Abstract

A heparanase é uma enzima presente endoglicosidase em leucócitos ativados, mastócitos, tecido placentário, neutrófilos e macrófagos, e está envolvida em metástase tumoral e invasão de tecidos. Ele apresenta um potencial alvo para terapias de cancro e várias moléculas têm sido desenvolvidos na tentativa de inibir a acção enzimática da heparanase. Na tentativa de desenvolver um agente terapêutico novo com um ensaio de diagnóstico associado, já anteriormente descrito aptâmeros de elevada afinidade seleccionados contra heparanase. Neste trabalho, nós demonstramos que estes aptâmeros anti-heparanase são capazes de inibir a invasão de tecidos de células de tumor associados com cancro oral e verificou-se que essa inibição é devido à inibição da enzima e não devido a outros efeitos potencialmente citotóxicos dos aptâmeros. Além disso, foram identificados um curto 30 bases aptâmero como um candidato potencial para estudos posteriores, pois isso mostrou uma maior capacidade de inibir a invasão de tecido do que o seu tempo de contrapartida, bem como um potencial reduzido para a formação do complexo com outras proteínas do soro não-específicos. Finalmente, o aptâmero verificou-se ser estável e, portanto, apropriado para utilização em modelos humanos, uma vez que não mostrou qualquer degradação na presença de soro humano, tornando-o um candidato potencial para o uso diagnóstico e terapêutico

citação.: Simmons SC, Jämsä H, Silva D, Cortez CM, McKenzie EA, Bitu CC, et al. (2014) Anti-heparanase Aptamers como potenciais agentes diagnósticos e terapêuticos para o cancro oral. PLoS ONE 9 (10): e96846. doi: 10.1371 /journal.pone.0096846

editor: Sophia N. Karagiannis, do Kings College London, Reino Unido

Recebido: 27 de setembro de 2013; Aceito: 11 de abril de 2014; Publicação: 08 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Simmons et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Dr. Bonacossa foi apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da Conselho Nacional de Pesquisa científica – CNPq, no âmbito do programa Ciência sem Fronteiras, MCTI, Brasil. Dr. Missailidis gostaria de agradecer o apoio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, no âmbito de um programa sênior pesquisador visitante na FIOCRUZ por parte deste projeto. O grupo do Prof. Salo pesquisa foi apoiada pela Academia da Finlândia, o Organizações Cancer finlandês, finlandês Dental Society Apollonia ea concessão Universidade Oulu Hospital Kevo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

é um enzima heparanase β-1,4-endoglicosidase [1] que participa na matriz extracelular (ECM) degradação e remodelação de [1]. O gene heparanase foi clonado pela primeira vez em 1999 pelos grupos Vlodavsky e paroquiais na seminal de volta para trás Natureza papéis medicina [2], [3].

O polipeptídeo nascente é um 543 aminoácido pré-pró-enzima, que após a remoção da sequência do péptido sinal no retículo endoplasmático, sofre processamento proteolítico, em endossomas tardios /lisossomas pela catepsina-G como proteases [4] em locais Glu109-Ser110 e Gln157-Lys158, obtendo-se uma N-terminal 8 polipéptido kDa, um C -terminal polipéptido 50 kDa e entre eles um kDa polipéptido ligante 6 [3]. Os polipeptídeos de 50 kDa e 8 associar-se para formar uma enzima activa heterodimérica, enquanto que o ligante 6 kDa é excisado e degradada [5], [6].

actividade heparanase está associada a leucócitos activados, mastócitos, tecido placentário e macrófagos e a enzima é segregada pelas células T CD4 + activadas [7], [8], [9], plaquetas [3], neutrófilos e células metastáticas [10]. Após a secreção de heparanase a partir de células tumorais metastáticas, a enzima hidrolisa as ligações glicosídicas de cadeias de sulfato de heparano de proteoglicanos ligados a um produto de 10-20 unidades de açúcar de comprimento [11], que conduz a penetração das células endoteliais dos vasos sanguíneos e órgãos alvo por a célula tumoral. Liberação de citocinas encadernados e fatores de crescimento sequestrados por cadeias de sulfato de heparano em tecidos [12] facilita ainda mais o crescimento do tumor e promove a angiogênese e proliferação de tumores secundários [13]. Níveis de expressão de heparanase em células tumorais se correlacionam com o seu potencial metastático; níveis elevados de mRNA heparanase e proteína foram encontrados em pacientes com câncer que mostram significativamente mais curtos tempos de sobrevivência pós-operatório de pacientes cujos níveis de heparanase são normais [13], [14].

A heparanase regulação positiva em células de câncer de mieloma, linfoblast�de e cancro da mama reflete no aumento da secreção exosome com um aumento do teor sindecam-1, VEGF e HGF cujos papéis estão intimamente relacionados com a agressividade do tumor [15]. Em adição à sua função na progressão do cancro, enzima heparanase também desempenha um papel importante na inflamação

per se

e carcinogénese relacionada com o processo inflamatório [16]. A enzima foi detectada numa variedade de células imunitárias, incluindo células T e B, macrófagos, neutrófilos e células mastro. Tem sido demonstrado para mediar o extravasamento através da barreira endotelial através da remodelação de ECM sulfato de heparano, que permite então que o tráfico para os locais de inflamação [10], [17], [18]. expressão de heparanase tem sido associada a tumorigénese em um número de diferentes tipos de cancro, por exemplo, leucemia mielóide aguda [19], da bexiga, do cérebro [20], da mama [21], do cólon [22], gástrica [23], esofágico [24] , oral [25], pancreático [14], e cancro cervical [26], sugerindo que pode ser um alvo adequado para a terapia de droga. inibidores de heparanase actualmente disponíveis incluem anticorpos neutralizantes [27], [28] péptidos e pequenas moléculas de [29], [30].

Um número de heparinas modificadas e oligossacáridos sulfatados também têm demonstrado ser inibidores potentes da heparanase com actividades anti-tumorais e promissoras já avançou para as fases de ensaio clínico. Exemplos destes incluem SST0001, M402, PI-88 e PG545. SST0001 é uma heparina modificada totalmente N-acetilado que carece de actividade anti-coagulante e demonstrou ser um inibidor de heparanase selectiva. Ele está atualmente em Fase I /II de ensaios clínicos para o tratamento de doentes com mieloma. M402 é uma heparina modificada N-sulfatados que se liga a uma gama maior de factores de crescimento em comparação com SST0001. Isto progrediu a Fase I /II dos ensaios clínicos como uma terapia de combinação com a gemcitabina agente de quimioterapia para o tratamento do cancro pancreático metastático. PI-88 é um polissacárido sulfatado com actividade anti-angiogénica e anti-metastático potente e com a redução da actividade anticoagulante indesejável. Ele chegou a Fase III de ensaios clínicos para o carcinoma hepatocelular pós-ressecção. PG545 é um tetrassacárido que tem propriedades farmacocinéticas superiores, devido ao seu elevado grau de lipofilicidade. Ele mostrou actividade anti-tumoral potente nos modelos resistentes PI88, no entanto, a Fase I de ensaios clínicos no final de 2010 foram abandonados devido a reacções no local da injecção inesperados [31].

Os aptâmeros são oligonucleótidos de ADN ou ARN curtos desenvolvidos para fins de diagnóstico e utilização terapêutica que apresentam elevada afinidade de ligação e especificidade para moléculas alvo [32] – [34]. A afinidade dos aptâmeros foi comparada com a de anticorpos (isto é, na gama nanomolar), mas como aptâmeros são menores (25/08 kDa em comparação com o tamanho de 150 kDa de anticorpos), ambos podem penetrar nos tecidos e ser eliminada do plasma dentro de minutos de administração intravenosa, sem desencadear uma resposta imune, que pode ser útil quando usá-los como agentes de diagnóstico [35]. Para utilização terapêutica, eles são capazes de reter a sua função e características de ligação após modificação com outras porções para melhorar a sua estabilidade e solubilidade, enquanto reduzindo a sua toxicidade e o plasma passe [35] – [38], [39] – [41]. Tipicamente, aptâmeros são de 22 a 100 bases de comprimento, e contêm uma região de sequência variável, flanqueada por sequências conhecidas, que são usados ​​para fins de amplificação e de identificação. Um grande repertório de diferentes combinações de sequências (tipicamente na região de 10

15) no domínio central cria muitos arranjos dobráveis ​​diferentes, especificidade e afinidade de ligação para moléculas diferentes. Os aptâmeros são tipicamente produzido com base no SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial) Procedimento [42], embora um número de outros métodos de selecção são actualmente disponíveis [43] – [45].

aptâmeros foram gerados previamente contra heparanase humano recombinante ativa usando um protocolo e sal série de eluição SELEX modificado. Seleção rendeu três aptâmeros, ‘1,5 M curtas’, uma versão de 30 base truncada de “1,5 m de comprimento” (73 bases), e ‘3,0 M’ (55 bases). ELISAs e titulações de fluorescência separou os dois aptâmeros mais longos como mostrando maior afinidade e reconhecimento de heparanase em células da placenta, ao passo que a coloração tecido placentário favorecida ‘1,5 m de comprimento. Isto foi confirmado num ensaio de invasão de Matrigel usando células de carcinoma do ovário previamente mostrados exigir heparanase para invasão [46]. Dois aptâmeros adicionais, denominadas “rosa” e “amarelo” foram seleccionadas contra a sequência peptídica ligante do pró-heparanase, uma vez que estes podem ter uma função na inibição da formação do heterodímero enzima activa, ao bloquear a excisão péptido protease.

neste estudo, foram feitos esforços para caracterizar ainda mais os aptâmeros previamente selecionados e para avaliar o seu potencial como agente de diagnóstico ou terapêutico. A estabilidade do aptâmero foi avaliada por incubação ao longo de diferentes pontos de tempo com humano e soro de rato, e electroforese em gel de poliacrilamida usada para determinar a extensão da sua degradação por nucleases presentes no soro. Um ensaio de invasão adicional, para além do rato anterior EHS-tumor derivado ensaio de invasão de Matrigel, foi levada a cabo usando tecido leiomioma uterino humano e células de carcinoma que expressam heparanase humanos orais escamosas (HSC-3), como esta experiência representa uma imagem mais autêntica do que acontece em tecido humano. Além disso, um ensaio de proliferação de citotoxicidade de célula /célula foi realizada para verificar que qualquer inibição da invasão observado não era um resultado de citotoxicidade por parte dos aptâmeros. Finalmente, as interações dos aptâmeros com proteínas séricas foi investigada tanto para verificar a especificidade dos aptâmeros e estudar o seu transporte potencial por essas proteínas na corrente sanguínea. O aumento da literatura no campo aptâmero de ADN demonstrou que estas moléculas têm um enorme potencial terapêutico no tratamento de terapia de cancro e que já foram utilizados como moléculas de escolta chamados para entregar drogas em células de cancro (revisto em [47]). AS1411 é um exemplo de um aptâmero ADN que progrediu para testes de ensaios clínicos. O aptâmero neste caso visa especificamente a proteína nucleolin e foi julgado com metastático, de células claras, os pacientes carcinoma de células renais que foram refratários à inibidores da tirosina quinase anteriores [48].

Materiais e Métodos

cultura celular

língua humana células de carcinoma escamoso, HSC-3 (JCRB 0623; Osaka Instituto Nacional de Ciências da Saúde, Osaka, Japão), foram cultivadas em meio de crescimento: 50% DMEM 50% de Ham F-12 (Sigma Aldrich) e, adicionalmente, suplementada com o ácido 50 ug /ml ascórbico, 250 ng /mL de anfotericina B, 5 ug /ml de insulina (pâncreas bovino), 0,4 ng /ml de hidrocortisona e de soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10%. O suplemento de cultura foi adquirido a partir de Sigma Aldrich. Todas as culturas de células foram realizadas utilizando reagentes pré-aquecido. As células foram incubadas em 95% de ar /5% de CO

2 a 37 ° C. As células foram passadas através da remoção de meios e lavagem com HBSS (Sigma Aldrich), então a adição de 3 ml de 1 × tripsina-EDTA (Sigma Aldrich) e incubando durante 5 minutos. A tripsina-EDTA foi inactivado por adição de 7 ml de meio de crescimento e a remoção de quaisquer grumos celulares. 1 ml de suspensão celular (mais 24 ml de mídia crescimento fresco) foi retido no frasco para a manutenção de stocks e os restantes 9 ml foi contado e usado para experimentos.

ensaio de invasão Organotípicas e análises dos inibidores sobre a invasão

o ensaio de invasão organotípicas e a quantificação dos resultados foi realizada como descrito no Nurmenniemi

et ai. (2009) [49]. Resumidamente, 7 × 10

5 HSC-3 células suspensas em meios contendo o aptâmero adequada (não relacionada, 1,5 M suma, 1,5 m de comprimento, 3 M, rosa e amarelo) ou um anticorpo contra heparanase (Hpa Ab, 0,7 mM) . Também (2- {4 – [(E) -3- (4-bromof enil) acriloilamino] -3-fluorofenil} benzo-oxazol-5-il) acético, abreviado para BAFB, foi usada, como esta foi demonstrado que têm efeitos inibitórios mediante heparanase em estudos anteriores [29] (Tabela 1). Cada um aptâmero ou anticorpo foi adicionado a 1? M a suspensão de células HSC-3 no início do estudo e nos meios de HSC-3 cultura de células ao longo da experiência. mioma discos sem células HSC-3 e células HSC-3 sem inibidor foram também incluídas no ensaio como controlos. Os discos foram incubados durante 14 dias a 37 ° C com 5% de CO

2, com os meios que contenham os inibidores apropriados. Os meios de comunicação foram recolhidas, centrifugadas e meios frescos com inibidores foram alteradas nos dias 4, 7, 10 e 14. A partir dos sobrenadantes de mídia recolhidos, os produtos de degradação do tipo de tecido mioma colagénio III foram analisados ​​por radioimunoensaio SP99 (RIA) para C- telopéptido do terminal (IIICTP), e telopéptido do terminal N (IIINTP) imunoensaios enzimáticos (EIA) indireto para telopéptido do terminal N, seguindo os métodos descritos em Nurmenniemi

et ai. ([49] para RIA e [50] para o EIA). No dia 14, os discos myoma foram fixadas em paraformaldeído a 4% e preparadas para análise imuno-histológica. Seis uM secções histológicas de discos myoma foram coradas com anticorpo monoclonal pancitoqueratina (DAKO, clonar AE1 /AE3 a uma diluição 1:150) e visualizados sob um microscópio com ampliação de 100 x. Nove imagens representativas foram tomadas a partir de cada uma das três repetições de cada tratamento. As imagens foram analisadas como descrito no Nurmenniemi

et ai.

(2009) [49]. As diferenças na área da invasão e profundidade foram avaliados usando um teste t de Student e teste de Mann-Whitney e valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

A proliferação celular ensaio

para determinar o efeito do ‘1,5 M curto’ aptâmero sobre a proliferação de células HSC-3, foi utilizado o CellTiter 96 Aqueous ensaio de proliferação celular (Promega), um ensaio de MTS. Cerca de 1 × 10

4 células foram semeadas em triplicado em para uma placa de 96 poços com 1 uM do curto aptâmero. Após 24, 48 e 72 h, 20 ml de CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas durante 1 h a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. A absorvância registada a 490 nm num leitor de placas Fluostar Optima foi usada como uma representação do número relativo de células vivas em cultura.

estabilidade sérica ensaio

‘Os aptâmeros 1,5 M curta “,” 1,5 m de comprimento »e« 3,0 M ‘foram incubadas a uma concentração de 5 uM com soro humano e de ratinho, durante 30, 60, 120, 180, 240 e 300 minutos a 37 ° C. A reacção foi então parada pela adição de EDTA 100 mM e os produtos correu num gel de poliacrilamida nativa a 12%, ao longo de uma escada marcador de ADN de 25 pb. Os géis foram corados com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV.

Soro de albumina de ligação

Albumina de Soro Bovino (BSA) foi adquirida a partir de Sigma-Aldrich Ltd (Gillingham, Reino Unido, o código do produto A7030 10 g ). experimentos UV foram realizadas em um Bio-Tek Uvikon XL com um Peltier Thermosystem para controle de temperatura e facilidade de agitação, ligado ao PC utilizando software Lab Poder Júnior para a recolha e análise de dados. Fluorímetro utilizado foi um Horiba Jobin Yvon Fluoromax-P equipado com um contador de fótons e sistema de Peltier para controle de temperatura e agitação facilidade, acoplado a um PC utilizando software Datamax para análise espectral. Medições iniciais foram realizadas para verificar a presença ou a ausência de emissão de fluorescência de ambos os aptâmeros de comprimento de onda de excitação de 290 nm (selectiva para os resíduos de triptofano) e os comprimentos de onda de emissão entre 300 e 400 nm. Ambos os aptâmeros foram titulados em água e 10 mM de fosfato de soluções tampão de pH 7,4, a 37 ° C. A concentração de aptâmero curto 1,5 M variou 0,3-8,0 pM, e a longo aptâmero 1,5 M variou 0,5-8,0 uM, mostrando a fluorescência intrínseca destes aptâmeros. Ambos os aptâmeros apresentou espectros de emissão de fluorescência desta gama. Testes anteriores mostraram que as concentrações de aptâmeros que varia de 0,1 ug /ml a 8 mg /mL não interferir na avaliação de têmpera albumina [51]. Têmpera medições foram tomadas em 1 ml de 6 uM albuminas em tampão fosfato a pH 7,4. Os espectros de emissão foram registados 300-400 nm, comprimento de onda, depois de um tempo de reacção de 90 segundos após cada adição aptâmero. Ambos emissão e excitação foram largura de banda definida para 3 nm. Aptâmero foi adicionado de uma solução mãe concentrada de modo a que o incremento de volume era negligenciável. As experiências foram realizadas a 37 ° C, pH 7,4.

Para avaliar quaisquer efeitos existentes primárias e /ou secundárias internas de filtro (IFES), procedimentos de correcção com base em medições de absorvência de soluções foram realizadas a excitação e emissão de comprimentos de onda de albumina . Este efeito consiste na absorção de radiação de excitação e /ou emitida por espécies dissolvidas, incluindo o próprio fluoróforo [52]. medição de absorvência de soluções aptâmeros /albumina na excitação e emissão comprimentos de onda de albumina mostrou que efeito de filtro interna causada pela absorção de radiação emitida foi insignificante.

Resultados

Os aptâmeros anti-heparanase inibir a invasão de células de carcinoma

a invasão de células HSC-3 foi estudada com um modelo humano mioma organot�ica [49] expondo as células de carcinoma aos vários aptâmeros (não relacionada, 1,5 M suma, 1,5 m de comprimento, 3 M, rosa, e amarelo) ou anticorpo de heparanase (HPA Ab) (Fig. 1A). Os efeitos destes compostos em comparação com o controlo (sem inibidor) na área de invasão (calculada com base na micrometros de área de células invasivas a) e profundidade de invasão (a distância a partir da superfície inferior da camada de células não-invasiva para a mais profunda da célula invadido) eram analisados ​​(Fig. 1B e C). Aptâmero 1,5 M Curto diminuiu significativamente a invasão área total (p = 0,0001) semelhante ao Hpa Ab, o qual foi utilizado como um controlo positivo inibidor de invasão [27]. Pelo contrário, nenhum dos outros compostos tinham um efeito sobre a HSC 3-invasão (Figura 1). A profundidade invasão diminuiu significativamente apenas após o tratamento com Hpa Ab (p = 0,0001) (Figura 1C). Com base em nossos resultados anteriores, a degradação do colágeno tipo III por células HSC-3 medido com RIA picos dos dias 7 a 11 [49]. Da mesma forma, os meios de comunicação analisadas por RIA a partir do dia 4 não apresentou diferenças entre qualquer um dos tratamentos (não mostrado). A mudança da mídia após o término do experimento no dia 14 mostrou apenas significância estatística a partir do tratamento sem células adicionadas (p = 0,001; não mostrados). A degradação do colagénio do tipo III sem inibidores foi mais elevada a 7 dias (não mostrado) e 10 (Figura 2A-D). No dia 10, o tratamento com anticorpo de heparanase inibiram significativamente a degradação em comparação com o controlo não relacionado (p = 0,07 no RIA, e p = 0,03 na EIA). No dia 10, não houve uma inibição significativa por 1,5 M curta (p = 0,004 em RIA, e p = 0,007 em AIA) e 1,5 m de comprimento (P = 0,02 em RIA, e p = 0,03 na AIA) em comparação com o controlo HSC-3 . No entanto, 3 M, rosa, e aptâmeros amarelas, bem como BAFB mostrou nenhuma diminuição significativa na quantidade de produtos de degradação de colágeno, o que indica que eles não eram inibidores de sucesso de invasão

A:. Parafina-embedded 14- secções organotípicas dia myoma foram coradas para o marcador pancitoqueratina AE1 /AE3 analisar HSC-3 invasão após vários tratamentos: sem inibidor, Hpa Ab, (o anticorpo de heparanase policlonal como um controlo positivo), aptâmero não relacionada, (seleccionado contra um alvo envolvido na doença de Alzheimer doença), aptâmeros anti-heparanase 1,5 M Curto, 1,5 m de comprimento e 3 M; aptâmeros péptido ligante rosa e amarelo. barra de escala é de 100 mm. As diferenças na área de invasão (B) e a profundidade invasão (C) após vários tratamentos (n = 27 /tratamento). As estatísticas foram feitas como de duas amostras

t

-teste e Mann-Whitney

A:. EIA (IIINTP imunoensaios enzimáticos indirectos) detectar telopeptídeo N-terminal do colágeno tipo III produtos de degradação no dia 10 de alteração de mídia. O aumento da absorção significa menos degradação do colágeno produto presente. Hpa Ab (p = 0,03), 1,5 M curta (p = 0,007) e 1,5 m de comprimento (P = 0,03) apresentaram aumento significativo em comparação com a absorvância sem inibidor, sugerindo que eles inibiram a invasão de células HSC-3. B: O gráfico mostra os valores EIA anteriores ajustados para controle negativo no dia 10 de alteração de mídia. C: RIA (radioimunoensaio para colágeno tipo III) detectar telopeptídeo C-terminal no dia 10 de alteração de mídia. níveis crescentes significam menos produto de degradação do colágeno. Hpa Ab (p = 0,07), 1,5 M curta (p = 0,004) e 1,5 m de comprimento (P = 0,02). D: RIA confirmou os ensaios EIA mostrando produtos de degradação de colágeno significativamente menor do que para os tecidos sem inibidor acrescentou, indicando que eram inibidores de sucesso de invasão

O aptâmero anti-heparanase curta não apresentam qualquer. citotoxicidade

a citotoxicidade dos aptâmeros seleccionados em células HSC-3 foi estudada, para verificar se a inibição da invasão observado no modelo organotípico foi um resultado da inibição da heparanase, como foi verificado anteriormente [46] e não celular citotoxicidade. O ensaio MTS foi realizado mais de 72 horas, com uma única adição do aptâmero no início do ensaio e medidas ao longo dos intervalos de período de 24, 48 e 72 horas. Não foi observada alteração no crescimento celular e a viabilidade das células entre as células em que foi adicionado aptâmero e o controlo (ver Figura 3). Apenas os aptâmeros que mostraram a inibição da invasão foram testadas quanto à citotoxicidade, para investigar se o efeito inibidor observado era devido a citotoxicidade ou a inibição da heparanase. Os aptâmeros que não inibem a invasão de células claramente têm nenhum efeito sobre as células e, por conseguinte, não havia razão para ser mais bem estudadas para a citotoxicidade.

A presença do aptâmero a uma concentração de 1 mM foi observado qualquer efeito sobre o o crescimento celular em comparação com o controle.

o aptâmero anti-heparanase curta não se liga significativamente às proteínas séricas

curto e longo aptâmeros 1,5 M foram inicialmente titulada gradual em água e fosfato solução tampão, pH 7,4 a 37 ° C, para investigar a sua fluorescência intrínseca. Ambos os aptâmeros têm fluorescência intrínseca com picos a 380 nm, o que aumenta em intensidade de fluorescência após um aumento correspondente da concentração de aptâmero; a curto mostrando menos de fluorescência do que o tempo aptâmero (Figura 4A e B). Utilizou-se água como um diluente para mostrar que o aptâmero e não solução tampão de fosfato foi a causa da fluorescência, embora a fluorescência para o aptâmero curta aumentada após utilizando uma solução tampão de fosfato como o diluente. No entanto, esta foi provavelmente devido a uma diferença de pH tal como em espectroscopia de fluorescência alterações de pH tem uma influência significativa nos resultados.

fluorescência aumenta por aumento da concentração de aptâmero em fosfato e água, mostrando que, embora a fluorescência é maior em fosfato, o aptâmero é de fato a causa ea diferença pH em água e PBS é a razão mais provável para o aumento da fluorescência do aptâmero em PBS.

o curta aptâmero foi capaz de extinguir a fluorescência do conjugado de HSA a 37 ° C por 1,5% (± 0,03%) e 9% (± 1,2%) a 1:10 e 1:100 proporções molares respectivamente, com têmpera de 10% alcançado por uma concentração molar de 9,1 vezes mais baixos de HSA (Figura 5). Longo aptâmero é capaz de extinguir a fluorescência do conjugado de HSA por 10% a uma concentração de 18,2 vezes mais baixo do que de HSA, e de 2,4% (± 0,1%) e 16% (± 0,6%) a 1:10 e 1:100 proporções molares. Os resultados mostram que ambos os aptâmeros são capazes de extinguir a fluorescência do conjugado de HSA, embora o tempo aptâmero era mais eficaz. HSA têmpera indica que os aptâmeros atingir sub domínio II, onde a sua triptofano único está situado. Este resíduo de triptofano situa-se no local 214 no subdomínio II, dentro do qual existe uma grande cavidade hidrófoba com vários resíduos de arginina próximos da superfície [53], que foram mostrados em diferentes estudos para servir como pontos de ancoragem para os aptâmeros [54].

Excitação comprimento de onda de 290 nm, [HSA] = 6 M. comprimento de onda de excitação a 290 mM numa solução de fosfato de sódio. Dados é a média dos seis valores que não apresentam maior desvio-padrão de 11%. O efeito de extinção é mais considerável por muito tempo do que o curto aptâmero.

Para obter mais informações sobre o tipo de interação que ocorre entre os aptâmeros e HSA, titulações de espectrometria de UV foram realizadas por titulação de concentrações crescentes de curto e aptâmeros de comprimento e 6 uM HSA diluído em tampão fosfato a pH 7,4, tal como mostrado na Figura 5. a adição de ambos os aptâmeros de tampão fosfato e HSA aumentou a absorvência global, que mostra que o aptâmero era responsável por este aumento, em vez de HSA. O aumento era mais pronunciada para o longo aptâmero a curto aptâmero, e produziu um desvio tanto da absorvância máxima à esquerda após a adição de concentrações crescentes de aptâmero.

O deslocamento observado a partir do curto aptâmero (Figura 6A ) 6 nm movido para a esquerda, sugerindo que apenas uma ligeira alteração conformacional na proteína estava a ocorrer [55] e, por conseguinte, HSA têmpera por este aptâmero é muito provavelmente devido à têmpera dinâmica. No entanto, no caso de o tempo aptâmero (Figura 6B), não só houve uma mudança substancial na absorção máxima de 20 nm para a esquerda, mas foi observada uma mudança completa na forma do pico, incorporando o pico a 260 nm do aptâmero, sugerindo que um complexo se formou e que a têmpera foi devido ao fenómeno de têmpera estático com aptâmeros longos [55]. Assim, as titulações UV sugerem que o curto aptâmero não formar um complexo com HSA e que as interacções eram devidas a têmpera dinâmica, enquanto que a longo aptâmero foi sugerida a formação de um complexo estado fundamental com HSA, em contraste com outros aptâmeros previamente estudadas, que também mostram especificidade e formação do complexo apenas com sua proteína alvo [56]. Este trabalho foi ampliado e interações dos aptâmeros com proteínas do soro e a posição específica de sua interação foi calculada e divulgada separadamente, uma vez que não estava dentro do escopo deste artigo [57].

os aptâmeros são estáveis ​​no soro humano

para avaliar a adequação dos aptâmeros como agentes terapêuticos, foi necessário para ter uma compreensão de como os aptâmeros estável não modificados seria no corpo, tal como, só na corrente sanguínea, existem muitas nucleases capazes de degradar os aptâmeros. Assim, para verificar a estabilidade dos aptâmeros em soro humano, foram caracterizados todos os produtos de degradação por electroforese em gel. A comparação das bandas nos geles de 1,5 M curto aptâmero incubadas durante diferentes pontos de tempo com soro humano e de ratinho, com a de aptâmero só mostrou que 1,5 M curto aptâmero não foi sujeito a nucleases de degradação a partir do soro humano como as bandas não mostraram qualquer manchas ou diminuir em tamanho ou intensidade em comparação com apenas aptâmero, e, portanto, não se observou colapso do aptâmero em fragmentos menores (dados não mostrados). Com soro de rato, no entanto, houve uma diminuição na intensidade da banda principal em tempo de incubação de cinco horas, sugerindo que nucleases têm degradado o aptâmero por esse tempo.

Discussão

Neste estudo nós temos explorou o potencial de aptâmeros selecionados anteriormente contra heparanase como promissores agentes de diagnóstico e terapêuticas contra o cancro oral. Os aptâmeros foram previamente demonstrado ter uma elevada afinidade contra heparanase e eram funcionais num ensaio de Matrigel. Em relação a estes estudos iniciais, verificou-se que os aptâmeros mais longos tinham uma afinidade maior para a heparanase e que tinham um bom desempenho na microscopia fluorescente e ensaios de invasão de Matrigel. No entanto, quando examinamos esses aptâmeros no ensaio de invasão organot�ica e analisado o seu potencial para bloquear a invasão, verificou-se que a curto aptâmero era muito mais capaz de fazê-lo, em comparação com suas longas homólogos. Isto também foi verificada por meio da análise por RIA e EIA dos produtos de degradação de tecido mioma, isto é colagénio do tipo III e C-telopéptido do terminal N, respectivamente. O H Curto 1,5 e 1,5 m de comprimento aptâmeros consistem na mesma região variável e, de facto, o curto é uma versão truncada do tempo. No entanto, verifica-se que, embora a uma longa tem uma afinidade ligeiramente maior, provavelmente devido a um aumento das interacções entre a proteína e as partes dos iniciadores do aptâmero, estes resultaram na redução da capacidade destes aptâmeros de inibir a invasão de tecidos. A presença de várias proteínas no tecido real, quando comparado com o ensaio de Matrigel realizado anteriormente, pode ser a razão para isto, como a longo aptâmero podem formar outras interacções com essas proteínas, ou as caudas do iniciador pode ter um efeito de impedimento estérico na tecido, o que não é evidente no modelo de matrigel mais simples. Isto, de facto, foi confirmada pelo estudo das interacções entre os dois aptâmeros e proteínas séricas. Nestes estudos verificou-se que o tempo aptâmero formado um complexo com albumina de soro humano, ao passo que o curto aptâmero não formar um complexo e mostrou apenas uma têmpera dinâmica limitada. Em um outro estudo [57], nós modelamos as interações dos aptâmeros curtas e longas com HSA e identificaram que na verdade a longo aptâmero forma um complexo com albuminas do soro em um único local de ligação, perto de Trp 214 de HSA ou 212 de BSA, no subdomínio II destas proteínas, numa cavidade carregada positivamente alinhado com resíduos de lisina e de arginina [57]. Demonstrou-se que as espécies de aptâmeros mais curtas não tem a capacidade de formar complexos com as proteínas do soro e exibe assim uma especificidade mais elevada para o seu alvo, o que justifica a escolha de utilizá-la em qualquer desenvolvimento terapêutico ou de diagnóstico e está de acordo com os dados myoma apresentados neste trabalho. Uma outra característica importante deste estudo é a demonstração de que as modificações pós-SELEX pode ser mais benéfico para a seleção aptâmero de etapas de contra-selecção inicial, sempre que tal seja possível. Em uma série de estudos com diferentes metodologias de detecção, a afinidade aptâmero para o seu alvo tem sido comparado ao de albumina.