Abstract

Fundo

O CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) é um fenótipo distinto associado com instabilidade de microssatélites (MSI) e

BRAF

mutação no cancro do cólon. Investigações recentes têm selecionado 5 promotores (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

) como marcadores substitutos para CIMP-alta. No entanto, nenhum estudo abrangente avaliou um conjunto expandido de marcadores de metilação (incluindo estes 5 marcadores) usando um grande número de tumores, ou decifrado as associações clínicas e moleculares complexas com CIMP de alta determinada pelo painel de marcadores validados.

Metholodology /principais conclusões

metilação do DNA em 16 ilhas CpG [a acima de 5 acrescido

CDKN2A

(p16),

chfr

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, p14 (

CDKN2A

/ARF) e

WRN

] foi quantificado em 904 cânceres colorretais por PCR em tempo real (MethyLight). Na análise de agrupamento hierárquico não supervisionado, os 5 marcadores (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

) ,

CDKN2A

,

CRABP1

, MINT31,

MLH1

, p14 e

WRN

eram geralmente agrupado com os outros e com a MSI e

BRAF

mutação.

KRAS

mutação não foi agrupado com qualquer marcador de metilação, o que sugere sua associação com um padrão de metilação aleatória em tumores CIMP-baixos. Utilizando o painel de marcadores CIMP validado (incluindo os 5 marcadores), regressão logística multivariada demonstrou que CIMP de alta foi independentemente associada com a idade avançada, a localização proximal, pobre diferenciação, MSI-alta,

BRAF

mutação, e inversamente com lINE-1 hipometilação e β-catenina activação (

CTNNB1

). recurso mucinoso, as células em anel de sinete, e p53-negatividade foram associados com CIMP de alta em apenas análise univariada. Na análise estratificada, as relações de CIMP-alta com má diferenciação,

KRAS

mutação e LINE-1 hipometilação diferiram significativamente em função do estado MSI.

Conclusões

Nosso estudo fornece dados valiosos para a normalização da utilização de marcadores de metilação CIMP de alta-específicos. CIMP de alta está associada independentemente com características moleculares clínicas e chave no cancro colorectal. Nossos dados também sugerem que

KRAS

mutação está relacionada com um padrão de metilação ilha aleatória CpG que pode levar a tumores CIMP-baixos

Citation:. Nosho K, Irahara N, Shima K, Kure S , Kirkner GJ, Schernhammer ES, et al. (2008) Comprehensive Biostatistical Análise de CpG Ilha Methylator Fenótipo no cancro colorectal usando um grande amostra populacional. PLoS ONE 3 (11): e3698. doi: 10.1371 /journal.pone.0003698

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 11 de junho de 2008; Aceito: 24 de outubro de 2008; Publicação: 12 de novembro de 2008

Direitos de autor: © 2008 Nosho et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH) concede CA87969 P01, CA55075 P01, CA127003 P50 e K07 CA122826 (para SO), e em parte por doações do Fundo de família de Bennett e da Entertainment Industry Foundation (EIF) através do FEI National Cancer Research Alliance colorretal (NCCRA). K.N. foi apoiado por uma bolsa bolsa da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NCI ou NIH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

aberrações epigenéticas são mecanismos importantes na carcinogénese humana [1], [2]. Um certo número de genes supressores de tumor são silenciados pela metilação do promotor de CpG Island [3], [4]. Um subconjunto de cancros colo-rectais apresentam metilação do promotor difundido, que é referido como o fenótipo ilha CpG methylator (CIMP) [4] – [7]. tumores colorretais CIMP-alta têm sido associados com idade mais avançada, sexo feminino, localização proximal, diferenciação mucinoso e pobres, microsatélites instabilidade (MSI),

BRAF

mutação, alta LINE-1 nível de metilação, do tipo selvagem

TP53

, cromossomas estáveis, e Wnt inactivo /β-catenina [8] – [23]. No entanto, muitas destas características são inter-relacionados e, portanto, é essencial para analisar um grande número de tumores por meio de análise multivariada para decifrar as complexas relações entre CIMP de alta e essas variáveis ​​clínicas /tumorais.

Há uma considerável heterogeneidade de tumores em relação à metilação de CpG island, e nem todas as ilhas de CpG metilado são de um modo semelhante em cancro colorrectal [15]. Assim, a escolha de ilhas de CpG pode influenciar substancialmente as características de CIMP. Na verdade, diferentes painéis CIMP utilizados em vários estudos têm causado grande confusão [7]. Weisenberger et ai. [15] ter selecionados 195 CpG ilhas, e selecionou 5 loci (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

), que podem servir como marcadores substitutos para CIMP-alta. Temos validado ainda mais o uso de 8 marcadores (acima 5 mais

CDKN2A

(p16),

CRABP1

e

MLH1

) como um painel de diagnóstico CIMP de alta [24 ]. No entanto, nenhum estudo abrangente compararam estes CIMP de alta-específica ilhas CpG e outras ilhas CpG usando um grande número de tumores.

Neste estudo, avaliamos 16 ilhas CpG, incluindo os novos 5 marcadores CIMP bem como MINT (metilado no tumor) marcadores e outras ilhas CpG, utilizando análise de agrupamento hierárquico em um grande número de cânceres colorretais. Temos também avaliou as características de tumores CIMP-alta determinadas por um painel de marcadores validados e interações de vários fatores clínicos e tumorais por análise de regressão logística multivariada. Este estudo fornece a justificativa para a normalização dos marcadores de metilação de alta específicos do CIMP

Métodos

Grupo de Estudo

Nós utilizamos as bases de dados de dois grandes estudos prospectivos de coorte.; Estudo de Saúde das Enfermeiras (NHS, n = 121.700 mulheres seguiram desde 1976) [25], [26], e do Health Professionals Follow-up Study (HPFS, N = 51.500 homens seguidos desde 1986) [26]. Um subconjunto de participantes da coorte desenvolveram cancro colorectal durante seguimento prospectivo. Assim, estes cancros colo representada, uma amostra relativamente imparcial de base populacional (em comparação com uma amostra de base hospitalar poucos única ou). Estudos anteriores sobre as coortes têm descrito características basais dos participantes da coorte e casos de câncer colorretal incidente, e confirmou que os nossos câncer colorretal foram bem representativa como uma amostra de base populacional [25], [26]. As informações clínicas foram obtidas por meio de revisão de prontuários por médicos. Foram coletadas blocos de tecido embebidos em parafina de hospitais onde os participantes tiveram ressecções sofrido de câncer colorretal primário. Com base na disponibilidade de amostras de tecido adequadas, foram incluídos um total de 904 casos de cancro colorectal (406 de coorte dos homens e 498 da coorte de mulheres). As características clínicas dos casos são descritos na Tabela 1 (à esquerda, sob o título de coluna “Todos os casos”). Entre os nossos estudos de coorte, não houve diferença significativa nas características demográficas entre os casos com tecidos disponíveis e aqueles sem tecido disponível [26]. A maioria dos tumores foram previamente caracterizada por estados de MSI, CIMP,

KRAS

,

BRAF

, p53, β-catenina, LINE-1 metilação e 14 dos marcadores 16 de metilação [19], [21], [24], [27]. No entanto, nenhum de nossos estudos anteriores exaustivamente analisados ​​os 16 marcadores de metilação em relação a cada outras associações independentes de CIMP com várias características moleculares clínicos, patológicos ou tumorais, ou interações de vários fatores sobre as associações com CIMP de alta por métodos biostatistical abrangentes . Este estudo representa um novo estudo único no prazo de 1) um grande tamanho da amostra; 2) o conjunto validado de marcadores de metilação específicas-CIMP; 3) o número de outros eventos moleculares analisados, incluindo 8 CpG que não o CIMP específica marcadores, MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53, LINE-1 metilação e β-catenina ilhas ; e 4) análises estatísticas abrangentes, incluindo agrupamento hierárquico não supervisionado, alisando as ranhuras para avaliar a não-linearidade, regressão logística multivariada e regressão logística estratificada. Assim, este estudo obteve dados novos a partir dos materiais existentes e base de dados, se a novos análogos estudos utilizando linhas de células bem descritos ou modelos de ratinho. O consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos do estudo. coleta e análise de tecidos foram aprovados pela Harvard School of Public Health e Brigham e Hospital da Mulher Institucionais Review Boards.

Patológica Exame, Extração de DNA e sequenciamento do

KRAS Comprar e

BRAF

Para todos os casos, as características patológicas, incluindo diferenciação tumoral, características mucinoso e células em anel de sinete foram examinados por um patologista (SO). Pobre diferenciação foi definido como a presença de 50% de área glandular. O DNA genômico foi extraído de tecido parafina e PCR e pirossequencia�o mirada

KRAS

códons 12 e 13, e

BRAF

códon 600 foram realizados como descrito anteriormente [28], [29].

microssatélites Instabilidade (MSI) Análise

Estado da MSI foi determinada pelo painel de MSI incluindo D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26, BAT40, D18S55, D18S56, D18S67 e D18S487 (ou seja, 10 painel de marcadores) como anteriormente descrito [24]. Um “elevado grau de MSI” (MSI-alto) foi definida como a presença de instabilidade em ≥30% dos marcadores.

-PCR em tempo real (MethyLight) para a análise de metilação de ADN quantitativa

bissulfito de sódio no tratamento de ADN e subsequente PCR em tempo real (MethyLight [30]) foi validado e executada como previamente descrito [31]. Foram quantificados metilação do DNA em 5 promotores específicos de CIMP (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

) e 11 outras ilhas CpG [

CDKN2A

(p16),

chfr

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, p14 (

CDKN2A

/ARF), e

WRN

].

COL2A1 (o gene 2A1 de colagénio) foi utilizado para normalizar para a quantidade de molde de ADN convertido com bissulfito-[31]. Primers e sondas foram previamente descritos [15], [27], com exceção de

IGFBP3

, p14 e

WRN

: IGFBP3-F, 5′-G

T

T

T

CG GGC GTG AG

T

ACG A-3 ‘(Genbank No. M35878, nucleotídeo Nos 1692-1710.); IGFBP3-R, G

AA

TCG

A

CG CA

A

A

CA CG

A

CT

A

C (nucleótido Nos. 1789-1810) e IGFBP3-sonda, 6FAM-

T

CG G

T

TG

T

T

T

AG GGC GAA GTA CGG G-BHQ-1 (nucleótido Nos 1760-1784.) (nucleotídeos bissulfito-convertidos são realçados por negrito e itálico); P14 (CDKN2A /ARF) -F, 5′-

T

TG GAG GCG GCG AGA A

T

A T-3 ‘(Genbank No. L41934, nucleotídeo Nos. 238-256) ; P14-R, 5’- CCC CGT

A

A

A

CCG CG

A

A

AT

Um

-3 ‘(nucleótido n ° 332-350.); P14-sonda, 6FAM-5’CGG

TT

C G

T

C GCG AGT GAG GGT T-3 -BHQ-1 ‘(nucleótido Nos 299-320.); WRN-F, 5’-G

T

A TCG

TT

C GCG GCG

TTT

A

T

-3 ‘(Genbank No. AY442327 , nucleótido n ° 1827-1846).; WRN-R, 5 ‘-

A

CG

AAA

CCG

A

T

A

TCC GAA

A

TC A – 3 ‘(nucleótidos Nos. 1887-1908) e WRN-sonda, 6FAM-

TTT

T

T

T

T

TG CGG

T

CG

T

TG CGG G-BHQ- (nucleótido Nos. 1855-1876). A condição de PCR foi de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Uma curva padrão foi feita para cada placa de PCR de amplificações por PCR duplicados para

COL2A1

em-bissulfito convertido de ADN genómico humano em 4 diferentes concentrações (numa série de diluições de 5 vezes). A percentagem de referência metilado (PMR, ou seja, o grau de metilação) num local específico foi calculada dividindo o

GENE: rácio

COL2A1 de quantidades molde numa amostra pelo gene de

: COL2A1

proporção de valores de modelo no

Sss

I-tratados DNA genómico humano (presumivelmente totalmente metilado) e multiplicando este valor por 100. a metilação positividade foi definida como PMR≥4 como anteriormente validado [31].

pyrosequencing medir lINE-1 metilação

a fim de quantificar com precisão relativamente altos níveis de metilação lINE-1, utilizamos pirossequencia�o como descrito anteriormente [21]. nível de linha-1 medida por metilação pirossequenciao foi mostrado para correlacionar bem com o nível global de 5-metilcitosina (isto é, o nível de metilação do DNA do genoma) em células tumorais [32], [33].

A imuno-histoquímica para a p53 e β-catenina

Tissue microarrays (TMAs) foram construídos e imuno-histoquímica para p53 e β-catenina foi realizada como descrito anteriormente [19], [34]. controles positivos e negativos apropriados foram incluídos em cada série de imuno-histoquímica. expressão β-catenina citoplasmática e nuclear foi tratada separadamente como expressão quer nenhuma expressão (0), fraca (1+), ou expressão moderada /forte (2+). A pontuação de ativação β-catenina foi calculada como a soma da pontuação nuclear (0-2), pontuação citoplasmática (0-2) e pontuação de membrana (0 se coloração da membrana foi positivo, +1 se a expressão membrana foi perdido), como originalmente descrito por Jass et al. [35]. Todas as lâminas imuno-histoquimicamente coradas foram examinadas por um investigador do (β-catenina por K.N .; p53 por S.O.) desconhece outros dados. amostras aleatórias de 402 e 118 tumores foram re-examinados para β-catenina e p53, respectivamente, por um segundo observador (β-catenina pelo SO, p53 por KN) desconhecem outros dados, e as concordâncias entre os dois observadores foram 0,83 para β-catenina (κ = 0,65, p 0,0001), e 0,87 para p53 (κ = 0,75, p 0,0001)., indicando um acordo substancial

análise estatística

para a análise de cluster de biomarcadores incluindo os 16 marcadores de metilação, MSI,

KRAS Comprar e

BRAF

, utilizamos ligação média de agrupamento hierárquico com uma distância euclidiana métrica como implementado em MeV (https://www.tm4.org) [36]. O teste qui-quadrado foi usado para examinar a associação entre CIMP e outras variáveis ​​categóricas de interesse. O teste t assumindo variâncias desiguais foi realizado para comparar a média de idade ea média de LINE-1 nível de metilação. O coeficiente de κ foi calculado para avaliar a concordância entre cada um dos 16 marcadores (positivo vs negativo) e painel CIMP 16-marcador (CIMP de alta positivo versus negativo).

Para examinar as relações de um determinado variável e CIMP de alta, utilizamos modelos de regressão logística não condicional para calcular odds ratio (OR) para CIMP de alta, de acordo com o estado da variável dada, não ajustados e ajustados para idade, sexo, localização do tumor, estágio, diferenciação, LINE- nível 1 metilação, e do estatuto do MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53 e β-catenina. Para ajustar para o potencial de confusão, idade e LINE-1 nível de metilação foram usados ​​como variáveis ​​contínuas, e todas as outras variáveis ​​foram utilizadas como variáveis ​​categóricas.

Por idade e LINE-1, foram avaliados não-linearidade pela o teste da razão de verossimilhança, que comparou um modelo de regressão incluindo um termo quadrático (ou cúbico) com um modelo de excluí-lo. O teste da razão de probabilidade mostraram que a inclusão do termo quadrático não alterou significativamente o ajuste do modelo (P = 0,86 para a idade, p = 0,078 para a linha-1), e que a inclusão do termo cúbico não alterou significativamente o ajuste do modelo (P = 0,87 para a idade , p = 0,084 para lINE-1). Nós também examinou a possibilidade de uma relação não-linear entre a idade (ou LINE-1 metilação) e CIMP de alta, não paramétrica com splines cúbicos restritas [37].

Nós dicotomizada localização do tumor (proximal vs. distal), diferenciação tumoral (pobres vs. bem /moderado), as células em anel de sinete (presentes vs. ausente), MSI (alta vs. não-MSI-alto), p53 (positivo vs negativo),

KRAS

(mutado versus tipo selvagem),

BRAF

(mutado versus tipo selvagem) e β-catenina (ativo vs. inativo). Houve 3 categorias para o recurso mucinoso (0%, 1-49%, e ≥50%) na análise principal inicial (Tabela 2). Nós dicotomizada recurso mucinoso (presente vs. ausente), em análises estratificadas secundárias e análise de interações, porque RUP multivariados para CIMP de alta foram semelhantes em toda a 1-49% mucinoso e ≥50% categorias mucinoso (em referência à categoria não-mucinoso ). Havia 4 categorias para a fase (I, II, III e IV) na análise principal inicial (Tabela 2). Nós dicotomizada estágio do tumor (I versus II-IV) em análises estratificadas secundárias e análise de interações, porque RUP multivariados para CIMP de alta foram semelhantes em estágio II-IV (em referência à fase I).

Quando houve omissão de informações sobre o estágio do tumor (12%), lINE-1 (3,9% em falta), MSI (3,2% em falta), p53 (1,3% em falta),

KRAS

(2,3% em falta) ou

BRAF

(4,7% em falta), que atribuiu um ( “em falta”) variável de indicador separado e incluiu os casos nos modelos de análise multivariada. Confirmou-se que a exclusão de casos com uma variável em falta não alterou significativamente os resultados (dados não mostrados). Não houve informações que faltam em outras variáveis ​​

Uma associação de cada variável com CIMP de alta também foi avaliada em estratos de características importantes clínicos ou moleculares, incluindo a idade ( . 65 anos de idade vs. ≥65 anos de idade ), sexo, localização do tumor (proximal versus distal), estado MSI, e

BRAF

status. Para a análise estratificada, cada modelo de regressão logística multivariada incluiu uma variável de interesse que foi estratificada por uma determinada variável estratificação (por exemplo, idade) e ajustadas para todas as demais variáveis ​​(códigos SAS disponíveis mediante solicitação).

Um interação foi avaliada através da inclusão do termo do produto transversal de uma determinada variável (por exemplo, MSI) e outra variável de interesse em um modelo de regressão eo teste da razão de verossimilhança comparou um modelo que inclua o termo produto cruzado com que excluí-lo. Além de interações de qualquer variável com MSI, localização, idade, sexo e

BRAF

, examinamos todas as possíveis interações bidirecionais restantes, e não encontrou interações significativas (dados não mostrados).

Todas as análises estatísticas, exceto para análise de agrupamento utilizado SAS versão 9.1 (SAS Institute, Cary, NC). Todos os valores de p foram em frente e verso, e significância estatística foi definida como p ≤ 0,05. No entanto, o teste de múltiplas hipóteses foi considerado na interpretação dos dados, especialmente no exame múltiplas interações bidirecionais.

Resultados

Avaliação de 16 marcadores de metilação

Foram obtidos 904 cancro colorectal espécimes e metilação do DNA quantificada nos 16 loci [

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

MLH1

,

chfr

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, p14 (

CDKN2A

/ARF), e

] por PCR em tempo real ([30]) MethyLight ensaios WRN. O primeiro 5 loci (até

SOCS1

) foram selecionados como bons preditores de CIMP (CpG ilha methylator fenótipo) por triagem de 195 ilhas CpG [15]. O uso do primeiro 8 loci (até

MLH1

) como um painel de diagnóstico CIMP de alta foi validado anteriormente [24].

Para avaliar 16 marcadores de metilação de forma isenta, nós realizou uma análise sem supervisão hierárquica de agrupamento dos 16 marcadores de metilação e status do MSI (instabilidade de microssatélites), e

KRAS Comprar e

BRAF

oncogenes, utilizando 860 tumores com todos esses resultados disponíveis (Figura 1 ). Os 8 marcadores CIMP-elevadas (

CACNA1G

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

) foram geralmente agrupados, indicando uma boa concordância de padrões de metilação nestes marcadores e apoiar estes 8 marcadores como bons marcadores CIMP-alta. Além disso, a p14, MINT31 e

WRN

também foram agrupados com os 8 marcadores. Os outros 5 marcadores de metilação (

MGMT

,

HIC1

,

chfr

, MINT1 e

IGFBP3

) não foram agrupados em estreita colaboração com os outros ou a 8 marcadores. O

BRAF Comprar e variáveis ​​MSI, que foram conhecidos para ser associado com CIMP de alta [15], [18], [24], também foram agrupados com estes 8 marcadores, indicando associações apertados com CIMP- Alto. Notavelmente,

KRAS

mutação não foi agrupado com qualquer um dos marcadores de metilação, o que sugere sua associação com um padrão de metilação aleatório (particularmente em CIMP de baixa tumores que têm sido associados com

KRAS

mutação [29 ]; ver também suplementar Figura S1). Usamos agrupamento análise apenas para o exame do marcador clustering, mas não para a classificação tumor. Isto foi porque o agrupamento de marcadores era muito estável com o grande número de tumores (isto é, excluindo alguns tumores não influenciou significativamente os resultados), enquanto que a classificação do tumor por análise de agrupamento com base nos 16 marcadores não era estável.

Horizontal e os eixos verticais representam marcadores e casos, respectivamente. A visão expandida da árvore de agrupamento para os marcadores é mostrada à direita. Os 8 marcadores no nosso CIMP de alta painel de diagnóstico (

CACNA1G

,

IGF2

,

RUNX3

,

MLH1

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

e

NEUROG1

) estão agrupados de perto, apoiando que estes marcadores são bons marcadores CIMP-alta. Observe também a estreita relação entre MSI,

BRAF

e os 8 marcadores CIMP-alta.

KRAS

mutação não é agrupado com qualquer um dos marcadores de metilação analisados, sugerindo que

KRAS

mutação (que é associado com CIMP de baixa [24], [29]; ver Suplementar Figura) é provavelmente associado a um padrão de metilação aleatória.

para descrever o desempenho de cada um dos 16 marcadores de uma maneira imparcial, foi calculado o coeficiente κ (para as estatísticas acordo), a sensibilidade e especificidade de cada fabricante para CIMP- alta diagnóstico determinado pelos 16 marcadores (Tabela suplementar S1). O ponto de corte para o CIMP de alta foi definido como ≥11 /16 ou ≥10 /16 marcadores metilados com base na distribuição de

KRAS Comprar e

BRAF

mutações (Figura Suplementar), e na anterior achados que CIMP de alta está associada a

BRAF

mutação e CIMP de baixa está associada a

KRAS

mutação [24], [29]. A sensibilidade e a especificidade de cada marcador reflectida concordância geral de um padrão de metilação com os restantes 15 marcadores. Era evidente que o desempenho dos 8 marcadores CIMP de tela (

CACNA1G

,

CDKN2A

,

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1) foi geralmente boa. O coeficiente de κ foi maior do que 0,5 para todos estes marcadores 8.

RUNX3

foi o melhor marcador único para CIMP de alta diagnóstico. Entre os outros 8 marcadores (

chfr

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, p14 e

WRN

), apenas MINT31 e p14 mostrou consistentemente o coeficiente κ superior a 0,5, e boa sensibilidade /especificidade. Esta foi, de acordo com análise de agrupamento, que mostrou que MINT31 e p14 agrupado com os 8 marcadores CIMP de tela.

Também comparamos o painel all-16-marcador com o painel CIMP a 8 no marcador. Usando o painel de 8-maker, ou o painel de 16-maker, CIMP de alta foi definida como ≥ 6/8 ou ≥11 /16 marcadores metilados, respectivamente. Entre os 904 casos, 879 casos (97,2%) mostraram concordantes diagnóstico do estado CIMP entre o painel de 16-marcador e o painel de 8-marcador (κ = 0,89, p 0,0001). Quando foi utilizado o painel CIMP 16-marcador, as associações de CIMP de alta com características clínicas e moleculares foram muito semelhantes para os CIMP-altos associações de painel CIMP o 8-marcador (dados não mostrados). Nós também confirmou um elevado grau de concordância (98,6% concordantes; κ = 0,94) entre o painel de 8-marcador e o painel de 5-marcador descrito por Weisenberger et ai. [15]. Assim, em análises subsequentes, foi utilizado o painel CIMP 8 marcador que tínhamos extensivamente validado [24].

CIMP de alta no cancro colorectal

Foram avaliados clínica, patológica e as características moleculares do CIMP de alta cancro colo-rectal (Tabela 1). Pela análise univariada, CIMP de alta está associada ao sexo feminino, idade avançada, localização proximal, pobre diferenciação, mucina, células em anel de sinete, MSI-alta e

BRAF

mutação, e inversamente com a fase I,

KRAS

mutação, lINE-1 hipometilação, p53 positivo e β-catenina ativa (todos p 0,004).

Idade foi linearmente associada com CIMP de alta na análise de regressão logística (p de tendência 0,0001). Nós não mostrar não-linearidade significativa pelo teste da razão de verossimilhança, que comparou um modelo incluindo um termo quadrático (ou cúbico) com um modelo de excluí-lo (p 0,85). Da mesma forma, LINE-1 hipometilação foi inversamente associado linearmente CIMP-alta (p de tendência 0,0001), e não houve não-linearidade significativa pelo teste da razão de verossimilhança, usando uma quadrática (ou cúbico) prazo (p≥0.078) . Não paramétricos restrito splines cúbicos também apoiou uma relação linear entre idade e CIMP-alta (Figura 2) e uma relação linear inversa entre LINE-1 hipometilação e CIMP-alta (Figura 3).

Log

e (ou para CIMP de alta) (eixo y) em função da idade (eixo x) é mostrado (com idade jovem como referência). linhas tracejadas indicam 95% de intervalo de confiança. Note-se a relação linear entre a idade e CIMP-alta. CIMP, CpG ilha methylator fenótipo; OR, razão de chances.

Log

e (OR para CIMP de alta) (eixo y) de acordo com LINE-1 metilação (eixo x) é mostrado (com alto nível de LINE-1 metilação como referência). linhas tracejadas indicam 95% de intervalo de confiança. Note-se a relação linear inversa entre LINE-1 hipometilação e CIMP-alta. CIMP, CpG ilha methylator fenótipo; LINE-1, de longo intercaladas element-1 de nucleotídeos; OR, razão de chances.

Na análise de regressão logística multivariada, CIMP de alta foi significativamente associada com a idade avançada, a localização proximal, pobre diferenciação, MSI-alta e

BRAF

mutação e inversamente com β-catenina activo e lINE-1 hipometilação (Tabela 2). No entanto, todas as outras características (sexo feminino, de palco, de mucina, células em anel de sinete,

KRAS Comprar e p53) não eram mais significativamente associada com CIMP de alta na análise multivariada. Nós ainda examinado para possíveis fatores de confusão na associação de cada variável com CIMP-alta. Com exceção do sexo, todas as outras variáveis ​​apresentaram mudanças substanciais em odds ratio (OR) para a associação com CIMP de alta após o ajuste para MSI,

BRAF

e /ou localização do tumor (ou outras variáveis) (Tabela 2 ). Estes resultados indicaram a existência de relações complexas entre as características clínicas e moleculares (incluindo CIMP) em câncer colorretal, que estão resumidos na Figura 4.

A linha quebrada indica a associação relativamente fraca.

Associações com CIMP de alta nos estratos da MSI

classificação Molecular por status MSI é cada vez mais importante no cancro colorectal [38] – [40]. Assim, nós examinamos as relações de variáveis ​​clínicas e tumorais com CIMP de alta em tumores MSI-altos e tumores não-MSI-elevadas (Tabela 3). A idade avançada, localização proximal e

BRAF

mutação foram significativamente associados com CIMP de alta em ambos os tumores MSI-fortes e não MSI-alta. Em contraste, as relações de CIMP de alta com baixa diferenciação,

KRAS

mutação e LINE-1 hipometilação parecia ser diferente de acordo com o status MSI (p para a interação 0,005). CIMP elevada foi associada com fraca diferenciação e inversamente com

KRAS

mutação em tumores MSI-altos, mas não em tumores não-MSI-altos. LINE-1 hipometilação foi inversamente associado com CIMP de alta em tumores não-MSI-altos, mas não em tumores MSI-alta.

Associações com CIMP de alta nos estratos da localização do tumor

Existem evidências de uma diferença molecular entre proximal e colorretal distais [38], [41]. Portanto, nós examinamos as relações de variáveis ​​clínicas e tumorais com CIMP de alta em tumores proximais e distais tumores (Tabela 4). As relações de CIMP de alta com as variáveis ​​não parecem diferir de acordo com a localização do tumor (todos p para a interação 0,23).

Associações com CIMP de alta em outras análises estratificada

Foram examinadas as relações de variáveis ​​clínicas e tumorais com CIMP de alta em estratos de sexo, idade ( 65 anos vs. idade ≥65 anos de idade) e

Status BRAF

. Considerando múltiplos testes de hipóteses (12-hipóteses testes cada), o efeito das variáveis ​​não parecem diferir significativamente de acordo com a idade (todos os valores p para a interacção 0,03) e sexo (todos os valores p para a interacção 0,02). Notavelmente, o efeito de LINE-1 hipometilação fez parecem diferir de acordo com

BRAF

status (p para interação = 0,001) (Tabela 5). A associação inversa significativa de LINE-1 hipometilação com CIMP de alta estava presente em

BRAF

tumores -mutated [OR ajustado = 0,022; intervalo de confiança de 95% (CI), ,003-,17], mas não no

BRAF

tumores do tipo -wild (OR ajustado = 0,87; IC 95%, 0,25-3,06)

também examinamos todos os restantes potenciais interações bidirecionais pelas variáveis ​​clínicas e tumorais disponíveis, e não encontrou interações significativas em relação às associações com CIMP-alta (dados não mostrados).

Discussão

neste estudo, utilizando uma grande tamanho da amostra, avaliamos 16 fabricantes de metilação de uma forma imparcial. Os 16 marcadores de metilação incluiu os 5 marcadores (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

) que foram selecionados por triagem de 195 ilhas CpG [15] e mais validados para ser incluída no painel de diagnóstico CIMP-alta (acima 5 mais

CDKN2A

,

CRABP1

e

MLH1

) [24]. Pela análise de agrupamento hierárquico não supervisionado, os 5 marcadores de metilação foram agrupados uns com os outros, bem como com MSI (instabilidade de microssatélites) e

BRAF

mutação. Análise de κ coeficiente, sensibilidade e especificidade também demonstrou bom desempenho dos 5 marcadores de metilação com padrão de metilação geralmente concordantes. Utilizando o painel CIMP validado, nós deciframos as complexas relações de CIMP de alta com várias características clínicas, patológicas e moleculares no câncer colorretal. Nossos dados fornecem uma base racional para a do painel metilação marcador validado CIMP-específico.

Este estudo é a primeira investigação extensa para comparar os 5 novos marcadores CIMP-alta [15] com MINT1, MINT31 e outras ilhas CpG , usando um grande tamanho da amostra. Desempenho dos 5 novos marcadores (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

, e

SOCS1

), <