PLOS ONE: proteassoma 26S atividade é regulada para baixo na Lung Cancer Stem-como células propagadas in vitro

Sumário

células-tronco cancerosas (CSCs) são um pequeno subconjunto de células cancerosas, capazes de auto-renovação e manutenção tumor. Erradicar as células-tronco do câncer, a raiz da origem do tumor e recorrência, emergiu como uma abordagem promissora para melhorar a sobrevivência do cancro do pulmão. células-tronco cancerosas são relatados a residir na população lateral (SP) de células de câncer de pulmão cultivadas. Relatamos aqui a coexistência de uma população distinta de células não-SP (NSP) que têm capacidade de auto-renovação equivalente em comparação com células SP num ensaio de esfera tumor do pulmão. Em comparação com as células correspondentes em culturas em monocamada, as esferas de tumor de pulmão, formados a partir de não-pequenas células do pulmão linhas celulares de carcinoma humano A549 ou H1299, mostraram grandes diferenças morfológicas e aumento da expressão dos marcadores de células estaminais e CD133 OCT3 /4. Lung esferas tumorais também exibiu um aumento potencial tumorigénico como só 10.000 células pulmonares esfera de tumor foram necessários para produzir xenoenxertos de tumores em ratinhos nus, enquanto que a mesma quantidade de células em monocamada não conseguiu induzir tumores. Nós também demonstrar que as esferas do tumor do pulmão mostraram diminuição 26S atividade do proteassoma em comparação com monocamada. Ao utilizar a ZsGreen-CODC (sequência C-terminal que dirige a degradação da ornitina descarboxilase) ensaio de repórter em linhagens celulares de NSCLC, apenas menos de 1% culturas em monocamada foram ZsGreen positivo indicando baixa proteassoma 26S, ao passo que esfera tumor pulmonar mostrou aumento do número de ZsGreen- células positivas, sugerindo o enriquecimento de CSCs em culturas esfera

Citation:. Pan J, Zhang Q, Wang Y, M Você (2010) proteassoma 26S atividade é regulada no cancro do pulmão de células-tronco-Like propagadas

In Vitro

. PLoS ONE 5 (10): e13298. doi: 10.1371 /journal.pone.0013298

editor: Xinwei Wang, Instituto Nacional do Câncer, NIH, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Abril de 2010; Aceito: 17 de setembro de 2010; Publicação: 11 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Pan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado pelo NIH conceder R01CA134682. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células-tronco cancerosas (CSCs) são um pequeno reservatório de células auto-sustentável com a capacidade exclusiva de auto-renovação e tumor de manutenção [1]. Apenas um pequeno subconjunto de células cancerosas no interior de um tumor têm as características das células estaminais, e pode, assim, iniciar um tumor quando transplantadas [3], [4]. CSCs putativo na leucemia mielóide aguda (LMA) foi isolado pela primeira vez em 1994 [5]. Com os avanços em células activadas por fluorescência (FACS), e marcadores de superfície celular recentemente identificados, tais como Sca-1, e CD133, CSCs podem ser isolados não apenas a partir de cancros do sangue, mas também a partir de tumores sólidos [1].

p> CSCs no carcinoma da mama humano foram identificados como uma população rara de CD44

+ /CD24

– /baixo /ESA

+ células [6]. 100 destas células foram capazes de formar novos tumores, enquanto que outras células tumorais não conseguiu formar tumores em ratinhos SCID. CSCs de mama foram também identificados como CD44

+ /CD24

– /Oct-4

+ por Ponti

et al

. em 2005 [7]. CSCs em câncer de cólon foram encontrados para ser um menos de 2,5% da população com expressão CD133 positivo [8], e recentemente definida como CD44

+ /CD166

+ /ESA

+ [9]. células estaminais broncoalveolar (BASCs) foram recentemente identificadas como a população de células estaminais putativo para o adenocarcinoma do pulmão, e podem ser isolados como CD45

/PECAM – /Sca-1

+ /CD34

+ células por FACS [10]. CSCs em pequenas células e cancro do pulmão de não pequenas células também foram relatados como uma população rara de células indiferenciadas CD133

+ células [11]. Estes eram capazes de se auto-renovar como esferas de tumor em meio isento de soro, e gerar os xenoenxertos tumorais fenotipicamente indistinguíveis do tumor original, quando injectadas em ratinhos SCID.

Uma abordagem alternativa para isolar populações de células estaminais é através do enriquecimento população de lado (SP) células [2]. células SP são identificados pela capacidade de efluxo de corante Hoechst, um processo mediado pela proteína de ligação a ATP a resistência do cancro da mama cassete transportador (Bcrp-1) [12]. Desde Goodell

et al

. relataram que o primeiro SP é enriquecida em células estaminais hematopoiéticas (HSCs) [13], as células SP têm sido identificados numa variedade de tecidos normais e malignos, incluindo o pulmão [14]. camundongos deficientes Bcrp-1 não tinha o SP na medula óssea ainda não tinham anormalidades hematopoiéticas substanciais [15]. Assim, a relação funcional precisa entre o fenótipo e SP haste função celular ainda não está claro. Tanto SP como NSP fracções da linha de células de meduloblastoma DAOY foram capazes de reconstituir a população parental original, e apenas ligeiro enriquecimento clonogénicas foi observada na fracção de SP [16].

células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são relatados para residir na fracção SP da medula óssea de ratinho adulto (BM), no entanto, um relatório recente mostrou a coexistência de NSP HSCs que não diferem significativamente de SP HSCs em números, e capacidade de auto-renovação [17]. Além disso, o CD34

– /lowc-Kit

+ Sca-1

+ marcador de linhagem

– população de células, que é altamente enriquecido em HSCs rato, foi quase igualmente dividido entre o SP e NSP células. Estes foram em um estado inativo e mostrou cinética do ciclo celular uniformes, independentemente de se eles estavam no SP ou NSP [17]. Assim, é necessária uma melhor caracterização do SP em células cancerosas para avaliar plenamente o papel que estas células desempenham no câncer de pulmão.

Os resultados recentes mostraram que os medicamentos quimioterapêuticos, tais como doxorrubicina e cisplatina, poderia induzir a propagação de CSCs

in vitro

[18]. Estas células mantiveram a sua capacidade de auto-renovação, como demonstrado pelo crescimento das esferas tumorais

in vitro

, e tinha alto potencial após a inoculação tumorigénico e metastático em camundongos SCID. fármacos quimioterapêuticos, tais como cisplatina e ifosfamida, são também conhecidos para deprimir a expressão de subunidades proteossomo [19], e sub-regular a ubiquitina-proteassoma de proteólise dependente de [20]. atividade do proteassoma reduzidos 26S foi encontrado para ser uma característica única de CICs (células que iniciam cancerosas) no câncer de glioma e de mama, que pode ser usado para rastrear CSCs

in vivo

[21]. No entanto, Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO (LLNle), um inibidor de γ-secretase, foi relatado para matar eficazmente células de iniciação do tumor de glioblastoma humano (GBM TIC)

In vitro

por inibição do proteassoma 26S . Por conseguinte, maior elucidação da actividade do proteassoma 26S é necessária, a fim de determinar o seu papel no CSCs e terapia anti-cancro. Em última análise, isso pode ajudar na identificação de novos alvos para intervenção terapêutica futura.

No presente estudo, nós investigamos se pulmão CSCs residir unicamente na população lado e se esferas de tumor de pulmão, com capacidade de auto-renovação de NSCLC linhas celulares poderia ser uma fonte de enriquecimento de CSCs pulmonares.

Métodos

Cultura de células

NSCLC humano linhas de células A549 e H1299 foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA), e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco) e penicilina e estreptomicina (Gibco cocktail). 293 FT células foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) e cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Gibco) com FBS a 10% e penicilina e estreptomicina coquetel. Todas as células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO

2.

A coloração de células com Hoechst 33342

Métodos para a identificação de SPs foram adaptados a partir de relatórios anteriores [ ,,,0],22], [23]. Resumidamente, as células foram trpsinized e ressuspensas a 1 x 10

6 células /ml em DMEM com alto teor de glucose, 2% (v /v) de FBS e 10 mM de N- (2-hidroxietil) piperazina-N ‘- (2 etanossulfónico) (HEPES)), incubadas com 5 ug /ml de corante Hoechst 33342 (com ou sem Fumitremorgin C (MP Biomedicals, Eschwege, Alemanha) durante 90 min num banho de água a 37 ° C, e os tubos foram invertidos suavemente cada 20 min para desencorajar a sedimentação de células e agregação. As células foram centrifugadas a 375 x g durante 6 min a 4 ° C, e ressuspensas num volume apropriado de solução de sal equilibrada fria de Hank (HBSS) com 2% (v /v) de FBS. As células manteve-se a 4 ° C durante o resto da experiência. para a discriminação de células mortas, adicionaram-se 2 ug /mL de iodeto de propídio (PI) imediatamente antes da citometria de fluxo. as amostras das células foram analisadas num MoFlo separador de células (Beckman Coulter), e emissão foi recolhida através de um espelho dicróico nm passe 610 (DCLP) a um filtro de 620 nm passe longa (LP) para a recolha vermelho Hoechst e 424/44 nm passa banda (BP) filtrar a coleção azul Hoechst. A população lado “SP” foi identificado como um grupo de células capazes de excluir o corante Hoechst, uma característica abolida com 10 mM tratamento Fumitremorgin C [22].

Formação Sphere Ensaio

Lung tumor as esferas foram isoladas por meio de cultura a uma densidade baixa em condição de cultura livre de soro, tal como anteriormente descrito, o que permitiu a selecção de células estaminais e progenitoras de cancro indiferenciada, enquanto que as células de tumor diferenciado dependente de soro e as células acessórias não-transformadas foram seleccionadas negativamente [8], [11], [24]. células de cancro do pulmão A549 e H1299 foram plaqueadas a uma densidade clonal em meio isento de DMEM-F12 soro suplementado com, HEPES 5 mM, 0,1% de bicarbonato de sódio, 0,4% de BSA, glutamina e antibióticos (Gibco-Invitrogen), e contendo 20 ng /ml de EGF e 10 ng /ml de bFGF. frascos de cultura de tecidos não tratados foram usadas para reduzir a aderência celular e apoiar o crescimento como esferas tumorais indiferenciadas. O meio foi substituído ou suplementado com factores de crescimento frescos duas vezes por semana até que as células começaram a crescer e formar agregados flutuantes. esferas de tumor foram recolhidas com um 100 um filtro de células (BD, Bedford, MA), e expandiu-enzimática e dissociação mecânica, seguida de re-regulamentação de ambas as células individuais e pequenos agregados residuais em meio fresco completo.

Citometria de fluxo

para citometria de fluxo, as esferas de tumor ou culturas em monocamada foram dissociadas mecanicamente em células individuais, lavadas e incubadas com uma diluição adequada de controlo ou de anticorpo específico. Os anticorpos utilizados foram conjugados com PE anti-CD133 /1 de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha), conjugado com FITC anti-CD44 (eBioscience, San Diego, CA), e anti-OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechology, CA). Para conjugado com PE anti-CD133 /1, as células foram primeiro bloqueadas com reagente de bloqueio, durante 5 min, em seguida a 20 minutos de incubação com o anticorpo. Para OCT3 /4 expressão, as células foram fixadas e permeabilizadas com FIX reagentes PERM® (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante, e incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho contra OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechnology), durante 20 min no escuro, depois lavado com PBS, as células foram então incubadas no escuro com um anticorpo secundário conjugado com FITC ( Invitrogen). Como controlo negativo, as células foram coradas com o controlo de isótopo apropriado. Para conjugado com FITC anti-CD44, as células foram incubadas com anticorpos durante 20 min no escuro. Depois de lavadas com PBS, as células foram analisadas num citómetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson).

Os ensaios de função proteassoma

Chymotryptic, e actividades de proteassoma caspase trípticos foram medidos como descrito anteriormente [25] com algumas pequenas modificações. A549, H1299 e as suas células de tumor primário do pulmão esfera foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e sedimentado por centrifugação. Os sedimentos celulares foram sonicados em tampão de homogeneização (Tris 25 mM [pH 7,5], NaCl a 100 mM, ATP 5 mM, 0,2% (v /v) de Nonidet P-40 e 20% de glicerol, e os detritos celulares foram removidos por centrifugação a 4 ° a concentração de proteína C nos extractos celulares brutos resultantes foi determinado pelo protocolo Micro (ácido bicinconínico) (Bio Rad, Rockford, IL), com BSA (Sigma) como padrão. Para medir a actividade do proteassoma 26S, 100 ug de proteína a partir de extractos celulares brutos de cada amostra foi diluída com tampão I (Tris 50 mM [pH 7,4], ditiotreitol 2 mM, MgCl 5 mM de

2, ATP 2 mM) até um volume final de 1 mL (ensaiados em quadruplicado). Os substratos de proteassoma fluorogénicos Suc-LLVY-AMC (substrato chymotryptic; Biomol Internacional, Plymouth Meeting, PA), (substrato tríptica; Calbiochem) Z-ARR-AMC e Z-LLE-AMC (substrato da caspase-semelhantes; Biomol International) foram dissolvidos em DMSO e adicionado a uma concentração final de 80 uM. actividades proteolíticas, que foram monitorizadas continuamente em 2 horas a 37 ° C por medição da libertação do grupo fluorescente, 7-amido-4-metilcoumarina (AMC), a um leitor de fluorescência de placas (Spectramax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) com comprimentos de onda de excitação e emissão de 380 e 460 nm, respectivamente.

Ensaio azul de Alamar

a viabilidade celular foi medida por Alamar Blue [26]. As células A549 e H1299 foram semeadas em placas de 96 poços (BD Falcon) a uma densidade de 2 × 10

3 células por poço. Para esfera culturas tumorais, uma única célula foi enzimática e mecânica dissociado. 24 h após a sementeira, as células foram expostas a diferentes concentrações de cisplatina ou doxorrubicina, tal como indicado, durante 48 h. Alamar Blue (BioSource, Camarillo, CA) foi adicionada directamente ao meio de cultura a 10% do volume do meio durante as últimas 10 h do período de exposição de 48 h. Fluoresce com uma excitação de 544 nm e emissão detectado a 590 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas.

criação de linhas celulares estáveis ​​que expressam ZsGreen-CODC Proteínas de Fusão Usando Transdução Retroviral

O vector de expressão retroviral pQCXIN-ZsGreen-CODC era uma simpática oferta do Dr. Frank Pajonk (Divisão de Oncologia Molecular e Celular, Departamento de radiação Oncológica, David Geffen School of Medicine na Universidade da Califórnia, Los Angeles, Los Angeles, CA), em que o grupo carboxilo terminal do degron murino ornitina descarboxilase (CODC), a sequência que dirige o ponto de partida de degradação, foi fundido com repórter ZsGreen [21]. pQCXIN-ZsGreenc-ODC foi co-transfectado com pVSV-G em células GP2-293 pantrópicas retrovirais embalagem (Clontech) e o sobrenadante retroviral foi utilizado para infectar células A549 e H1299. 48 h após a infecção, as células foram seleccionadas com G418 (Invitrogen). O acúmulo de proteína ZsGreen-CODC foi monitorado por microscópio de fluorescência e citometria de fluxo (FL-1channel).

Geração de subcutânea Lung Cancer xenoenxertos em ratinhos nus

Para xenotransplantes ratos, tanto monocamada e tumor As células foram tripsinizadas e esfera dissociado mecanicamente para se obter suspensões de células individuais antes da injecção subcutânea. foram utilizados ratos nus fêmeas de seis semanas de idade (Harlan Lab, Indianapolis, IN). esfera do tumor (1 × 10

4) e monocamada (1 × 10

4), as células foram s.c. injectado nos flancos esquerdo e direito do mesmo rato para avaliar a actividade tumorigénica. Os ratinhos foram monitorizados diariamente quanto ao aparecimento de tumores subcutâneos. Os ratinhos foram sacrificados no dia 60 e no tecido do tumor foi recolhido. O volume do tumor foi calculado pela fórmula de 0,52 x comprimento x largura

2. Hematoxilina e eosina seguidas por análise IHC foi realizada para analisar a histologia do tumor. Seções também foram coradas com anticorpo contra β-catenina pelo protocolo IHC padrão.

Análise Estatística

Os dados são apresentados como médias ± SD. As diferenças foram determinadas pelo teste t de Student de duas caudas. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

células SP e NSP formar esfera tumor com a mesma frequência em linhas de células de adenocarcinoma humano

células SP ter sido. implicado como CSCs putativos dado que apresenta elevada tumorigenicidade em ratinhos nus SCID /em comparação com células de PNS [27]. Para determinar se as células SP tem uma maior capacidade de auto-renovação de células NSP em cultura, as células SP e PEN a partir de duas linhas celulares de cancro do pulmão humano foram classificadas com base na capacidade de efluxo de corante Hoechst 33342 para gerar um perfil de azul-vermelho Hoechst. Um inibidor selectivo ABCG2, Fumitremorgin C (FTC), foi co-incubado com Hoechst 33342 para bloquear a actividade do transportador, e o portão SP foi definido como a região diminuída na presença de FTC. As linhas de células de adenocarcinoma humano A549 H1299 e continha 17,7% e 0,2% de células de SP, respectivamente (Fig. 1A). Cultura das células SP e NSP na esfera tumor formando mídia, que só permite a seleção de clones indiferenciadas ou de haste do cancro e as células progenitoras [11], resultou no pulmão esfera tumor formação de ambas as subpopulações com nenhuma diferença na taxa de formação (Fig. 1B e dados não apresentados). células SP normalmente dão origem a células SP e NSP por meio de divisão celular assimétrica, enquanto que as células NSP não tem esse potencial [28]. Ao re-manchando o SP classificados e células A549 a partir de NSP e células H1299 uma semana depois, análise FACS revelou que as células SP deu origem a uma proporção significativa de células de PNS. Além disso, as células NSP isoladas também deu origem a proporção similar de células SP (Fig. 1C).

A. Característica Hoechst 33342 perfil de coloração corante demonstrando a existência de SP (polígono fechado) e NSP (elipse fechado) células A549 humanas e células de adenocarcinoma H1299. Percentagem de células SP é indicado. As células foram coradas com 5 mg /ml Hoechst33342 (HO), e células de controlo foram também co-coradas com 10 mM fumitremorgin C (FTC) para especificar as células SP. As células foram classificados usando um Beckman MoFlo citômetro e os dados foram anotados usando FCS expresso. fotografias B. de contraste de fase de esferas de tumor de pulmão obtidos a partir de células SP e NSP. SP e células NSP (1000 células /ml) foram semeados em frascos de ultra baixo aderentes em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento e cultivadas como descrito em Materiais e Métodos. C. Re-mancha de células SP e NSP de A549 e H1299 com Hoechst 33342 dye. Percentagem de células SP é rotulado.

características de células tumorais esferas de haste do cancro de pulmão exposição

Uma vez que células capazes de auto-renovação residem em populações ambos os lados e não-secundários, investigamos se células tumorais esfera mostrou nenhum recurso de CSC, tais como a expressão de marcadores de células estaminais, tais como CD44, CD133 e OCT3 /4. Em primeiro lugar, para excluir o efeito dos meios de comunicação CSC sobre a expressão, as células cultivadas em monocamada na mídia CSC foram verificados, e nenhuma diferença foi encontrada entre as células crescem em meio CSC e meio de crescimento normal (dados não mostrados). As células de monocamada e esfera culturas de A549 e as células H1299 foram então colhidas e analisadas para CD44 e CD133. Mais de 90% das células A549 e H1299 em culturas em monocamada foram CD44

+, ao passo que apenas uma muito pequena porção de células foram CD133

+ (0,2% em células A549, e 0,55% em células H1299.). No entanto, em esferas de tumor de pulmão, CD133

+ células foram grandemente enriquecidos a mais de 10% em A549, e 1,7% em H1299 (Fig. 2A). O OCT3 fator de transcrição /4 é considerado um regulador central da capacidade de pluripotência de células-tronco e auto-renovação embrionárias humanas. A sua expressão parece ser importante na manutenção do estado indiferenciado de carcinoma embrionário, bem como em outros tipos de cancro [29], [30]. OCT3 /4

+ células A549 e monocamadas de H1299 foram menos de 4%, enquanto que os números foram significativamente up-regulada nas esferas tumorais para 36% e 50%, separadamente.

A. Pulmonares esferas tumorais mostraram aumento da expressão de CD133. A expressão de CD44 e CD133 em monocamada de células de tumor e da esfera, tal como determinado por duas cores citometria de fluxo. Os anticorpos monoclonais do mesmo isotipo e um segundo anti-soro pré-imune foram usadas como controlos negativos. A percentagem de células simples e dupla positivos são indicados. B. Lung esferas tumorais mostraram aumento OCT3 expressão /4. Uma intensidade média de fluorescência de OCT3 /4 no controle (zona cinzenta), monocamada de células (linha pontilhada) e esferas tumorais (linha contínua) é mostrado. Percentagens de células positivas estão indicados na tabela.

Lung esferas tumorais têm alta tumorigênico potencial

Para determinar se as esferas do tumor do pulmão de A549 e H1299 células diferem quanto ao potencial tumorigénico em comparação com as células cultivadas em monocamadas, que injectado por via subcutânea células de 10.000 a partir de cada uma dessas populações para os flancos de ratinhos nus. O crescimento do tumor foi observada em todos os ratinhos inoculados com células esfera tumor derivado de A549, enquanto que não o crescimento do tumor foi observada após a inoculação com células de monocamada A549 (Tabela 1). Células tumorais H1299 esfera de células cresceram em 2 dos 3 ratinhos nus, enquanto que a mesma quantidade de células em monocamada não conseguiu dar origem a qualquer tumor mesmo com maior duração mais 4 semanas de observação (Tabela 1 e dados não mostrados). H E coloração revelou uma massa altamente celular com núcleos grandes e nucléolos proeminentes (Fig. 3). secções de tumor a partir de esferas de tumor xenoenxerto foram coradas utilizando um anticorpo contra β-catenina, que é um regulador chave da via Wnt, que funciona no controlo de células estaminais auto-renovação. A translocação de β-catenina para o núcleo conduz a uma maior expressão de genes alvo β-catenina que promovem o estabelecimento do tumor, crescimento, invasão e [31]. Observou-se que β-catenina foi expresso principalmente no citoplasma, enquanto que a expressão nos núcleos foi observada na área do tumor secções de tumores induzidos (Fig. 3). A translocação da β-catenina para o núcleo conduz a uma maior expressão de genes alvo β-catenina que promovem o estabelecimento do tumor, crescimento, invasão e [31].

tumor removido cirurgicamente foi fixado em formalina tamponada e, subsequentemente, analisadas por imuno-histoquímica (IHQ) por protocolo padrão.

esferas tumor de pulmão são mais resistentes a agentes quimioterapêuticos

células monocamada e esfera tumor foram expostas a diferentes concentrações de quimioterápicos atualmente em usar no ambiente clínico, tais como a cisplatina e doxorrubicina. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio Alamar Blue 2 dias depois de submeter as células em monocamada e esfera tumor a cisplatina ou doxorrubicina. Como mostrado na Fig 4, a viabilidade das culturas em monocamada diminuiu significativamente após ambos os tratamentos agentes quimioterapêuticos em comparação com a das células do tumor esfera. A viabilidade relativa era de cerca de 20% tanto para A549 e culturas de monocamada H1299 quando tratada com 12,5 uM de doxorrubicina, enquanto que mais de 50% das células tumorais esfera (50,4% de H1299, e de 64,8% para A549) sobreviveram. Quando tratados com 25 pM de cisplatina, a viabilidade relativa foi de 11,7% para o A549 e 25,3% para a cultura em monocamada H1299, ao passo que 65,4% de esfera de tumor A549 e 79,3% de células esfera tumor H1299 sobreviveram a este tratamento, indicando cultura em monocamada pode ser mais sensível a cisplatina e doxorrubicina em comparação com as esferas de tumores, tal como demonstrado pela menor percentagem de células viáveis ​​depois de exposição in vitro para o fármaco.

. cisplatina, foram analisados ​​B. resistência doxorrubicina da cultura em monocamada e esferas tumorais. As células dissociadas a partir de esferas de tumor de pulmão ou monocamadas foram plaqueadas numa placa de 96 poços a 2 x 10

4 células /mL, 24 h mais tarde, foi adicionado meio contendo diferentes concentrações de cisplatina ou doxorrubicina. Após 48 h de cultura, foi adicionado e lida a 544/590 nm 10% de azul de Alamar, a percentagem de viabilidade foi calculada em relação às células que não foram expostas a quaisquer fármacos quimioterapêuticos. Os resultados representam as médias ± SD.

Lung esferas tumorais exibem reduzida actividade de proteassoma

A regulação da proteólise ubiquitina-proteassoma dependente foi observada em resposta a vários agentes quimioterapêuticos, tais como cisplatina [19], ifosfamida [19] e bortezomib [32]. Descobertas recentes mostraram que as drogas quimioterapêuticos, tais como a cisplatina, pode também conduzir à propagação de CSCs [18]. Para investigar se a atividade do proteassoma redução é observada em CSCs pulmonares, foram realizados ensaios de função proteassoma fluorogênicos usando monocamada e esfera culturas de A549 e células NSCLC humana H1299. O proteassoma 26S tem pelo menos três tipos distintos de actividades proteolíticas incluindo chymotrypsin-, tripsina, e actividade semelhante à caspase. Para monitorizar as actividades da protease específicos do proteassoma 26S, três substratos fluorogénicos: Suc-LLVY-AMC de tipo quimotripsina, Z-ARR-AMC para tripsina, e Z-LLE-AMC para a actividade semelhante à caspase, foram incubados com células Os lisados ​​a partir de qualquer monocamada ou pulmonares esfera tumor culturas. Caspase-like e actividades do tipo quimotripsina de monocamadas aumentou mais de 2 horas de incubação com substratos, mas manteve-se inalterada em lisados ​​de tumor esfera. actividades do tipo quimotripsina foram aumentadas de modo semelhante em culturas de monocamada e menos em esferas do tumor do pulmão (Fig. 5A, B). actividade semelhante a tripsina não foi significativamente diferente nos dois grupos (Fig. 5C). actividade do tipo quimotripsina, actividade predominante do proteassoma 26S, foi reduzida para cerca de 30% nas culturas de esfera em relação a culturas de monocamada. actividade semelhante à caspase foi reduzida para cerca de 20%, enquanto que a actividade semelhante a tripsina não foi significativamente diferente (Fig. 5D). Este resultado indica que esfera tumor de pulmão culturas têm 26S menor atividade proteosoma do que culturas em monocamada.

A. semelhante à caspase, B. C. actividade do tipo tripsina de cultura em monocamada e as esferas de tumor a partir de células A549 e H1299 semelhante a quimotripsina, e foi measued nos tempos indicados. análise de ponto final D. (120 min) do proteassoma 26S actividades em culturas de monocamada e esferas de tumor. Média ± DP é traçada e derivada a partir de três experiências independentes. Student pareado, e dois de cauda t-testes foram realizados, * p 0,05, ** p 0,01 e *** p 0,001 (três repetições por experiência)

Lung esferas tumorais. são enriquecidos com células com baixa atividade do proteassoma

degradação proteossómica da maioria das proteínas deve primeiro passar pelo mecanismo de ubiquitinação antes de ser degradado pelo proteassoma. No entanto, ornitina descarboxilase (ODC) é uma proteína sujeita celular bem caracterizada a degradação proteossómica independente de ubiquitina, e uma vez que reconhecido pelo proteassoma 26S, que leva à degradação imediata das proteínas que o contêm [21]. Retrovírus expressando ZsGreen-CODC (i.e. uma proteína de fusão de ZsGreen fluorescente, e o C-terminal do degron murino ornitina descarboxilase (CODC)) permite a identificação de células com reduzida actividade de proteassoma 26S devido a ZsGreen fluorescência. Isto foi relatado anteriormente para rastrear CICs no câncer de glioma e de mama

in vitro

com base na sua capacidade para rotular células vivas com a atividade do proteassoma 26S baixo [21]. Para confirmar essa esfera tumor células são enriquecido para CSCs pulmonares, que infectaram células A549 e H1299 com os retrovírus que expressam ZsGreen-CODC. Observou-se que as culturas de monocamadas de H1299 e A549 exibiram baixa fluorescência de fundo em mais de 98% das células, e apenas muito poucas células (2%) apresentaram níveis elevados de ZsGreen (Fig. 6A e dados não mostrados). Curiosamente, esferas de tumor de pulmão derivados de ZsGreen-CODC infectado A549 e as células H1299 foram grandemente enriquecido para células ZsGreen-positivas, indicando baixa atividade do proteassoma e, portanto, uma fonte altamente enriquecido para CSCs (Fig. 6B). Para confirmar ainda que CSCs é enriquecida na população com baixa actividade de proteassoma, células ZsGreen positivos e negativos foram também classificadas em placa de 96 poços, e o número de esferas formadas a partir de 100 células separadas foram contadas as células positivas de ZsGreen- tanto A549 e linhas de células H1299 tinha uma capacidade de formação de esfera significativamente maior em comparação com as células ZsGreen-negativos (Fig.6C).

a. Frequência de células ZsGreen em A549 e culturas em monocamada H1299. B. Frequência de células ZsGreen em A549 e esferas tumorais H12199 derivados com acúmulo de ZsGreen-CODC, e, portanto, baixa atividade do proteassoma é indicado. C. Número de esferas formadas a partir de a ZsGreen positiva e as células negativas ZsGreen, após separação com citometria de fluxo em placas de 96 poços. células ZsGree positivos e negativos, foram ordenados em placas de 96 poços (100 células /poço), depois cultivadas em meios de esfera do tumor durante 2 semanas; número de esferas formadas foi contado. Student pareado, e dois de cauda t-testes foram realizados, *** p 0,001 (três repetições por experiência)

Discussão

No presente estudo, nós mostramos. que: 1) consistente com evidências anteriores [11], não existem células CSC-como no câncer de pulmão; 2) tanto células NSP SP e formam esferas tumorais com a mesma frequência que indicam a existência de auto-renovação de células CSC-como em ambas as populações; 3) células de pulmão como CSC-pode ser propagado em meios isentos de soro; e 4) a atividade do proteassoma 26S baixa está associada com pulmão células CSC-like. A hipótese prediz cancro de células estaminais que a fracção de SP devem ser capazes de regenerar tanto a SP e fracções NSP enquanto que a fracção NSP só deve ser capaz de regenerar-se [28]. Curiosamente, os resultados aqui apresentados demonstram que tanto a SP e as fracções NSP têm a capacidade de regenerar completamente ambas as fracções. A mesma conclusão também tem sido observada em linhas de células de glioma e de meduloblastoma DAOY C6, onde ambas as fracções foram capazes de reconstituir a população celular parental [16], [33]. No presente estudo, as células SP exibida crescimento do tumor esfera-like, o

in vitro

ensaio clássico de potencial de auto-renovação, confirmando assim os achados anteriores de que as células SP mostrar atividade do tronco-like [34]. No entanto, as células também foram capazes de PNS de modo a formar esferas de tumor com uma frequência comparável à das células de SP.

CD133 (prominin-1 humana), uma glicoproteina transmembranar do domínio de cinco, foi originalmente identificado como um antigénio de superfície celular presente em CD34

+ células-tronco hematopoéticas. Recentemente, CD133 foi mostrado como um marcador de superfície putativa de cancro de células estaminais em muitos tumores sólidos, tais como tumores cerebrais [35], o cancro da próstata [36], o cancro do cólon [8], o cancro do ovário [37] e o cancro do pulmão [11] . A extremamente baixa abundância de CD133

+ ou OCT3 /4

+ células em tumores, torna difícil isolar essas populações. Em nosso estudo, mostramos que o enriquecimento de CD133

+ /Oct 3/4

+ células por

in vitro

cultura sem soro é possível.

Ele tem sido conhecido que nem todas as células de tumor é uma célula de iniciação do tumor e, assim, milhões de células tumorais são frequentemente necessários para o transplante de um novo tumor a partir de um já existente. No presente estudo, o crescimento do tumor de xenoenxerto em ratinhos nus ocorreu com a injecção de células tumorais 10000 esfera, mas não por injecção de um número igual de células de monocamada. Estes tumores tinham grandes núcleos com nucléolos proeminentes e coloração nuclear de β-catenina, indicando possível ativação de Wnt percurso. acumulação nuclear de β-catenina [38] tem mostrado desempenhar um papel no controlo de células estaminais auto-renovação [31], [39].

fármacos quimioterapêuticos, tais como cisplatina e ifosfamida [19], são conhecido para matar a maior parte dos tumores pela proteólise dependente de ubiquitina-proteassoma regula-se [20]. No entanto, eles também conduzir à propagação de CSCs [18].

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