plasma foi processado usando um fluxo de trabalho de três etapas descrito na Figura 1. O processo de fluxo de trabalho foi cuidadosamente monitorizada com adição de controlos positivos e negativos em cada passo do processo e as amostras individuais foram aceites para análise final, depois de passar especificações do controlo de qualidade (ver texto complementar S1).

estudo de formação

os parâmetros demográficos e clínicos dos sujeitos incluídos no estudo formação estão descritos na Tabela 1. Trezentos e cinquenta e quatro câncer colorretal e amostras de controlo normais foram incluídos no a análise de dados primários. Os dados do estudo formação foi analisada qualitativamente, onde uma reação SEPT9 foi chamado positivo se foi detectada uma curva de PCR distinta. Cada amostra de plasma foi medida em três reacções de PCR independentes e com base na análise de desempenho clínico, as amostras dos doentes foram classificados como positivos se duas das três repetições foram chamados PCR positivo. Com base neste algoritmo qualitativa medimos uma sensibilidade de 48% para o cancro colo-rectal e uma especificidade de 93% para as amostras verificou-colonoscopia de doenças não-colorrectais. Como alternativa, determinou-se limiares ideal com base na análise quantitativa do marcador SEPT9. Esses algoritmos quantitativos não melhorou o desempenho geral do marcador (ver Tabela S2 Suplementar). Usando a análise qualitativa, foram analisadas as correlações entre a detecção do cancro colorectal e diferentes parâmetros clínicos. Não houve diferença significativa na taxa de detecção por localização do tumor, idade ou sexo. câncer colorretal estágio inicial foram detectados a taxas ligeiramente mais baixas (43%) do que os cancros em fases avançadas (55%), mas a diferença não foi significativa. Também não houve diferença quantitativa significativa entre quantidades de DNA metilado SEPT9 entre os diferentes estágios (Figura 2A). O marcador SEPT9 também detectou 22% dos pólipos maiores que 1 cm.

parcelas Box-percentuais de conjunto de treinamento metilado DNA SEPT9 concentrações no plasma são mostrados para pacientes normais colonoscopia verificada (Normal) e pacientes com câncer colorretal ( CRC). concentrações de ADN medianos são linhas horizontais vermelhas; percentis 25 e 75 são linhas horizontais azuis. A largura da caixa de bigodes-percentil em qualquer dada altura é proporcional à percentagem de observações que são mais extrema na direcção que se afasta da mediana. valores de medição individuais são representados como círculos cinzentos. B) parcelas Box-percentuais de conjunto de teste metilado concentrações de ADN SEPT9 no plasma.

Estudo Teste

Para confirmar o desempenho clínico do algoritmo de treinamento SEPT9 foram coletadas amostras de plasma de um independente set paciente (conjunto de teste – Tabela 1). Em comparação com a formação definir o conjunto de teste continha um número significativamente menor câncer em estágio precoce e pacientes com câncer eram ligeiramente mais velhos. Usando o limiar SEPT9 determinada no estudo formação fomos capazes de confirmar o desempenho marcador no conjunto de teste de 309 pacientes com câncer colorretal e controles saudáveis, com sensibilidade de 58% e especificidade de 90% (Tabela 2).

não houve diferença significativa na taxa de detecção por localização do tumor, idade ou sexo. Precoces de câncer colorretal estágio foram detectados em taxas mais baixas (36%) do que os cancros fase posterior (73%), mas a diferença na taxa de detecção não foi significativa. No entanto, houve uma diferença significativa entre quantitativa quantidades de ADN metilado SEPT9 entre diferentes fases (P 0,002; Figura 2B). pólipos grandes ( 1 cm). foram detectados a uma taxa de 18%

processo melhorado produz um melhor desempenho

SEPT9

Durante nosso controle de qualidade de rotina observou-se inibição esporádica da reação de PCR (ver Figura suplementar S2). Portanto analisamos uma réplica SEPT9 adicional usando 10 amostras diluídas-fold disponíveis a partir das medições totais originais bis-ADN. A curva de correlação da medição SEPT9 padrão (média de três réplicas padrão) e uma única medição da amostra diluída é mostrado na Figura 3.

eixo X – concentração de SEPT9 em amostras de conjunto de teste padrão (média de três repetições padrão) do eixo Y – concentração de SEPT9 em 1:10 amostras diluídas conjunto de teste (single replicadas). mDNA – DNA metilado. Grupo 1 – amostras com a mesma amplificação SEPT9 na concentração padrão e diluída, grupo 2 – amostras com amplificação SEPT9 apenas em concentração padrão, grupo 3 – amostras com amplificação SEPT9 apenas em concentração diluída. triângulos verdes – cólon saudável, círculos vermelhos – cancro colo-rectal, quadrados pretos – pólipos

Há três grupos de amostras:. grupo1 em que a amplificação SEPT9 era idêntico em amostras padrão e diluído, o grupo 2 em que apenas as amostras de concentração padrão amplificado e grupo 3, em que apenas as amostras diluídas amplificado. O grupo 2 consiste de amostras para as quais não foi observada nenhuma inibição da PCR, mas continha níveis de ADN do tumor insuficiente para a amplificação de SEPT9 após diluição. Grupo 3 amostras apresentada inibição da PCR em concentração padrão, mas quando diluído, mostraram a amplificação SEPT9. Nós incorporado o resultado desta medida adicional para um novo algoritmo no qual uma amostra do doente é classificada positiva se qualquer duas das três repetições de PCR convencionais são positivos (algoritmo conjunto de treino) OU a medição da amostra diluída é positivo. Reanálise dos resultados conjunto de teste usando este algoritmo melhorou drasticamente o desempenho do ensaio SEPT9 (Tabela 2).

detecção de câncer colorretal geral atingiu 72%, mantendo muito elevada especificidade de 90%. Especialmente impressionante foram melhorias na detecção de câncer em estágio inicial (fase I /II – sensibilidade de 62%). Confirmando o valor potencial de SEPT9 como um biomarcador detecção precoce de cancro colorectal cancer

Não colorectal (NCC) e não canceroso doenças (NCD) análise da amostra

também recolhidos e analisados ​​um subconjunto das amostras de plasma de pacientes diagnosticados com cancros colo-rectais não-(NCC), incluindo bexiga, mama, pulmão, fígado, pâncreas e próstata, bem como não doença -cancerous que pode ter efeitos de confusão sobre o desempenho marcador SEPT9. Como mostrado na Tabela 3, SEPT9 é excepcionalmente específica sobre câncer colorretal quando comparado com a detecção NCCs: apenas algumas amostras de plasma de câncer de fígado (2 de 8 amostras), cancro do pulmão (4 de 13) e cancro da bexiga (4 out of 19) pacientes foram positivos para o marcador. O baixo percentual de SEPT9 presente em vários grupos de doenças não-cancerosas, por exemplo, insuficiência renal crônica, gastrite e infecções respiratórias crónicas (ver Tabela 3) aponta para a sua elevada especificidade para malignidade do câncer colorretal.

Discussão

Neste relatório, determinou o desempenho de um verdadeiro ensaio -time PCR para DNA metilado SEPT9 pela primeira vez em um estudo de formação e, em seguida, em um estudo independente de testes cegos. sensibilidade global para cancros colorrectais era comparável em ambos os estudos, tal como identificado utilizando o algoritmo de treino inicial. A sensibilidade aumentada para 72% com uma réplica SEPT9 adicional da amostra de 10 vezes de plasma diluído. O marcador mostrou-se sensível para câncer colorretal em estágio inicial de identificação de 62% da Fase CRCs I /II. Houve uma tendência para o câncer colorretal estágio precoce para ser detectada a preços ligeiramente mais baixos do que os cancros em fases avançadas, tanto no estudo de treinamento e testes, mas as diferenças não foram significativas devido ao número insuficiente de amostras para cada etapa individual de câncer. Sensibilidade de detecção CRC era completamente independente da localização do tumor no cólon. Esta pode ser uma característica geral dos biomarcadores de metilação desde Chen

et al.

Observou uma falta similar de correlação para encenar ou localização em um estudo recente nas fezes de doentes com cancro colorectal [26]. Outros testes fecais tais como FOBT e iFOBT ter sido demonstrado que têm uma sensibilidade diminuída para ambos os cancros colo proximal e cancros da fase inicial [27]. Por fim, os nossos resultados indicam que o biomarcador também é altamente específico (90-93%) em indivíduos saudáveis.

Foi desenvolvido um ensaio de PCR muito sensível para detectar promotor V2 metilado de SEPT9 em amostras de plasma. validação eficaz de um tal teste depende tanto da qualidade do biomarcador como sobre a qualidade e consistência das etapas de fluxo de trabalho, incluindo a medição do marcador final. Nós controlamos o nosso fluxo de trabalho em cada etapa; avaliar a variabilidade de extracção de ADN, a conversão de bissulfito e a amplificação por PCR e por causa de tal controle de qualidade, fomos capazes de identificar inibição da PCR esporádica no conjunto de teste. Superar este problema por diluição da reacção 10 vezes PCR e combinando esta medida com a medida não diluído rendeu o verdadeiro desempenho do marcador SEPT9. O uso de quatro repetições de ensaio (3 repetições padrão e diluída 1) permite a análise de focagem alternativo, quer sobre a sensibilidade ou especificidade do ensaio de marcador. Ao exigir SEPT9 de estar presente em todos os replicados padrão ou uma repetição diluída antes de uma amostra é classificada positiva, o ensaio obtém uma especificidade muito elevada (97%) e ainda retém a sensibilidade substancial (65%). Quando apenas 1 de 4 repetições (seja um padrão ou um diluído) é necessário para ser positivo para uma chamada positiva (modo de alta sensibilidade), a sensibilidade aumenta para 77% enquanto a especificidade ainda é respeitável em 75% [ver Suplementar Tabela S3].

os grupos de pacientes de controle em nossos estudos incluiu um conjunto principal de indivíduos sem doenças do cólon como verificado por colonoscopia, mas alguns com condições que possam estar presentes no seio da população triagem CRC. Fizemos todos os esforços para evitar o viés de seleção de pacientes no estudo, exigindo controles para estar na mesma faixa etária como CRCs e que será derivada predominantemente a partir das mesmas clínicas como nossos pacientes CRC. Apesar destes esforços alguns vieses permaneceu: a maioria dos pacientes com CCR em treinamento e conjunto de teste são do sexo masculino (57% e 60%, respectivamente), e os pacientes conjunto de teste são um pouco mais velhos do que treinando pacientes definidos. No entanto, uma vez que descobrimos que a detecção de CRC é independente da idade e sexo do desempenho SEPT9 relatados devem ser afetados. A nossa análise primária compara o desempenho do marcador no plasma de doentes com cancro colorrectal versus os sujeitos sem doença colorrectal. Realizamos análises adicionais usando os controles de doenças não-cancerosas e plasma provenientes de fontes diferentes colorectal cânceres para identificar possíveis problemas de especificidade. O número de pacientes com estas condições não são ponderados de acordo com a sua prevalência, e, portanto, verdadeira especificidade em relação a essas doenças não pode ser determinada para a população de triagem alvo. Uma vez que a taxa positiva observada do marcador é muito baixa nas amostras de controlo, acreditamos que o marcador SEPT9 irá ter um bom desempenho em futuros estudos clínicos prospectivos, quando medido na população CRC rastreio.

O teste destina-se a detectar SEPT9 assintomática casos de câncer colorretal. Também obtivemos dados preliminares sobre a detecção de pólipos com o ensaio SEPT9 que indicam algumas mudanças pré-malignas são identificados com o nosso teste. O último teste de triagem CRC também deve direcionar adenomas que avançarão ao câncer e que poderia ser removido durante o acompanhamento colonoscopia. Embora hoje nós ainda não compreendemos totalmente a história natural da adenomas, e não podemos prever quais seriam evoluir para o câncer, é tentador especular que os marcadores epigenéticos, como SEPT9, pode ajudar com essa estratificação pólipo.

A

9 Septin gene

, também chamado MSF, codifica uma proteína de mamífero septina envolvida em muitos processos celulares. Perturbação da ação de

Septin 9

resulta na divisão celular incompleta [28].

9 Septin

e outras proteínas têm sido mostrados para serem parceiros de fusão do proto-oncogene

MLL

sugerindo um papel na tumorigénese [29], [30].

9 Septin

também tem sido mostrado para ser numa região frequentemente suprimida em cancros da mama e do ovário na perda de heterozigosidade (LOH) estudos, uma descoberta que implica adicionalmente o gene como um supressor de tumor possível [31]. Burrows

et al.

Relataram um estudo em profundidade de expressão das várias isoformas da

Septin 9

gene em câncer de ovário e mostrou tecido expressão específica de várias transcrições [32]. A expressão do transcrito de V4

9 Septin

foi mostrado estar ausente ou diminuído em várias linhas celulares e pode ser reactivada por tratamento com 5-azacitidina, proporcionando evidência inicial de regulação potencial do gene por metilação do DNA. Uma evidência adicional de controlo de metilação do transcrito V2 foi fornecida em uma recente análise quantitativa em tecidos e no plasma de pacientes com cancro colorrectal [21]. Além disso, um estudo recente por Bennett

et ai.

Indica que a metilação do gene Septin 9 também ocorre em cancros da cabeça e pescoço, no entanto, a região do evento metilação não é descrito [33]. A sobre-expressão de

9 Septin

isoformas tem também sido demonstrada num certo número de tecidos tumorais. Um estudo anterior de mais de 7.000 tecidos normais e tumorais indica que a expressão específica de tecido de Septin 9 transcritos ocorre numa ampla variedade de cancros [23] Os autores especulam que o gene é provavelmente um gene de cancro de tipo II onde as mudanças no RNA transcrito de regulação de controlo de processamento de diferentes produtos de proteína, e os níveis destas isoformas proteína alterada pode fornecer respostas para o papel do gene na malignidade. Esta hipótese é consistente com estudos recentes que mostram Septin sobre-expressão 9 isoforma está associada a um fenótipo oncogénico [24], [25] e evidência de que Septin 9 v1 sobre-expressão está associada com a resistência de tumores às drogas que interrompem a formação de microtúbulos [34 ].

estratégias até agora atuais CRC rastreio não conseguiu melhorar a adesão do paciente e diminuir a mortalidade do câncer colorretal. A maioria dos especialistas antecipam uma melhoria paciente cumprimento CRC rastreio com teste baseada em sangue, como foi o caso para o rastreio do cancro da próstata com PSA ou na doença cardíaca com o colesterol teste /lipídios. Este relatório descreve a primeira validação de um teste de metilação do DNA à base de plasma realizado em dois grandes estudos de caso-controle bem controlados confirmando o potencial clínico de SEPT9 biomarcador para aplicação CRC rastreio. Acreditamos que tal um teste à base de sangue facilmente administrado para detecção precoce de cancro colorrectal, seguido por colonoscopia de indivíduos positivos tem o potencial de ser uma ferramenta muito eficaz para a redução da mortalidade por esta doença. Os SEPT9 mandados de ensaio marcador de uma avaliação posterior como um teste para a detecção precoce e CRC estudos prospectivos são planejadas para determinar o desempenho clínico em rastreio de populações de triagem de orientação elegíveis.

Informações de Apoio

texto S1.

métodos complementares

DOI: 10.1371 /journal.pone.0003759.s001

(0,03 MB DOC)

Tabela S1.

Primer, sequências de sondas e bloqueador do ensaio de PCR em tempo real SEPT9 marcador, eo CFF1 controle e HB14 ensaios de PCR em tempo real

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s002

(0,02 MB DOC)

Tabela S2. desempenho

SEPT9 marcador no conjunto de treinamento – algoritmos alternativos

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s003

(0,02 MB DOC)

Tabela S3.. desempenho marcador

SEPT9 no conjunto de teste – análise alternativa

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s004

(0,03 MB DOC)

Figura S1.

Shewhart gráficos de recuperação total de DNA genômico de controlo (superior) e SEPT9 DNA marcador (inferior) para o processamento de controles no conjunto de formação | doi:. 10.1371 /journal.pone.0003759.s005

(0.08 MB DOC )

Figura S2.

Shewhart gráficos de recuperação total de DNA genômico de controlo (superior) e SEPT9 DNA marcador (inferior) para o processamento de controles no conjunto de teste

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003759.s006

(0.08 MB DOC )

Reconhecimentos

os autores gostariam de agradecer aos grupos de diagnóstico tecnologia de triagem e desenvolvimento da Epigenomics para realizar os estudos clínicos. Apresentado em parte: Abstract # LB165 AACR Reunião Anual de 2007, Los Angeles CA