Abstract

A genisteína foi mostrado para inibir cancros tanto in vitro como in vivo, alterando a expressão de vários microRNAs (miRNAs ). Neste estudo, nós nos concentramos em miRNAs supressores tumorais regulados por genisteína e investigou a sua função no câncer de próstata (PCA) e caminhos de destino. Utilizando a análise de micro-arranjo de miARN e em tempo real de RT-PCR, observou-se que o miR-574-3p foi significativamente sobre-regulada em células tratadas com CaP de genisteína em comparação com o controlo de veículo. A expressão de miR-574-3p foi significativamente menor em linhas de células APC e tecidos CaP clínicos comparada com células normais da próstata (RWPE-1) e tecidos normais adjacentes. nível de baixa expressão de miR-574-3p foi correlacionado com tumor estádio avançado e maior pontuação de Gleason em amostras APC. Re-expressão de miR-574-3p em células CaP a proliferação celular, migração e invasão significativamente inibida in vitro e in vivo. restauração miR-574-3p apoptose induzida através da redução da Bcl-xL e activação de caspase-9 e caspase-3. Usando GeneCodis análise de software, foram identificadas várias vias afetadas por miR-574-3p, como «Percursos no câncer”, “via de sinalização Jak-STAT” e “via de sinalização Wnt ‘. Os ensaios de repórter de luciferase demonstrado que o miR-574-3p se liga directamente à UTR 3 ‘de vários genes alvo (tais como RAC1, EGFR e EP300) que são componentes de’ Acesso ‘no cancro. Quantitative PCR em tempo real e análise de Western mostrou que os níveis de mRNA e proteína de expressão dos três genes alvo em células PCA foi acentuadamente regulada para baixo com miR-574-3p. estudos de perda de função demonstraram que os três genes alvo afectar significativamente a proliferação celular, migração e invasão em linhas de células APC. Nossos resultados mostram que a genisteína up-regula tumor supressor de expressão de miR-574-3p segmentação várias vias de sinalização celular. Estas descobertas melhorar a compreensão de como a genisteína regula com miRNA em CaP

Citation:. Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Hidaka H, ​​Majid S, Saini S, et al. (2013) genisteína-regula supressor de tumor MicroRNA-574-3p no câncer de próstata. PLoS ONE 8 (3): e58929. doi: 10.1371 /journal.pone.0058929

editor: Burton B. Yang, da Universidade de Toronto, Canadá |

Recebido: 16 de outubro de 2012; Aceito: 08 de fevereiro de 2013; Publicação: 12 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chiyomaru et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa de Recursos dos Institutos Nacionais de Saúde, através Números Grant R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 e VA Mérito Review and VA programa projeto. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Rajvir Dahiya é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O tipo mais comumente diagnosticado de câncer entre os homens em 2012 é o cancro da próstata (PCA) que se espera que respondem por 29% (241.740) de todos os novos casos de câncer. CaP ocupa o segundo lugar ao câncer de pulmão no número de mortes relacionadas ao câncer e é esperado que representam 9% (28.170) de todas as mortes por câncer do sexo masculino em 2012 [1]. Metastático CaP não é curável e continua a ser a principal causa de mortes por câncer [2]. Paliação pode ser conseguida por terapia hormonal privação no entanto, após uma resposta inicial excelente, em aproximadamente 2 a 3 anos, a maioria destes APC irão recair à forma resistente a castração da doença [3] com a morte ocorrendo geralmente dentro de vários anos [4]. Não existem tratamentos bem sucedidos do PCA andrógeno-independente. Uma melhor compreensão dos mecanismos biológicos da ACP independente de androgénios pode levar a novas abordagens para tratar de responder CaP com mais sucesso.

O desenvolvimento de agentes quimioterápicos com baixa toxicidade paciente está sendo investigado por muitos cientistas. Muitos destes agentes são derivados de produtos naturais de plantas. A genisteína é um isoflavonoid phytoestrogenic que tem efeitos biológicos pleiotrópicos em uma ampla variedade de cancros, sem qualquer toxicidade para as células normais visível [5]. A genisteína é um inibidor da proteína tirosina quinase e afecta a proliferação celular, apoptose, angiogénese tumoral, metástase e atenua a resistência a múltiplos fármacos envolvendo os principais componentes de vias de transdução de sinal [6], [7], [8].

microRNAs (miARNs ) são pequenos RNAs não codificantes (21-23 nucleótidos) que se ligam principalmente imperfeitamente a região 3 ‘não traduzida (UTR) de mRNAs alvo e regulam negativamente a expressão do gene de pós-transcricionalmente por repressão de translação e a degradação de ARNm alvo [9], [ ,,,0],10]. Desde a identificação de miRNAs em 1993 mais de 1500 miRNAs humanos foram registrados no banco de dados miRBase (https://microrna.sanger.ac.uk/). Bioinformatics indicam que mais de 60% dos genes codificadores de proteínas pode ser alvo de miARNs [11]. miARNs desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, tais como o desenvolvimento, diferenciação, proliferação, apoptose, angiogénese e metabolismo. Além disso, elas são reguladores-chave em muitas doenças, incluindo o cancro [12] e miARNs podem funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumor [13], [14]. Os efeitos da genisteína na regulação de vários miRNAs têm sido relatados [15], [16], [17]. O nosso laboratório mostrou que a genisteína inibe o crescimento de células de cancro alvejando miARNs oncogénicos, tais como o miR-21, o miR-151, o miR-221 e miR-222. Neste estudo, nós nos concentramos em supressor de tumor miR-574-3p que é regulada por genisteína e investigou sua função na APC e alvo vias.

Resultados

A genisteína tratamento aumenta miR-574-3p expressão que é regulada para baixo em CaP

Para determinar os níveis de expressão relativos de miR-574-3p em células da próstata, foi realizada quantitativa PCR em tempo real utilizando PC3 e linhas celulares DU145 e comparou-os com células epiteliais da próstata normais (RWPE-1). Observou-se que a expressão de miR-574-3p foi significativamente regulada para baixo em linhas celulares de CaP em comparação com células RWPE-1 (PC3 0,68 vezes, DU145 0,65 vezes) (Fig. 1A).

(A) expressão de miR-574-3p em linhas celulares de PCA (DU145 e PC3) e células epiteliais de próstata normais (RWPE-1). PCR em tempo real mostraram que os níveis de miR-574-3p expressão foram regulados negativamente em linhas celulares de CaP (DU145 e PC3). expressão de miR-574-3p foi normalizada para RNU48. Os dados são apresentados como média ± SE. *, P 0,05. (B) Os níveis de expressão de miR-574-3p após o tratamento com a genisteína (25 ^ M e 50 uM). miR-574-3p expressão aumentada em 30-50% em células genisteína tratado em comparação com os controles. *, P 0,05. expressão (C) miR-574-3p em amostras clínicas (tecido normal adjacente, n = 48; CaP, n = 48). expressão de miR-574-3p foi determinada por PCR em tempo real e normalizado para RNU48. P 0,0001. (D) PCR em tempo real, mostrando correlação das características clínico-patológicas com a expressão de miR-574-3p.

Para identificar miRNAs regulados pela genisteína, realizamos um microarray miRNA usando células PC3 após o tratamento genistein (Tabela 1 ). A expressão de 33 miRNAs foi significativamente up-regulada através de duas concentrações de genistein (25 mM e 50 mM) com miR-574-3p sendo os mais afetados. Estudos anteriores de expressão de miARN nosso laboratório mostraram também que o miR-574-3p foi significativamente regulada para baixo em amostras de CaP em comparação com os tecidos da próstata não-cancerosas [18]. Para confirmar a expressão de miR-574-3p, foi realizada uma análise por PCR em tempo real quantitativo TaqMan e observado que a expressão de miR-574-3p foi significativamente regulada para cima com o tratamento de genisteína (1,31-1,50 vezes) (Fig. 1B).

miR-574-3p é significativamente regulada em CaP Tissue espécimes

Foram avaliados os níveis de expressão de miR-574-3p em tecidos CaP humanos (n = 48) e não adjacente tecidos -cancerous (n = 48). O nível de miR-574-3p expressão foi significativamente menor no CaP em comparação com tecidos normais (p 0,0001; Fig. 1C). Para determinar se os níveis de miR-574-3p em tecidos de tumor se correlaciona com fatores clínico-patológico, foram analisados ​​os níveis de expressão de miR-574-3p em amostras de tumores humanos. demografia clínicos da coorte do estudo estão resumidos na Tabela 2. Correlação de expressão 574-3p com variáveis ​​clínico-patológicas tal como o estágio patológico (PT) e pontuação de Gleason é mostrado na Fig. 1D. Estes resultados revelam que os casos com baixo aumento da expressão de miR-574-3p de baixo grau, de baixo estágio patológico de alta qualidade e alto estágio patológico. Estes resultados sugerem que miR-574-3p é significativamente regulada em APC e pode ser um supressor tumoral putativo na CaP.

Efeito do miR-574-3p Over-expressão na proliferação celular, migração e invasão em CaP linhas de células in vitro e in vivo

Para examinar os papéis funcionais de miR-574-3p, foram realizados estudos de ganho de função usando um miRNA pré-miR-574-3p precursor transfectadas em células PC3 e DU145. A expressão de miR-574-3p foi acentuadamente regulada para cima em transfectantes de precursor pré-miR miARN (Figura 2A;. PC3 316,8 vezes, DU145 307,5 ​​vezes). Ensaio de proliferação celular (MTS) e o ensaio de cicatrização da ferida apresentaram uma inibição significativa em transfectantes miR-574-3p em ambas as células PC3 e DU145 em comparação com os transfectantes de controlo (Fig. 2B e 2C). ensaio de invasão (Matrigel) também mostraram que o número de células invasoras foi significativamente diminuído em miR-574-3p transfectantes em comparação com os seus homólogos (Fig. 2D). Para confirmar o efeito de miR-574-3p na tumorigenicidade in vivo, as células DU145 miR-controlo-transfectadas miR-574-3p e foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. Observou-se que o miR-574-3p sobre-expressão inibiu a formação de tumor de células DU145 in vivo (Fig. 2E). Estes resultados sugerem que o miR-574-3p desempenha um papel importante na progressão de células de tumor.

(A) miR-574-3p níveis de expressão em linhas celulares de CaP (PC3 e DU145) foram determinadas por PCR em tempo real às 72 horas após a transfecção de Pré-miR miARN precursor. expressão de miR-574-3p foi normalizada para RNU48. Os dados são apresentados como a média ± SE. (B) A sobre-expressão de miR-574-3p inibe significativamente a viabilidade celular. A viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de proliferação celular MTS 1, 2 e 4 dias após a transfecção transitória. *, P 0,05. (C) A sobre-expressão de miR-574-3p inibe significativamente a migração celular. Após a transfecção (48 horas), uma ferida foi formado por raspagem e medidos após 6, 12 e 24 horas. Imagens representativas de ensaio de cicatrização de feridas são mostrados em 200 × ampliação. **, P 0,0001. *, P 0,005. (D) A sobre-expressão de miR-574-3p diminuiu significativamente a invasão celular. Imagens representativas de ensaio de invasão são mostrados em 200 × ampliação. *, P 0,005. (E) Imagens representativas de tumores em ratinhos nus 5 semanas após a injecção subcutânea de linhas transfectadas miR-574-3p DU145 celulares ou linhas de células de controlo e decurso de tempo do crescimento do tumor.

miR-574-3p influências Cellular apoptose em células CaP

Uma vez que a restauração miR-574-3p proliferação celular significativamente inibido em linhas de células APC, a hipótese de que sua restauração pode induzir a apoptose. FIG. 3A e 3B mostrou que as frações apoptóticos e início apoptóticos (direita superior e inferior direita nas imagens quadrante, respectivamente) foram maiores em transfectantes miR-574-3p relação ao controle. Isto aponta para um papel pro-apoptótico para miR-574-3p e sugere que afecta vias apoptóticas e regula a tumorigenicidade. Por conseguinte, foi examinada a expressão de várias proteínas apoptóticas por análise de Western blot, e descobriram que o miR-574-3p re-expressão de Bcl-xL faz com que a regulação negativa (Fig. 3C). caspases-9 Além disso, clivados e -3 foram regulados positivamente (Fig. 3C), apoiando ainda mais o fato de que o miR-574-3p é um miRNA pró-apoptótica.

(A) A apoptose ensaio de citometria de fluxo . figuras quadrante representativos de miR-controlo e miR-574-3p transfectantes em PC3 (superior) e DU145 células (inferiores). (B) O gráfico de barras indica a proporção de frações de células em apoptose (células primeiros apoptóticos mais apoptóticos) em miR-574-3p transfectantes comparados com os controles. Os dados para as fracções de células apoptóticas são expressos como o valor relativo para a expressão média do transfectante de miR-controlo. *, P 0,05. (C) imuno análise de marcadores de apoptose em células DU145 miR-574-3p transfectadas miR-controle e. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

busca de genes-alvo miR-574-3p por in silico Análise

Para procurar genes alvo putativos de miR-574-3p, nós utilizada a base de dados TargetScan. O programa mostra que o miR-437 previsto tem 574-3p genes alvo. Utilizou-se análise in silico para identificar os processos biológicos ou vias potencialmente regulados pelo miR-574-3p. Os genes alvo candidatos foram divididos em vias usando análise GeneCodis software (https://genecodis.cnb.csic.es) [19], [20], [21], e vias estatisticamente enriquecidos foram identificados como os ‘Caminhos do câncer’ , ‘via JAK-STAT sinalização “e” via de sinalização Wnt “(P 0,05, Quadro 3). Em seguida, realizamos análises de expressão de genes para todos os genes alvo candidato envolvidos em cada um dos 9 vias usando dados de expressão microarray, que foram aprovados pelo Gene Expression Omnibus (GEO) e centrada sobre a “Pathways em câncer ‘. A partir desta análise, foram identificados vários genes alvos cruciais, incluindo tropomyosin 3 (TPM3), do tipo sem asas MMTV local de integração família, membro 5A (genes WNT5A), ras relacionadas com substrato de toxina C3 botulinum 1 (rho família, proteína de ligação pequena GTP Rac1) (RAC1), epidérmica do receptor do fator de crescimento (EGFR), receptor retinóide X, alfa (RXRA), v-akt timoma murino viral homólogo oncogene 2 (AKT2) e p300 proteína de ligação E1A (EP300).

luciferase Reporter ensaios utilizando vectores contendo 3’UTR Sítios de ligação dos genes putativos alvo

para confirmar a ligação de miR-574-3p para a UTR 3 ‘de genes alvo estes 7, foram realizados ensaios de repórter de luciferase. Cada alvo tem um local de ligação previsto para o miR-574-3p (Fig. 4A). Nós clonado os putativos 3’UTRs miR-574-3p alvo em um vetor ensaio de repórter luciferase. Os ensaios de repórter de luciferase demonstrado que o miR-574-3p diminuiu as actividades de luciferase relativas de RAC1, EGFR e EP300 (Fig. 4B), excepto para os outros quatro genes. A mutação do putativo sítios nestes 3’UTRs ligação miR-574-3p diminuiu a resposta a miR-574-3p indicando que o miR-574-3p se liga directamente aos 3’UTRs de RAC1, EGFR e EP300.

sítios de ligação e mutantes (a) putativo miR-574-3p na 3’UTR de genes alvo. Os ensaios (B) repórter de luciferase usando vectores que codificam para sítios de ligação putativos 3’UTR. células PC3 e DU145 foram transientemente transfectadas com precursora pré-miR miARN ou um controlo negativo, seguido por transfecção transiente com o vector de base ou de tipo selvagem plasmídeos repórter 3’UTR ou mutadas plasmídeos 3’UTR durante 24 horas. 3’UTR actividade repórter foi medida por ensaio de luciferase e normalizada para a actividade de luciferase de Renilla. Os dados são apresentados como a média ± SE. *, P 0,05. (C). Os níveis de ARNm dos três genes alvo de miR-574-3p foram determinados por quantitativo em tempo real análises de PCR após a transfecção imita com miR-574-3p e controlo negativo em linhas celulares de PCA (PC3 e DU145). *, P 0,05. (D) A análise de imunotransferência de genes alvo em células PC3 transfectadas miR-574-3p miR-controlo e. GAPDH foi usada como um controlo de carga.

Regulamento de expressão do gene alvo em linhas celulares de CaP de miR-574-3p

quantitativo em tempo real A análise de PCR mostrou que os níveis de expressão de mRNA dos três genes alvo em PC3 e DU145 foram reprimidos nos transfectantes de miR-574-3p em comparação com os controlos (Fig. 4C). Os níveis dos três genes alvo de expressão de proteínas foram também diminuiu nos transfectantes miR-574-3p comparados com os controles (Fig. 4D).

Efeito do gene alvo siRNA Knockdown sobre a proliferação celular, migração e invasão actividade em linhas celulares de CaP

Para examinar o papel funcional dos genes alvo, foram realizados estudos de perda de função usando SI-ARN knockdown com células PC3 e DU145. A expressão de ARNm e proteína de RAC1, EGFR e EP300 foram marcadamente reprimidos em transfectantes SI-ARN em comparação com os controlos (Fig. 5A e 5B). Ensaio de proliferação celular (MTS) e cura de feridas ensaio mostrou uma inibição significativa em Si-RAC1, Si-EGFR transfectantes e Si-EP300 em ambas as células PC3 e DU145 em comparação com os transfectantes de controlo (Fig. 5C e 5D). ensaio de invasão (Matrigel) também mostraram que o número de células invasoras foi significativamente diminuído em Si-RAC1, Si-EGFR e Si-EP300 transfectantes em comparação com os seus homólogos de controlo (Fig. 5E).

(A) Objectivo Os níveis de expressão de genes em linhas celulares de CaP (PC3 e DU145) foram determinadas por PCR em tempo real, 72 horas após a transfecção de siRNA. expressão do gene alvo foi normalizado para GAPDH. Os dados são apresentados como a média ± SE. *, P 0,05. (B) a expressão do gene alvo em linhas celulares PC3 foram determinados por análise de imunotransf erência, 72 horas após a transfecção de siRNA. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (C) Knockdown de RAC1, EGFR e EP300 inibe significativamente a viabilidade celular. A viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de proliferação celular MTS 1, 2 e 4 dias após a transfecção transitória. (D) Queda de RAC1, EGFR e EP300 inibe significativamente a migração celular. Após a transfecção (48 horas), uma ferida foi formado por raspagem e medidos após 6, 12 e 24 horas. Imagens representativas de ensaio de cicatrização de feridas são mostrados em 200 × ampliação. (E) Queda de RAC1, EGFR e EP300 diminuiu significativamente a invasão celular. Imagens representativas de ensaio de invasão são mostrados em 200 × ampliação. **, P . 0,0001

Discussão

Muitos estudos têm demonstrado que a genisteína regula a proliferação de células cancerígenas, invasão, angiogênese e metástase alvejando vários genes e vias de sinalização [6], [7], [22]. Por exemplo genisteína inibiu a invasão de células redução da expressão de MMP2 e MMP9 em células epiteliais da próstata humana e células metastáticas, onde a progressão do tumor é positivamente correlacionada com a expressão de MMP [23], [24], [25]. Foi anteriormente demonstrado que a genisteína regulada negativamente a expressão de MCM2 pelo aumento da expressão de miR-1296 em células CaP [26]. Nós também têm relatado que a genisteína regulada negativamente o miR-221/222 em células de expressão de CaP resultando num aumento da expressão do gene supressor de tumor que é alvo Arhi de miR-221/222 [16]. A genisteína foi também relatada para inibir a angiogénese CaP por supressão de vias de sinalização autócrina e parácrina mediada por VEGF entre as células de tumor e células endoteliais vasculares [27]. O gene EP300 tem sido identificado como um co-activador de HIF1A e desempenha um papel na estimulação de genes induzidos por hipoxia tais como VEGF [28]. RAC1 é também um importante regulador de angiogese mediada por VEGF [29] e miR-151 tem uma função de regulação oncogénica activação de RAC1 por segmentação ARHGDIA [30]. Também recentemente demonstrado que a genisteína inibiu a migração de células APC e up-regulamentado vários genes supressores de tumor incluindo ARHGDIA alvo de miR-151. Neste estudo, verificou-se que a genisteína-regulada a expressão de miR-574-3p em células APC. A análise in silico e ensaios de repórter de luciferase demonstrado que RAC1 e EP300 foram genes alvo putativas para miR-574-3p. Quantitative PCR em tempo real e análise de Western mostrou que o ARNm e os níveis de expressão de proteína de RAC1 e EP300 em células PCA foi marcadamente regulado negativamente por miR-574-3p. Por conseguinte, a genisteína pode regular negativamente RAC1 e EP300 por cima de regulação de miR-574-3p.

A sobre-expressão de Notch1 conduz a indução do fenótipo EMT e aumento da expressão de miR-21 [31]. A genisteína foi mostrado para inactivar Notch e sinalização de hedgehog [31], [32] e já relatado anteriormente que a genisteína inibiu o crescimento de células tumorais, reduzindo a expressão de miR-21 em carcinomas de células renais [15]. Assim, a genisteína tem uma função supressora de tumor, que regula ‘sinalização Notch’ por sub-regulação de miR-21. A genisteína também pode reduzir a proliferação celular através da regulação “sinalização de Wnt” [33], [34], [35] através de miR-574-3p no câncer. Neste EGFR estudo, um gene alvo putativo para miR-574-3p, foi regulada em APC e aumentou em câncer avançado [36], [37]. expressão de EGFR foi correlacionada com uma alta pontuação de Gleason, recidiva da doença e estado hormônio-refratário [37], [38]. Os investigadores relataram que EGFR é regulada por vários miRNAs como miR-7, miR-128b, miR-133, miR-145, miR146a, miR-146b-5p, miR-331-3p, miR-542-5p [39] – [47]. A genisteína expressão sobre-regulada de miR-146a em células de cancro do pâncreas e funciona como um supressor de tumor em CaP resistente à castração [44], [45]. A genisteína pode regulada para baixo os níveis de EGFR pelo up-regulação miR-574-3p.

A genisteína induz a apoptose, regulando vias de sinalização intrínsecas e extrínsecas. Pro- e proteínas da família Bcl-2 anti-apoptóticas têm um papel crucial na regulação da via apoptótica mitocondrial [48] e a sub-regulação de Bcl-xL por genisteína induz a apoptose em células de CaP [49]. Nesta via activado caspase-9 acelera a activação da caspase verdugo, incluindo caspase-3, e as moléculas de sinalização e sucessivamente cliva proteínas celulares [49], [50]. No nosso estudo, o miR-574-3p induzida apoptose e expressão regulada de Bcl-xL, caspase-9 e caspase-3. Assim, este estudo mostra que a genisteína apoptose induzida em células CaP ocorre por aumento da expressão de miR-574-3p.

Neste estudo, nós nos concentramos em miR-574-3p que foi up-regulada por genisteína e foi significativamente sub-regulada miARN específico para CaP no perfil de miARN [18]. Nossos estudos anteriores indicaram que miR-574-3p pode ser um supressor de tumor miRNA em APC e cancro da bexiga [18], [51], [52]. miR-574-3p está localizado no cromossomo 4p14, uma região freqüentemente excluído cromossômica em APC e das linhas celulares de cancro da bexiga [51], [53]. Su et al relataram que a expressão de miR-574-3p foi reduzida em cancro gástrico e a proliferação celular, migração e invasão foram significativamente inibidas em células cancerosas gástricas miR-transfectadas com 574-3p [54]. Eles descobriram que o gene Cul2 ser um alvo de miR-574-3p usando pela previsão computacional e validação experimental. Nosso estudo anterior demonstrou que miR-574-3p tem a função supressora de tumor e que o gene MESDC1 oncogênico é alvo de miR-574-3p no cancro da bexiga [52]. Neste estudo, demonstrámos que o miR-574-3p é regulada negativamente em amostras clínicas CaP e linhas celulares de CaP independente de androgénio (PC3 e DU145). A regulação negativa da expressão de miR-574-3p em tumores está relacionada com a fase do tumor alta e classificação de Gleason, indicando que o miR-574-3p pode ser utilizada como um biomarcador para a progressão do tumor no CaP.

Em conclusão, o nosso resultados mostram que a genisteína-se-regula a expressão de miR-574-3p que tem como alvo várias vias de sinalização celular. Estas descobertas melhorar a nossa compreensão de como a genisteína regula a expressão miRNA em CaP.

Materiais e Métodos

Clinical próstata amostras

Todas as lâminas de tecido foram revistos por um patologista certificado placa para o identificação de CaP focos bem como epitélio glandular normal adjacente. Todos os pacientes de câncer tinham níveis elevados de antígeno específico da próstata (PSA) e tinham sido submetidos a prostatectomia radical, de 1998 a 2004. demografia do paciente “são apresentados na Tabela 2. Escrito consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos (número de aprovação: H9058-35751-01).

Cultura de células

linhas de células CaP Humano, PC3 e DU145 e uma linha de células de próstata epitelial não maligna, RWPE-1, foram adquiridos a partir do American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). linhas celulares de CaP foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e 95% de ar a 37 ° C. células RWPE-1 foram cultivadas em meio de crescimento de queratinócitos suplementado com 5 ng /de factor de crescimento epidérmico humano recombinante mL e 0,05 mg /mL de extracto de pituitária de bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células subconfluentes (60% -70% confluentes) foram tratados com a genisteína (25 umol /L e 50 nmol /L, Sigma, St Louis, MO, EUA) dissolvida em dimetil-sulfóxido e as células tratadas com veículo (dimetilsulfóxido) serviu como controlo. Meios e genisteína foram trocadas todos os dias e as células foram cultivadas durante 4 dias.

Extração de RNA

O ARN foi extraído a partir de amostras humanas utilizando um kit de FFPE embebido em parafina fixado em formalina miRNeasy (Qiagen, Valência , CA, EUA) após microdissecação. Para digerir o DNA, foi utilizado o kit Qiagen de DNase isenta de RNase. O ARN total foi também extraído de linhas celulares de CaP e uma linha celular epitelial da próstata não maligno utilizando um miRNeasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

microARN Microarray

Para miARN microarray, ARN total foi extraído a partir de células PC3 tratadas com genisteína usando um Kit Mini miRNeasy. A análise microarray miRNA foi realizada e analisada por uma empresa comercial (Phalanx Biotech, Belmont, CA, EUA), utilizando o humano v3 plataforma miRNA OneArray que é projetado para conter 100% do Banco de Dados miRBase Sequence lançamento 17.0.

Quantitative PCR em tempo real

ARN total extraído foi transcrito de forma inversa em ADNc de cadeia simples usando um kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e um TaqMan MicroRNA Transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). a análise por PCR em tempo real quantitativo foi realizado com um sistema de detecção de sequência rápida da Applied Biosystems Prism7500 utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems). Os níveis de expressão do RNA foram determinadas usando o 7500 Fast System SDS software versão 1.3.1 (Applied Biosystems). parâmetros de PCR para amplificação foram como se segue: 95 ° C durante 20 segundos, 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 3 segundos, e 60 ° C durante 30 segundos. Todas as reacções foram realizadas num volume de reacção de 10 ul, em triplicado. Os dados foram analisados ​​com o delta-delta método Ct para calcular o fold-change. As sondas TaqMan e iniciadores para RAC1 (ensaio ID: Hs01902432_s1), EGFR (ensaio ID: Hs01076078_m1), EP300 (ensaio ID: Hs00914223_m1), GAPDH (ensaio ID: Hs02758991_g1), miR-574-3p (ensaio ID: 002349), RNU48 (Ensaio ID: 001006) foram obtidos de Applied Biosystems. GAPDH e RNU48 foram utilizados como controlos internos.

análise de Western

, 72 horas após a transfecção, as células foram lisadas com tampão RIPA (Pierce, Brebieres, França) contendo inibidores de protease (Sigma). quantificação de proteína foi feito usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce). lisado de proteína (30 ug) foi separada em 4% a 20% de gel de poliacrilamida de SDS e transferidos para uma membrana de PVDF. Os anticorpos para EP300 e Bcl-xL foram adquiridos a Invitrogen e Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos contra RAC1, EGFR e GAPDH foram adquiridos a GeneTex (Irvine, CA, EUA), respectivamente. Anticorpos para caspase-3 clivada, -9 e caspase-3, -9 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Após incubação com anticorpo primário a membrana foi lavada e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). complexos específicos foram visualizados com um sistema de detecção echochemiluminescence (ECL) (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). A membrana foi removido utilizando ReBlot Além disso forte Anticorpo de descascamento solução (Millipore, Billerica, MA, EUA). O nível de expressão de genes foi então avaliada usando software ImageJ (ver 1.43;. https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

A transfecção

Pré-miR precursor de miARN e controlo negativo (Applied Biosystems) foram usadas nas experiências de ganho de função. RAC1, EGFR e EP300 siRNA (Sigma) e controlo negativo de siRNA (D-001810-10; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foram utilizados nas experiências de perda de função. células PC3 e DU145 foram transitoriamente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 reagente de transfecção (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante.

proliferação celular, migração e invasão Ensaios

A proliferação celular foi medida utilizando um CellTiter 96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (MTS) (Promega, Madison, WI, EUA) realizada de acordo com as instruções do fabricante. A proliferação celular foi determinada por medições de absorvância a 490 nm utilizando SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EUA). actividade de migração celular foi avaliada por um ensaio de cicatrização da ferida. As células foram plaqueadas em placas de seis poços, e as monocamadas de células foram raspadas utilizando uma ponta de micropipeta de P-20. A largura do intervalo inicial (0 h) e a abertura residual 6, 12 e 24 horas após o ferimento foram calculados a partir de fotomicrografias. Um ensaio de invasão de células foi realizada utilizando Boyden modificada secções de Matrigel inserções de filtro de membrana Transwell-pré-revestidas com oito poros micron em placas de 24 poços de cultura de tecidos (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). meio mínimo essencial contendo 10% de FBS na câmara inferior serviu de quimioatractor, tal como descrito anteriormente [55]. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

In vivo Tumor Crescimento

Todos os cuidados com os animais foi de acordo com as orientações do Centro Médico San Francisco Veterans Affairs e o estudo foi aprovado pelo San Francisco VA (número de protocolo: 11-008-01) IACUC. usuários animais tenham concluído programas de treinamento para lidar e trabalhar com camundongos através AALAS (Associação Americana de Ciência Animal Laboratory) antes de experiências com animais. Para o modelo de xenoenxerto subcutâneo do rato, as células DU145 (2,5 × 10

6) que foram transitoriamente transfectadas com o miR-574-3p ou miR-controlo foram suspensos em 50 ul de meio RPMI 1640 e foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus fêmea (estirpe ratinhos BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, EUA, 5 semanas de idade). Um total de 8 ratinhos nus (4-miR-574-3p, 4-miR-controlo) foram utilizados e o crescimento tumoral foi examinado ao longo de 35 dias. O volume do tumor foi calculado com base na largura (x) e o comprimento (y):. x

2y /2, em que x y

Apoptose Os ensaios

cell- activadas por fluorescência triagem (FACS) para a apoptose foi feito 96 horas pós-transfecção, utilizando um kit de anexina V-FITC /7-AAD (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As células coradas foram imediatamente analisados ​​com um citômetro de fluxo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

Identificação de miR-574-3p regulamentado genes-alvo e análise bioinformática

Para procurar genes regulados por miR-574-3p, usamos TargetScan algorism (versão 6.2, https://www.targetscan.org/).