PLOS ONE: expressão diferencial de PRAMEL1, um cancro /Testículo Antigen, durante a espermatogênese na PRAME Mouse

Abstract

pertence a um grupo de antígenos câncer /testículo (CTAs) que se caracterizam pela sua expressão restrito em gametogênicas tecidos normais e uma variedade de tumores. O

PRAME

família é uma das famílias de genes mais amplificados no rato e de outros genomas de mamíferos. Os membros das proteínas

PRAME

codificam família de genes repetições ricas em leucina (LRR) que funcionam como reguladores de transcrição em células cancerosas. No entanto, o papel de PRAME em gónadas normais é desconhecido. O objetivo deste estudo é caracterizar a expressão temporal e espacial do mouse

gene Pramel1

, e para determinar a localização celular da proteína PRAMEL1 durante a espermatogênese mouse. Nossos resultados indicaram que o rato

Pramel1

foi expressa apenas no testículo. O nível de ARNm e a expressão da proteína foi baixa nos testículos recém-nascidos, e aumentou gradualmente a partir de 1- testículos de 3 semanas de idade, e depois manteve-se constante ao fim de três semanas de idade. coloração de imunofluorescência em secções de testículo com o anticorpo de ratinho revelaram que PRAMEL1 PRAMEL1 estava localizada no citoplasma de espermatócitos e a região em volta de acrossomal, alongando e espermatídeos alongados. Outras análises sobre a preparação testículo squash e espermatozóides em um nível subcelular indicaram que os padrões de localização de proteínas de PRAMEL1 foram coordenadas com as alterações morfológicas durante a formação do acrossoma em espermátides e foram significativamente diferentes em peça de conexão, peça intermediária e peça principal do flagelo entre testicular e espermatozóides do epidídimo. Coletivamente, nossos resultados sugerem que PRAMEL1 pode desempenhar um papel na biogênese acrossoma e motilidade dos espermatozóides

Citation:. Mistry BV, Zhao Y, Chang T-C, Yasue H, Chiba M, Oatley J, et al. (2013) a expressão diferencial de PRAMEL1, um cancro /Testículo Antigen, durante a espermatogênese no Mouse. PLoS ONE 8 (4): e60611. doi: 10.1371 /journal.pone.0060611

editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de dezembro de 2012; Aceito: 28 de fevereiro de 2013; Publicação: 02 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mistry et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo USDA-NIFA (não darão nenhuma. 2010-65205-20362) e start-up fundos da Universidade Estadual da Pensilvânia para W-SL. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a espermatogênese é um processo biológico complexo que envolve a proliferação de mitose de espermatogônias, a divisão meiótica de espermatócitos, ea diferenciação morfogênica de espermátides para amadurecer espermatozóides. Durante spermiogenesis, os espermatídeos redondos sofrer grandes mudanças morfológicas e celulares, incluindo a formação do acrossoma, alongamento e condensação do núcleo, a formação do flagelo, e eliminação do citoplasma desnecessário, para a produção de espermatozóides altamente especializado e polarizada [1], [2 ]. O acrossoma é uma vesícula derivada de Golgi localizado na região anterior da cabeça de esperma [3]. Ela desempenha um papel essencial na fecundação por seu envolvimento no processo de ligação dos espermatozóides de ovo e penetrante o ovo [4], [5]. Os machos de mamíferos portadores de mutações que afetam a biogênese acrossoma são inférteis ou subfertile [4] – [7]. biogênese Acrosome começa no pachytene fase espermatócito final da meiose e continua durante toda a primeira metade do spermiogenesis [4], [5], [8]. Inicialmente, as vesículas são formadas a partir proacrosomal aparelho de Golgi e montados na região perinuclear, perto de um dos pólos do núcleo em espermatócitos paquíteno. Após a conclusão da divisão meiótica, estas vesículas fundem uns com os outros para formar uma única grande vesícula acrossomal que atribui ao envelope nuclear de espermatídeos redondos e continua a aumentar por adição de material de Golgi-derivado [4], [8]. Durante a maturação das espermátides em alongamento, o Golgi deixa de contribuir glicoproteínas ao acrossoma, eo complexo acrossoma-núcleo sofre grandes alterações morfológicas para adquirir uma característica forma de espermatozóides da espécie dadas [8].

O flagelo de um espermatozóide de mamífero é uma estrutura complexa com base em microtúbulos importante e altamente organizada, que fornece a mobilidade necessária para o esperma de alcançar e fertilizar um ovo [9]. Estruturalmente, ele é dividido em quatro componentes principais: a peça de conexão, a peça intermediária, a peça principal e a peça final [10]. Montagem do flagelo começa no início de spermiogenesis. Durante biogénese flagelo, um par de centrioles move-se para o lado oposto do acrossoma desenvolvimento no espaço perinuclear do espermátide rodada, em que um dos dois centrioles forma uma axoneme flagelar. Subsequentemente, o axoneme sobressai a partir do espermátide, obtendo-se o flagelo [8]. Mais de 400 proteínas foram encontradas no flagelo, mas apenas uma fracção das proteínas foram caracterizados ao nível molecular e mostrado funcionar como estrutural, metabólico ou proteínas de sinalização [11], [12].

antigénios do cancro /testis (CTA) são um grupo de proteínas que são altamente expressos numa ampla variedade de tumores malignos, mas a sua expressão em tecidos normais é principalmente restringida a células germinais testiculares e do ovário [13] – [15]. Devido ao seu padrão de expressão característico, a CTA são utilizados como marcadores de prognóstico para uma gama de tumores e também são considerados alvos promissores para a imunoterapia do cancro [16] – [18]. Pelo menos 70 famílias de genes CTA envolvendo mais de 240 genes individuais (ou isoformas) foram identificados até à data [19]. Estudos anteriores sugeriram que os CTA, em geral, têm um papel na tumorigénese e ambos gametogénese [14], [15], [20]. No entanto, informações sobre a função e localização celular precisa dos CTAs em células germinativas e tecidos de câncer é escassa em comparação com dados sobre a sua expressão e imunogenicidade [13], [15].

antígeno preferencialmente expresso no melanoma (PRAME) é um membro do CTA, e foi originalmente identificado como um antigénio tumoral expressa em células de melanoma, desencadeando uma resposta imunitária citotóxica T mediada por células autólogas [21].

PRAME

é um gene multi-cópia representando uma das famílias de genes mais amplificados em mamíferos eutherian, com ~ 90 cópias do rato, ~ 50 cópias no ser humano e ~ 30 cópias no genoma bovino [19] , [22], [23]. Curiosamente,

PRAME

foi transposta para e amplificado no cromossomo Y na linhagem bovid, sugerindo um papel na reprodução masculina [19]. Os membros do

PRAME

LRR codificam família de genes (repetição rica em leucina) proteínas que se dobram em forma de ferradura na sua estrutura terciária. A função primária de proteínas ricas em leucina é proporcionar um quadro estrutural versátil para a formação de interacções proteína-proteína em diferentes processos de reconhecimento molecular, incluindo a transdução do sinal, a adesão celular, regulação da transcrição, processamento de RNA, apoptose, resposta imune, e a polarização celular [24 ] – [28]. Expressão e função de PRAME tem sido extensivamente estudada em uma variedade de células cancerosas, e a alta expressão de PRAME se correlaciona com a progressão do cancro [28] – [30]. Em células de melanoma, PRAME funções como um repressor de ácido retinóico (RA) de sinalização através da interacção com os receptores de AR (RAR) e recrutamento de proteínas Polycomb [27], [31]. Estudos recentes também sugerem que as funções PRAME como um activador de transcrição. Costessi

et ai.

(2011, 2012) relataram que PRAME é um componente de base Cullin2 E3 ubiquitina ligase e é necessária para recrutar Cullin2 ubiquitina-ligase ao complexo EKC /KEOPS. Este complexo está associado com os promotores activos regulados pela

fator de transcrição nuclear Y

(

NFY

) [29], [32]. Nossa hipótese é que PRAME também desempenha um papel na espermatogénese. Como passo inicial para testar a nossa hipótese e para dissecar o papel molecular da família do gene PRAME na reprodução, optou-se por trabalhar no

PRAME-like 1 | (

Pramel1

) gene de rato, um representante da

PRAME

família de genes, que é homólogo ao humano

PRAME,

e está localizado no cromossoma do rato (MMU) 4. neste trabalho, caracterizamos o

gene Pramel1

em relação ao seu padrão de expressão de mRNA e proteína e localização celular durante o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese.

resultados

análise de expressão temporal e espacial do mouse

Pramel1

no testículo

o padrão do mouse expressão

Pramel1

gene (acc. não. NM_031377) foi examinada em 11 tecidos de camundongos adultos por RT-PCR. Para fins comparativos, outros cinco paralogs do rato

PRAME

família (X-linked

PRAME

,

Pramel3

, e

Pramel

e MMU4- ligada

Pramef8

e

Pramef12

) também foram analisados ​​(Tabela 1). Os resultados indicaram que todos os seis parálogos foram altamente expressa no testículo, com diferentes níveis de expressão nos outros tecidos (Fig. 1). O

Pramel1

e

PRAME

mRNAs foram especificamente expresso no testículo, enquanto que

Pramel

,

Pramel3

,

Pramef8

, e

Pramef12

mRNAs foram predominantemente expressa no testículo com uma expressão baixa em células de ovário, fígado, baço, rim, cérebro, pulmão, músculo e timo (Fig. 1a). Para examinar mais expressões temporais e espaciais da

Pramel1,

foi realizado um estudo curso de tempo durante o desenvolvimento dos testículos. Os resultados de RT-PCR indicam que, enquanto um nível inferior a

Pramel1

ARNm foi expressa no testículo recém-nascido, um nível mais elevado de expressão constante foi detectada em 1-semana-testículos através de 8-semanas de idade (Fig . 1b).

a. análise de expressão espacial de seis

PRAME

paralogs entre 11 diferentes tecidos de ratos adultos.

PRAME

e

Pramel1

foram expressos especificamente nos testículos, enquanto que

Pramel, Pramel3, Pramef8

e

Pramef12

foram expressos predominantemente em tecidos gametogênicas com um baixo nível de expressão no fígado, rim, cérebro, pulmão, intestino delgado, timo e músculos. b. A análise da expressão temporal da

Pramel1

durante o desenvolvimento dos testículos. Baixa expressão foi observada no testículo recém-nascido, enquanto que uma expressão elevada constante foi observada em testículos de ratos de 1 a 8 semanas de idade.

ACTB

foi utilizado como um controlo positivo. M: marcador; Ov: ovário; Te: testículos; Li: fígado; SP: baço; Ki: renal; Br: cérebro; Si: intestino delgado; Ly: linfonodo; Lu: pulmão; Mu: músculos; Th: timo; -:. Controlo negativo

Para determinar se a proteína PRAMEL1 é expressa em testículos, uma análise Western Blot foi realizada em todo o lisado testículos de ratos maduros, utilizando um anticorpo específico para o PRAMEL1. Tal como mostrado na Figura 2a, o anticorpo PRAMEL1 identificada uma banda específica com um peso molecular de ~ 57 kDa, que é o peso molecular previsto para a proteína de rato PRAMEL1 (acc. No. NP_113554). Além disso, uma banda muito menor (~ 42 kDa) foi observada (Fig. 2a). Para testar a especificidade do anticorpo, foi realizado um controlo de pré-absorção com o péptido usado para gerar o anticorpo PRAMEL1, em que não foi detectada nenhuma banda (Fig. 2A), sugerindo que o anticorpo é específico do PRAMEL1 e a banda menor exige Investigação aprofundada. Uma análise de curso de tempo da proteína PRAMEL1 indicaram ainda que a sua expressão em testículos foi (Fig. 2b) dependente da idade. O nível de expressão da proteína foi muito baixa no estágio de recém-nascido (Fig. 2b), consistente com o baixo nível de transcrição detectado por RT-PCR (fig. 1b). A expressão foi aumentada gradualmente a partir de 1- testículos de 3 semanas de idade, e depois manteve-se constante ao fim de três semanas de idade (Fig. 2B). Como um controlo positivo, o anticorpo um anticorpo monoclonal β-actina (ACTB) foi utilizado para detectar ACTB, e uma proteína prevista de 42 kDa foi identificada (Fig. 2a, 2b).

a. A análise Western blot de PRAMEL1. Os extractos de proteína a partir de testículos de rato adulto foram submetidas a análise de Western blot utilizando um anticorpo de ratinho PRAMEL1. Uma proteína imuno-reactiva com um peso molecular esperado de 57 kDa, ~ foi detectado no testículo, e também foi observada uma banda muito menor de ~ 42 kDa. Como um controlo positivo e o carregamento foi utilizado um anticorpo monoclonal de ACTB, e foi observada uma proteína imuno-reactiva de 42 kDa esperado. Como controlo negativo, realizou-se um controlo de pré-absorção do péptido usado para gerar o anticorpo PRAMEL1, e nenhuma banda foi detectada. b. Tempo de análise curso da expressão da proteína PRAMEL1 durante o desenvolvimento dos testículos. Os extractos de proteína a partir de recém-nascido (RN), 1-semana (1w), 2 semanas (2W), 3-semana (3W), 4 semanas (4W) e 8 semanas (8W) -Old testículos foram sujeitos a Western blotting com o anticorpo de ratinho PRAMEL1. O nível da expressão PRAMEL1 foi gradualmente aumentada de Nb para 3W e, em seguida, manteve-se constante ao fim de 3 semanas de idade. Números à esquerda indicam os pesos moleculares de proteínas padrão.

localização da proteína PRAMEL1 durante a espermatogênese

Nós investigamos a expressão celular, espacial e temporal da proteína PRAMEL1 durante células germinativas desenvolvimento por microscopia de imunofluorescência indireta. Inicialmente, foi examinada a localização da proteína PRAMEL1 em ​​secções transversais de testículos nos ratinhos jovens, a partir de recém-nascido a 3 semanas de idade. Como mostrado na Fig. 3, não houve um padrão de coloração específica observada para o anticorpo PRAMEL1 através da secção em testículo 1-semanas de idade (Fig. 3-A, C), que foi observada fundo fracamente inespecífica de coloração tanto para o anticorpo PRAMEL1 (Fig. 3a, c) e controlo de péptido pré-absorvida (Fig. 3d). Isto pode ser uma consequência de relativamente baixa expressão do transcrito e da proteína nesta fase (Fig. 1b e 2b). Em comparação com o controlo pré-absorvido péptido, onde foi observada alguma coloração não específica (Fig. 3i), coloração específica foi observada para o anticorpo PRAMEL1 principalmente no citoplasma de espermatócitos no testículo 2-semanas de idade (Fig. 3f, h) . Quando os ratos chegaram a 3 semanas de idade, uma coloração muito original e forte foi detectada pelo anticorpo PRAMEL1 na região perinuclear de espermátides arredondadas (fig. 3k, m), onde foi observada uma estrutura de cobertura semelhante na superfície nuclear (Fig . 3m).

as seções transversais de 1 semana (a-e), 2-semana (f-j) e 3-semana (k-o) testículos -Old rato foram coradas com o PRAMEL1 rato anticorpo. Embora não houvesse nenhum sinal específico observado através dos túbulos seminíferos em 1 semana de idade, testículo, coloração específica (verde) foi observada no citoplasma de espermatócitos (f, h) no testículo 2 semanas de idade e na região perinuclear de espermátides redondas ( K, m) em testículos de 3 semanas de idade. Painéis A, F, k são a coloração de anticorpos PRAMEL1. Painéis b, G e L são contrastadas com DAPI para visualizar núcleos. Painéis C, H e m são imagens fundidas para a coloração PRAMEL1 e DAPI. As pontas de seta apontam para uma área com sinais descritos. Painéis d, i e n são a coloração de anticorpo pré-absorvida-péptido como controlo negativo. Painéis E, J e S são H E coloração para mostrar a estrutura e tipos de células dos túbulos seminíferos. Ampliação é × 400. Barra de escala = 20 mm.

Para analisar se a estrutura cap-like na superfície nuclear de espermátides redondas é no lado da anterior ou posterior, o anticorpo de rato PRAMEL1 juntamente com a β-tubulina ( TUBB) anticorpo que é especificamente coradas no lado posterior da espermatídeos [33], foram aplicadas a secções transversais de testículos de ratos adultos. Sob baixa ampliação (× 400), como a diferenciação do epitélio rendimentos seminíferos, PRAMEL1 pode ser visto na região perinuclear de células germinais pós-meióticos (redondo, alongando e espermatídeos alongadas) (Fig. 4a, e, i), enquanto TUBB foi visto no lado oposto da coloração PRAMEL1 nos alongar e alongadas espermatídeos (Fig. 4e, I), indicando que a proteína PRAMEL1 foi localizado no lado anterior (

ie

acrossoma) da região nuclear em espermátides do mouse. Um exame mais detalhado das seções testículo imunofluorescência corados em maior ampliação (× 1000) mostraram que a proteína PRAMEL1 foi visto pela primeira vez em espermátides redondas, onde foi intimamente associados com uma estrutura cap-like na superfície nuclear (Fig. 5a, b ). Em comparação com a seção de testículo, a preparação esmagado de espermátides redondas ofereceu mais detalhes sobre o padrão de coloração, onde PRAMEL1 foi observada principalmente na vesícula acrossomal, com pouca ou nenhuma coloração na região do acrossomal grânulos (Fig. 5b). Este padrão coincidiu com a formação da vesícula acrossomal que se espalha numa camada fina sobre o pólo do núcleo para formar a tampa acrossomal. Nesta fase, não se observou nenhuma coloração para TUBB porque o flagelo ainda não se tinha formado (Fig 4a-d;. A Fig. 5a, b). Notavelmente, o padrão de PRAMEL1 localização alterada de acordo com as alterações morfológicas que ocorrem no núcleo e do acrossoma durante spermiogenesis (Figura 4a, e, i;. A Fig. 5-A-G). Quando os espermatídeos redondos começam a alongar-se e o flagelo começa a desenvolver, TUBB foi visto no lado oposto da coloração PRAMEL1 na região perinuclear, marcar a posição do desenvolvimento e formação manchette flagelo (Figura 4e, i;. A Fig. 5C g). Com o progresso da morfogénese espermátide, a coloração da proteína PRAMEL1 expandido ao longo de aproximadamente 1/3 da superfície nuclear, imitando o desenvolvimento do acrossoma (Fig. 5-A-G). Por conseguinte, os nossos resultados indicam claramente que a proteína PRAMEL1 está associada com o acrossoma em espermatídeos. Como controlos negativos, as secções foram coradas quer com o anticorpo primário pré-absorvido com o péptido correspondente ou com o anticorpo secundário única. Nenhum sinal de fluorescência foi detectada nas secções de controlo, indicando que a coloração não específica foi mínima. (Fig 4m-p;. A Fig. 5H)

secções transversais de adulto (@ 2 meses de idade) foram testículos de rato double-manchadas com o PRAMEL1 rato (verde) e anticorpos tuba (vermelho). A coloração PRAMEL1 foi observada em rodada (a), alongando (e) e (i) espermátides alongadas durante a espermiogênese. A coloração foi observada em tuba alongamento (F) e alongado espermatídeos (j), mas não em espermatídeos redondos (b). Todas as secções foram contrastadas com DAPI (Painéis C, G, K e S) para visualizar os núcleos. Painéis d, h, l e p são mescladas imagens para PRAMEL1, tuba e coloração DAPI. As pontas de seta apontam para uma área com sinais descritos. As inserções em d, h, e L são imagem ampliada para áreas marcadas-ponta de seta (ver também Fig. 5a, C, E e G). Painéis m e n são os controlos de anticorpos secundários de burro para marcado com FITC de IgG anti-cabra de burro e TRITC-IgG anti-ratinho, respectivamente. Ampliação é × 400. Barra de escala = 20 mm.

seções Testículo (A, C, E e G) e preparações de squash de túbulos seminíferos (b, d, f e h) foram coradas com anti-PRAMEL1 (verde) , anti-TUBB (vermelho) e DAPI (azul). imagens fundidas para o triple-coloração em espermátides redondas (a e b), espermátides elongando (c, d, e, f) e espermátides alongadas (g) são mostrados. A coloração PRAMEL1 foi observada na região da vesícula a acrossomal de todos os espermátides em desenvolvimento ea coloração TUBB foi observado no manchette de alongamento e espermátides alongadas. Como uma preparação de testículos polpa secundária de controlo sem anticorpo (h) foi corado com burro marcado com FITC anti-IgG de cabra e IgG anti-rato de burro TRITC-rotulados. Ampliação é × 1000. Barra de escala = 10 mm.

Localização de PRAMEL1 no testículo e epidídimo espermatozóides

Nós investigamos ainda mais a distribuição subcelular de PRAMEL1 em ​​espermatozóides do testículo /epidídimo através da realização de imunofluorescência indireta, utilizando o PRAMEL1- e α-tubulina (tuba) anticorpos espec�icos. Os espermatozóides foram coletadas de túbulos seminíferos esmagados de testículos maduros, e caput, corpus e Cauda regiões do epidídimo. Os resultados revelaram que, semelhante à coloração em espermatídeos, PRAMEL1 localiza-se principalmente à região anterior do acrossoma espermatozóides (figura 6a, b, d, e;. Tabela 2). Como foram observados padrões diferentes de coloração entre testicular e espermatozóides epididimal, mais de 200 espermatozóides de cada grupo (Tabela 2) foram examinados para estudar a localização detalhada da proteína PRAMEL1 em ​​células de esperma. Verificou-se que todos os espermatozóides testicular (100%) mostrou acrossomal localização de PRAMEL1, enquanto que apenas 86,5% de espermatozóides epididimal foram positivos para PRAMEL1 na região de acrossomal (Tabela 2). Além disso, PRAMEL1 foi observada sobre o principal peça do flagelo (41%) em espermatozóides de testículo (Fig. 6a, Tabela 2), enquanto que foi observado na peça de conexão (96%) e peça intermediária (87,9%) em espermatozóides epididimal (cabeça, corpo e cauda) (figura 6a, b, d, e;. Tabela 2). PRAMEL1 coloração também foi observada em gotículas citoplasmáticos de espermatozóides epididimal (Fig. 6D). Verificou-se que 55% de espermatozóides epididimal tinha gotículas citoplasmáticos localizadas na extremidade distal da parte média. Cerca de 73% dos portadores citoplasmática espermatozóides gota mostrou o sinal PRAMEL1 na gotícula citoplasmática (Fig 6d;. Tabela 2). Observamos, também, que o percentual de citoplasmática de espermatozóides portadores de gota variou entre os três ratos estudados. Para tanto testicular e espermatozóides epididimal, sem coloração PRAMEL1 foi observada na região de coroa circular do flagelo. TUBA foi localizada na região acrossomal anterior de cabeças de esperma, e a parte média e peça principal flagelo do esperma dos espermatozóides do epidídimo (Fig. 6a, b, d, e e). Nenhum sinal foi observado quando os anticorpos primários foram omitidos durante a coloração, sugerindo anticorpos de ligação não específicos mínimos de fluorescentemente secundário marcado (Fig. 6c, F).

Rato espermatozóides recolhidos a partir de preparações de squash de túbulos seminíferos (um , b e c) e epidídimo (d, e, f) foram coradas com o PRAMEL1 (verde), tuba (vermelho) anticorpos e DAPI (azul). A coloração PRAMEL1 foi observada na região de acrossoma testicular e espermatozóides epididimal (a, b, d e e). Em espermatozóides testicular (a) PRAMEL1 foi também detectado em a principal peça do flagelo de espermatozóides, enquanto que em espermatozóides do epidídimo (d, e) a coloração PRAMEL1 foi observada predominantemente em conectar peça, peça intermediária e gota citoplasmática. Como um controlo de anticorpo secundário a espermatozóides testicular (c) e epididimal (F) foram coradas com burro marcado com FITC anti-IgG de cabra e IgG anti-rato de burro TRITC-rotulados. Ampliação × 1000. Barra de escala = 10 mm.

Discussão

Apesar de PRAME tem sido extensivamente estudada na tumorigênese e biologia do câncer, e está sendo usado como um biomarcador para o diagnóstico de câncer e antígeno imunoterapia específica do cancro [28] – [32], [34], a função da família do gene PRAME na gametogénese e reprodução não foi caracterizado. No presente estudo, nós caracterizamos a expressão de mRNA e proteína do rato

Pramel1

gene, um membro da

PRAME

família de genes, durante o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese. Nossos resultados indicaram claramente que PRAMEL1 é expressa no citoplasma dos espermatócitos e acrossoma e flagelo de espermátides e espermatozóides, que fornecem a primeira visão sobre a função potencial do

PRAME

família de genes na espermatogênese. Para entender o papel biológico (s) desta família de genes inteira e a relação entre o

Pramel1

e outros membros da família, nós recuperamos os dados Expressional para um total de 10

PRAME

parálogos de Expressão do Gene Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/geo) (Tabela 3) [35] – [40]. Combinado com os dados RT-PCR obtidos a partir deste trabalho, fomos capazes de agrupar esses parálogos em três grandes grupos com base em seus perfis de expressão espacial e temporal: grupo I, expresso apenas em gônadas masculinas e células germinativas (

PRAME

e

Pramel1

); grupo II, expresso apenas em gônada feminina e células germinativas (

Oog1-3

); e grupo III, predominantemente expresso em ambas as gônadas masculinas e femininas (

Pramel, Praeml3, Pramef8, Pramef12,

e

Oog4

) (Tabela 3). Coletivamente, os padrões de expressão divergentes da

PRAME

paralogs durante a gametogênese em ambos os sexos masculino e feminino indicam que diferentes membros da

PRAME

família de genes podem estar envolvidos em diferentes estágios de desenvolvimento de gametogênese e embriogênese.

tem sido relatado em estudos anteriores que diferentes CTAs estão envolvidos em diferentes estágios da espermatogênese. Algumas das quais são expressos exclusivamente em uma fase, tal como SYCP1 (

sinaptonêmico complexo proteína

1, também conhecido como o HOM-TES-14), que é restrito a profase da meiose de espermatócitos, e SP17 (

proteína esperma

17), que é expressa no espermatozóide maduro apenas [41], [42]. Outros CTAs como CTAG1 (

Câncer /testículo antígeno 1

, também conhecido como NY-ESO-1) e TRO (

trophinin

, também conhecido como

magphinin

ou MAGE -D3), são expressas em várias fases da espermatogénese. CTAG1 é expresso em espermatogônia através espermatócitos paquíteno [43], [44], enquanto TRO é expresso em quase todos os tipos de células germinativas do espermatogônia para amadurecer espermatozóides [45]. No presente estudo, demonstramos que, como o

Tro

gene, o mouse

Pramel1

é expressa em termos gerais em diferentes tipos de células germinativas durante a espermatogênese. A proteína PRAMEL1 foi detectado pela primeira vez, embora a um nível relativamente baixo, nos testículos-nascidos por Western blot, sugerindo a expressão de PRAMEL1 em ​​espermatogônias. Um aumento do nível da gradualmente PRAMEL1 foi detectada em testículos em 1-, 2-, 3 semanas de idade e mantidos ao nível mais elevado em testículos maduros. Este aumento na expressão da proteína coincide com o aumento na expressão de RNA a partir de recém-nascido para testículos de 1 semana de idade, e poderia ser explicado por um aumento da regulação da expressão do gene, ou, em alternativa, por um aumento do número de células germinais que haja é a proliferação de células germinativas dramática antes da primeira onda de espermatogénese.

ao contrário das células de cancro em que a proteína foi PRAME localizadas no núcleo, o PRAMEL1 rato foi primeiro visto no citoplasma de espermatócitos em 2 semanas de idade testículos neste estudo. Uma expressão dominante da proteína PRAMEL1 foi então observado na região anterior (round, alongando e alongado) espermátides, coordenando com as alterações morfológicas do acrossoma, o que sugere que o

Pramel1

desempenha um papel no desenvolvimento do acrossoma . Além disso, observou-se que PRAMEL1 foi diferencialmente distribuídos ao longo de diferentes partes do flagelo de espermatozóides entre testicular e espermatozóides do epidídimo. À medida que a motilidade ganho de espermatozóides durante a transição a partir de testículos à região caudal do epidídimo, a localização diferencial de PRAMEL1 ao longo de diferentes partes do flagelo durante a transição de esperma pode ser uma indicação de que PRAMEL1 está envolvido na maturação do esperma e motilidade (ver discussão abaixo ).

estudos anteriores demonstraram que as células cancerosas funções PRAME, quer como um supressor de transcrição de sinalização RA [27], ou como um activador de transcrição em regiões promotoras ligado por NFY [29], [32]. No entanto, nossos dados sugerem que

Pramel1

não podem participar na regulação da transcrição através de mecanismos de RA @ e NFY mediadas porque (1) PRAMEL1 está localizada no citoplasma das células germinativas durante a espermatogênese, e (2) o mais importante, transcrição é desligado durante meados de spermiogenesis [27], [29], [31] e espermatozóides são células terminalmente diferenciadas essencialmente desprovidas de actividade de transcrição e tradução [46].

é interessante notar que dois LRR- contendo, proteínas expressas-testículo têm sido implicados na spermiogenesis, nomeadamente LRRC67 (

repetição rica em leucina contendo 67

, também conhecido como LRR testículos ou TLRR) e PPP1R7 (

proteína fosfatase 1, reguladora (inibidor) subunidade 7

, também conhecido como Sds22) [47], [48]. Ambas as proteínas interagem com uma fosfatase central,

proteína fosfatase 1 | (PP1), que serve como um gene de cubo em vários processos reguladores [46] – [48]. A proteína LRRC67 interage com a PP1, para formar um complexo envolvido na reorganização do citoesqueleto em células germinais masculinas [49]. A proteína LRRC67 também interage com um motor molecular relacionada com a cinesina, KIFC1 (

cinesina membro da família C1

), para o transporte de moléculas ao longo dos microtúbulos na manchette [33], [50]. Do mesmo modo, a interacção da PP1 e PPP1R7 também tem sido implicado no desenvolvimento do esperma. A dimerização de PPP1R7 PP1γ2 e leva a uma diminuição da actividade de fosfatase de PP1γ2 e, subsequentemente, induz motilidade dos espermatozóides caudal [51], [52]. Devido a padrões estruturais e de expressão semelhantes, prevemos que PRAMEL1 podem interagir com PP1γ2 para o transporte de moléculas ao longo dos microtúbulos no flagelo de espermatozóides. Ele continua a ser estabelecido se PRAMEL1 executa a função similar na acrossoma formação e mobilidade do esperma.

Materiais e Métodos

Animais

C57BL /6J foram criados em nossa colônia em a instalação do mouse Universidade Estadual da Pensilvânia, e um total de seis pares de criadores foram criadas. Os testículos foram removidos a partir de ratos a 0 dia (recém-nascido), 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas e 8 semanas de idade. Pelo menos três animais (réplicas biológicas) foram usados ​​para cada idade. Testículos, epidídimo e outros tecidos dos criadores adultos machos e ovários dos criadores do sexo feminino foram coletadas após o período de reprodução. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade do Estado da Pensilvânia (IACUC).

Preparação de tecidos testicular

Para histologia testicular, testículos inteiros foram dissecados de camundongos adultos e fixa por incubação durante a noite em solução de Bouin (Sigma-Adrich, St. Louis, MO) a 4 ° C. Os tecidos foram então lavados em etanol a 70%, desidratados e embebidos em blocos de parafina. Os tecidos embebidos em parafina foram seccionados a 4 mm utilizando um micrótomo e montadas em lâminas de vidro.

amostras testiculares Squashed foram preparados como descrito previamente [53]. Resumidamente, os testículos adultos foram retirados e transferidos para uma placa de Petri de vidro contendo PBS arrefecido em gelo (NaCl 140 mM, KCl 2,6 mM, Na 6,4 mM

2HPO

4, e KH 1,4 mM

2 PO?

4, pH 7,4). Após a remoção da túnica albugínea, túbulos seminíferos foram transferidos para uma nova placa de Petri contendo PBS. Usando uma pinça fina, os túbulos foram gentilmente se separaram e um pequeno pedaço de um único túbulo foi cortado. A peça de túbulo seminífero foi transferido para uma nova placa de Petri e de 15-30 uL de solução 0,1 M de sacarose preparado em PBS foi adicionado. As células foram lançados do túbulo com pinça para além do túbulo e re suspende-lo na solução de sacarose por pipetagem cima e para baixo.

Deixe uma resposta