Abstract

Up-regulada sirtuína 1 (SIRT1), uma NAD

+ dependente de classe III histona deacetilase, deacetylates p53 e inibe a sua actividade de transcrição, levando à sobrevivência celular. superexpressão SIRT1 tem sido relatada para prever a sobrevida pobre em algumas doenças malignas, incluindo cancro gástrico. No entanto, o efeito antitumoral da inibição SIRT1 permanece indefinida no câncer gástrico. Aqui, nós investigamos os mecanismos antitumorais de um inibidor da sirtuína, tenovin-6, em sete linhas celulares de cancro gástrico humano (quatro linhas celulares com o tipo selvagem

TP53

, dois com o tipo mutante

TP53

, e um com nulo

TP53

). Curiosamente, tenovin-6 induziu apoptose em todas as linhas celulares, não apenas aqueles com o tipo selvagem

TP53,

mas também do tipo mutante e nulos versões, acompanhada por sobre-regulação do receptor de morte 5 (DR5). Na linha celular KatoIII (

TP53

-null), DR5 silenciamentos marcadamente atenuada apoptose tenovin-6-induzida, o que sugere que o mecanismo fundamental para trás os seus efeitos anti-tumorais baseia-se na activação da via de sinalização de receptor de morte. Apesar de estresse do retículo endoplasmático causada por inibidores sirtuin foi relatado para induzir DR5-regulação em outras linhas celulares de cancro, não conseguimos encontrar ativação acentuada das suas moléculas relacionadas, tais como ATF6, vantagens, e CHOP, em células cancerosas gástricas tratados com tenovin- 6. Tenovin-6 em combinação com o docetaxel ou SN-38 exerceram uma ligeira a moderada sinérgica a citotoxicidade contra células de cancro gástrico. Em conclusão, tenovin-6 tem potente actividade antitumoral contra células de cancro gástrico humano por meio de DR5 sobre-regulação. Nossos resultados devem ser úteis para o futuro desenvolvimento clínico dos inibidores da sirtuin

Citation:. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose M, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antitumorais Efeitos de um Sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, contra as células cancerosas gástrica via Morte receptor 5-Up regulamento. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10.1371 /journal.pone.0102831

editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de outubro de 2013; Aceito: 23 de junho de 2014; Publicação: 17 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hirai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (a IH). Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro gástrico é uma das principais causas de morte por cancro em todo o mundo [1], [2]. Apesar de várias quimioterapias para câncer gástrico avançado têm sido desenvolvidos, o prognóstico é ainda são necessários fármacos anticancerígenos pobres e inovadoras para câncer gástrico. O câncer gástrico é um câncer biologicamente e geneticamente heterogénea envolvendo inúmeras mutações genéticas e epigenéticas alternâncias [3]. Entre estes, anormalidades do TP53

gene supressor do tumor desempenham um papel importante em tumorigénese [4], [5]. Aproximadamente 30% dos pacientes com câncer gástrico têm

TP53

mutação [6]. Mesmo nas células cancerosas com o tipo selvagem (wt)

TP53

, tem sido relatado que a função de

TP53

é suprimido pela regulação negativa incluindo ubiquitinação, metilação, e desacetilação [7], [8]. Neste contexto, seria uma estratégia promissora para supor que a inibição desses reguladores resultados negativos no aumento dos efeitos anti-tumorais através da activação de p53 em peso

TP53

cancros. Murino duplo minuto 2 (MDM2) é um grande antagonista fisiológico da p53 [7]. Nós relatado anteriormente que um inibidor de MDM2, nutlin-3, demonstraram efeitos antitumorais potentes contra células cancerosas gástricas através da activação da via do p53 [9]

1 Sirtuin (SIRT1), uma NAD

+ -. Dependentes histona-desacetilase (HDAC), tem uma variedade de funções envolvidas no silenciamento da cromatina, da longevidade, e estabilidade genómica. Pode ser encontrada no núcleo e actua como um sensor de estado metabólico da célula para a sobrevivência e senescência sob stress genotóxico e oxidativo [10], [11]. Além desacetilação da histona, estas funções dependem em parte da desacetilação de várias proteínas não-histona, incluindo os factores de transcrição: p53, forkhead box (FOXO) proteínas da família, kB factor nuclear, c-myc, N-myc, E2F1, e hipoxia-induzida factores de transcrição (HIF) 1α /2α; enzimas relacionadas com a cromatina: acetiltransferase histona, P300, subunidade de quinase dependente de DNA Ku80 e TIP60; elementos de reparo de DNA: Ku70, RAD51 e NBS1; e factores de sinalização celulares: STAT3, β-catenina, e Smad7 [11] – [13]. SIRT1 fisiologicamente interage com p53 e atenua as suas funções através de desacetilação em seu resíduo Lys382 C-terminal [12]. A sobre-expressão de SIRT1 foi encontradas em muitos cancros, tais como o estômago e cólon [10], [14], e relatado para funcionar como um promotor de tumor. SIRT2 é um dos citoplasmática NAD

+ – histona desacetilases dependentes e deacetylates histona H3 lisina 56 (H3K56) e α-tubulina. Ele também compartilha substratos não-histona de FOXO1, FOXO3 e p53 com SIRT1 [11]. No entanto, o papel exacto do SIRT2 permanece indefinida na biologia do câncer.

Neste contexto, investigamos se tenovin-6, um composto de pequena molécula que inibe funções SIRT1 e SIRT2 [15], [16], exerceu efeitos anti-tumorais através da activação da via do p53 em células de cancro gástrico. Recentemente, foi relatado que inibidores SIRT regulado para cima do receptor de morte 5 (DR5), um membro da família de receptores do factor de necrose tumoral, em alguns tipos de cancro [17], [18]. Nós, adicionalmente, estudou o envolvimento deste receptor na atividade antitumoral do tenovin-6 para o câncer gástrico. Além disso, examinou-se o sinergismo de tenovin-6 com drogas citotóxicas convencionais para o futuro desenvolvimento clínico no cancro gástrico.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Seven células de câncer gástrico foram usadas linhas: quatro linhas de células com peso

TP53

(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), com duas linhas de células de tipo mutante (mt)

TP53

(NUGC-3, STKM-1), e uma linha de células com nulo

TP53

(KatoIII) [19] – [21]. As linhas celulares com peso

TP53

(MCF-7 do cancro da mama, células de rim embrionário humano HEK293) e MRC-5 de fibroblastos humanos normais foram incluídos como controlos neste estudo. MKN-45, NUGC-4, KatoIII, e MRC-5 linhas celulares foram obtidas a partir de RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japão). SNU-1 e de células MCF-7 linhas foram adquiridas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). linhas celulares NUGC-3 e HEK293 foram obtidas a partir de Ciências da Saúde Research Resources Bank (Osaka, Japão). STKM-2 linhas celulares STKM-1 e foram gentilmente cedidas pelo Dr. Shunsuke Yanoma (Universidade da Cidade de Yokohama, Faculdade de Medicina, Japão).

Chemicals

Tenovin-6 foi comprado de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). O docetaxel, SN-38, cisplatina, 5-fluorouracilo (5-FU), doxorubicina e tapsigargina foram obtidos a partir de Wako (Osaka, Japão). Eles foram dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração de 20 mM e armazenaram-se aliquotas a -20 ° C. As soluções de reserva foram diluídas para as concentrações finais pretendidas com meio de crescimento antes de serem utilizados.

Os anticorpos e análise Western blot

electroforese SDS-polyaclylamidegel e transferência de Western foram realizados como previamente descrito [22]. Os anticorpos primários e secundários utilizados foram como se segue. Os anticorpos de coelho policlonais contra SIRT1 (D739), acetilado (Ac) -p53 (Lys382), fosforiladas (Phospho) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubulina (Lys40), de receptor de morte 5 (DR5), Fas anticorpos de domínio de morte -associated (FADD), poli clivada (ADP) polimerase -ribose (PARP) (Asp214) e monoclonal contra p21

Waf /Cip1

(DCS60), histona H3 (96C10) , β-actina (8H10D10), α-tubulina (DM1A) e proteína C /EBP homólogo (CHOP) (L63F7) e monoclonais de coelho anticorpos contra TRAIL (C92B9),-3 caspase (8G10), enzima que requer inositol (IRE ) 1α (14C10), e fosfo-ARN-dependente de proteína quinase-quinase como retículo endoplasmático (PERK) (16F8) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticorpo monoclonal de ratinho para p53 (BP53-12) foi adquirido a Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) anticorpo monoclonal era da Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), e anti-factor de activação de transcrição de anticorpo 6 (ATF6) monoclonal (70B1413.1) foi de Enzo Life Science (Farmingdale, NY). anticorpo policlonal de coelho para Ac-histona H3 (Lys18) foi da Merck Millipore (Billerica, MA). Tanto a peroxidase de rábano (HRP) -conjugated-ratinho anti IgG de ovelha anti-coelho e soros de IgG de burro eram de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). A ligação do anticorpo foi detectada utilizando um primeiro sistema ECL Ocidental Blotting Detection (GE Healthcare), em conformidade com o protocolo do fabricante. A intensidade do sinal foi quantificado utilizando Ez-captura II sistema de imagem de quimiluminescência (Atto, Tóquio, Japão).

PCR quantitativo em tempo real para análise de

SIRT1

e

SIRT2

expressão

amostras de RNA de genes foram extraídos a partir de lisados ​​de células utilizando um kit de isolamento de ARN alta puro (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Depois o ADN genómico foi removido por ADNase, o ADNc foi preparado utilizando uma ARN-a-kit de ADNc de Alta Capacidade (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). PCR em tempo real quantitativa foi realizada usando um Applied Biosystems 7500 Rápido Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primers e sonda TaqMan para

SIRT1

e

SIRT2

foram obtidos de Applied Biosystems (Ensaio ID: Hs01009005 e Hs00247263, respectivamente), e os de

18S RNA ribossomal (rRNA 18S)

concebidos e sintetizados por Sigma-Aldrich, foram as seguintes: 5′-AACCCGTTGAACCCCATTCG (iniciador directo), 5′-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (iniciador inverso), 5′-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sonda). As reações foram realizadas em triplicado em condições de ciclos térmicos padrão, utilizando 30 ng de cDNA, 900 primers nm, de 250 sondas nm e um Gene Expression Taqman Mestre Mix (Applied Biosystems), de acordo com o protocolo do fabricante.

RNAs extraídos a partir de células foram analisadas quanto as quantidades relativas do gene alvo (

SIRT1, SIRT2

) e o gene de referência (

18S rRNA

) por quantitativa PCR em tempo real.

ensaios de viabilidade celular WST-8

ensaios colorimétricos foram realizadas utilizando um celular Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japão), de acordo com o protocolo do fabricante 8-WST. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

3 células por poço com 100 ul de meio de cultura durante 24 h, tratada com tenovin-6 durante 72 h, incubadas na presença de WST-8, e, em seguida, analisados ​​com um leitor de microplacas iMark (Bio-Rad, Hercules, CA).

Análise da apoptose por citometria de fluxo

As células foram semeadas em placas de 60 mm a uma densidade de 5 × 10

5 por prato. Após incubação com tenovin-6 (10 uM) ou uma quantidade equivalente de DMSO, durante 72 h, as células foram suavemente levantada com Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) à temperatura ambiente durante 10 min. As células foram então lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato. As células apoptóticas foram detectadas por coloração dupla com iodeto de propídio (PI) e isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com anexina V-FITC utilizando um kit de apoptose Anexina V Detecção (Beckman Coulter, Brea, CA), em conformidade com o protocolo do fabricante. análise de citometria de fluxo foi então realizada com um fluxo FACS Calibur citômetro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e software CELLQuest (BD Biosciences).

siRNA segmentação

DR5

siRNA alvejando DR5 foi concebido usando o software siDirect (https://sidirect2.rnai.jp/), como relatado anteriormente [22]. ARNsi de transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), em conformidade com as instruções do fabricante. Controle siRNA foi uma sequência artificial projetado para ter o mínimo de homologia com genes humanos e de rato. O sentido e anti-sentido cadeias de siRNA utilizados neste estudo foram os seguintes: DR5, 5′-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 ‘(sentido), 5′-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3′ (anti-sentido); ARNsi de controlo, 5’-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 ‘(sentido), 5′-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3’ (anti-sentido).

Para a análise dos efeitos do siARN sobre o crescimento celular e a viabilidade, as células foram plaqueadas a uma baixa densidade (1 × 10

3 células por poço) em placas de 96 poços contendo 100 ul de meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de vitelo (Sigma-Aldrich). A viabilidade das células transfectadas foi avaliada 72 e 120 horas após a transfecção por WST-8 de ensaio.

índice Combinação

Para determinar se tenovin-6 pode intensificar os efeitos antitumorais dos agentes quimioterapêuticos convencionais, nós utilizado um índice de combinação (CI) e um isobolograma calculada usando software CalcuSyn (Cambridge, UK), em conformidade com o princípio do efeito médio do Chou e Talalay [23]. Nesta análise, CI 1,3 indica antagonismo; IC = 1,1-1,3 antagonismo moderado; CI = 0,9-1,1 efeito aditivo; IC = 0,8-0,9 ligeira sinergismo; IC = 0,6-0,8 sinergismo moderada; CI = 0,4-0,6 sinergismo; e IC = 0,2-0,4 forte sinergismo.

A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicado e foram repetidas pelo menos três vezes. Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão (SD). O significado das diferenças foi determinado pelo teste t de Student e o teste de Dunnett.

p

-Valores 0,05 foram considerados significativos

Resultados

A expressão de SIRT1, SIRT2 e acetilado (Ac) -p53 em linhas celulares de cancro gástrico

.

em primeiro lugar, examinamos os níveis de SIRT1, SIRT2 expressão, e Ac-p53 em sete linhas celulares de cancro gástrico. Utilizou-se células HEK293 para o controlo positivo de SIRT1 /2, e células MCF-7 tratadas com doxorrubicina para o controlo positivo de Ac-p53 [24]. Todas as linhas celulares de cancro gástrico, excepto para NUGC-4 e células STKM-1 expressa níveis elevados de proteína SIRT1, e os níveis de expressão foram SIRT2 baixo em todas as linhas celulares excepto para MKN-45 células (Figura 1A). Os níveis de expressão Ac-p53 foram muito baixas em todas as linhas celulares de cancro gástrico com peso

TP53

A:. A expressão de SIRT1, SIRT2, p53, Ac-p53, e fosfo-53 em sete linhas de células de cancro gástrico e fibroblastos MRC-5 foi analisada por Western blotting. Semi-quantificação de densitometria blotting normalização envolvido ocidental para p-actina níveis. MCF-7 *: células MCF-7 tratadas com doxorrubicina (1 uM, 24 h). B: Expressão de

SIRT1

mRNA e

SIRT2

mRNA em células de câncer gástrico. Níveis de

SIRT1

mRNA e

SIRT2

mRNA foram determinados em células cancerosas gástricas e MRC-5 de fibroblastos por quantitativa PCR em tempo real e normalizados ao nível de

18S rRNA

. níveis de mRNA são mostrados em relação aos de MRC-5 fibroblastos.

Foram analisadas a expressão do gene da

SIRT1

e

SIRT2

por PCR em tempo real quantitativo. MKN-45 células exibiram

SIRT1

a expressão do gene que foi cerca de 2,5 vezes mais elevada do que nos fibroblastos, mas outras linhas celulares de cancro gástrico fez não (Figura 1B). Em células NUGC-4, o nível de expressão do gene de

SIRT1

foi baixa, como foi proteína SIRT1. células MKN-45 mostrou ligeiramente elevada

SIRT2

expressão do gene, enquanto outras linhas celulares mostraram níveis de expressão bastante baixos.

Tenovin-6 inibiu o crescimento de células cancerosas gástricas

A fim para confirmar a atividade tenovin-6, que estudaram se tenovin-6 afetou a acetilação das histonas H3 e α-tubulina. Tenovin-6 aumentou a acetilação de histona em três (MKN-45, NUGC-4, e KatoIII) das quatro linhas celulares de cancro gástrico testados, indicando que a inibição da actividade de desacetilação SIRT1 (Figura 2A). Ac-α-tubulina aumentou apenas em uma linha celular (MKN-45) tratados com tenovin-6, portanto, a inibição da actividade deacetylation SIRT2 não pôde ser definitivamente mostrado em células cancerosas gástricas

:. Gástrico células cancerosas foram cultivadas com tenovin-6 (10 uM) para vários períodos de tempo e analisadas para os níveis de SIRT1, SIRT2, Ac-H3, e Ac-α-tubulina através de Western blotting. B: Tenovin-6 inibiu o crescimento de células cancerosas gástricas independentemente do

estatuto TP53

. Todas as experiências foram avaliadas por ensaio de WST-8 e levada a cabo em triplicado. Os resultados são expressos como a média ± DP. C: WST-8 ensaio foi realizado em células MRC-5 para comparar a toxicidade de tenovin-6 para as linhas de células de cancro. A inibição do crescimento de tenovin-6 em células NUGC-4 foi significativamente mais elevada do que em células MRC-5. A significância das diferenças foi avaliada utilizando o teste t de Student.

Em seguida, avaliamos o potencial efeito anti-tumoral de tenovin-6 contra as células cancerosas gástricas. Cada linha celular de cancro gástrico foi cultivada na presença de tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, e 50 uM) durante três dias. inibição do crescimento dependente da dose foi observada em todas as linhas celulares, não apenas aqueles com peso

TP53

mas também versões MT e nulos (Figura 2B). Seus

50 valores IC variou 2,34-4,28 M. Além disso, o ensaio de WST-8 foi realizada na linha de células de fibroblasto humano MRC-5 (IC

50: 6,09 uM) para comparar a toxicidade de tenovin-6 para as linhas de células de cancro gástrico. A viabilidade das células NUGC-4 tratadas com tenovin-6 foi significativamente menor do que a de células MRC-5, como mostrado na Figura 2C.

Tenovin-6 induzida morte celular por apoptose em células de cancro gástrico

Tal como mostrado na Figura 3A e S1, tenovin 6-tratamento aumentou a expressão de p53 e p21, em peso

TP53

células MKN45 (e NUGC-4). A regulação de Ac-p53 foi demonstrada em células MKN-45, mas não em células NUGC-4. O aumento da expressão de p21 também foi observada em MT

TP53

células (NUGC-3). Por contraste, a expressão de Bcl-2 não se alterou em quase todas as quatro linhas celulares de cancro gástrico. Aumentos de DR5 e expressão de PARP clivada foram observadas em todas as linhas celulares testadas. Os níveis de expressão de TRAIL, que funcionam como um ligando na sinalização da morte de acoplamento, foi ligeiramente aumentado em todas as linhas celulares, embora a expressão de FADD, um adaptador importante, não foi afectada pela tenovin-6.

A : análise tempo-curso da expressão de p53, a jusante molécula de p21

Waf /Cip1

, e moléculas relacionadas com a apoptose em células de cancro gástrico tratados com tenovin-6 (10 uM). A intensidade relativa da expressão das proteínas é mostrado na Figura S1. Tenovin-6 induzida a expressão de Ac-p53 e p21

Waf /Cip1

, mas não Bcl-2. expressão de DR5 foi fortemente induzida por tenovin-6. TRAIL, e PARP clivada foram ligeiramente aumentada, mas a expressão FADD não foi afetada. Um gibão de DR5 mostra seu precursor (banda superior) e isoformas maduros (banda inferior). B: Quatro linhas celulares foram tratadas com tenovin-6 (10 uM) ou um controlo de veículo, durante 72 h, duas vezes coradas com FITC-anexina V e PI, e analisadas por citometria de fluxo. A significância estatística das diferenças entre grupos foi avaliada utilizando o teste t de Student. *

p Art 0,01; **

p

. 0,05

Nós examinou se tenovin-6 diminuiu a viabilidade das células cancerosas gástricas através da indução de morte celular por apoptose. As células cancerígenas foram expostas a ele, a uma concentração de 10 uM ou uma quantidade equivalente de veículo de controlo (DMSO), durante 72 h, e depois coradas com anexina V-FITC e PI. Eles foram analisadas por citometria de fluxo: As células negativas para ambos anexina V e PI foram consideradas como sendo não-apoptótica, células positivas para anexina V foram apenas considerados a ser apoptótica precoce, e as células positivas para anexina V e PI foram consideradas tarde apoptótica ou necrótica. A exposição de células MKN-45 para tenovin-6 aumentou as fracções das fases precoces e tardios de apoptose de 2,8% a 52,1% e de 1,8% para 18,5%, respectivamente (Figura 3B). Aumentos semelhantes nas populações em fases precoces e tardios de apoptose foram observadas em outras linhas de células (NUGC-4, NUGC-3, e KatoIII). Tenovin-6 induzida apoptose em todas as linhas celulares testadas, independentemente do

TP53

status.

Efeito da

DR5

knockdown na apoptose induzida por tenovin-6

em seguida, verificar se

DR5

silenciamento afetados apoptose, viabilidade celular e taxa apoptótica tenovin-6-induzida foram analisados ​​por WST-8 ensaio e citometria de fluxo, respectivamente, em

TP53

-null células KatoIII. A inibição da expressão de DR5 por siARN específica (Figura 4A) reduziu significativamente a morte celular induzida por tenovin-6 e apoptose em células KatoIII (Figura 4B e 4C). Foram utilizados três siRNAs diferentes em nossa experiência preliminar, e temos os resultados similares com qualquer siRNAs

A:. Células KatoIII foram transfectadas com um controle nM siRNA ou siRNA contra mRNA DR5. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram tratadas com 5 uM tenovin-6 durante 24 h. Western blot mostrou a diminuição da regulação de DR5 por siRNA transfecção. Um gibão de DR5 mostra seu precursor (banda superior) e isoformas maduros (banda inferior). B: As células foram transfectadas com ARNsi de controlo de 1 nM ou DR5 ARNsi durante 48 h, tratada com 0,2, 1, e 5 uM tenovin-6 durante 72 h e, em seguida, submetidas a medições de viabilidade celular pelo ensaio de WST-8. A significância estatística das diferenças entre grupos foi avaliada utilizando o teste t de Student. *

p Art 0,01; **

p Art 0,05. C: O efeito do knockdown de DR5 em tenovin-6 induziu apoptose foi analisada por citometria de fluxo utilizando coloração de PI. Os resultados são expressos como a média ± DP. A significância estatística de diferenças entre os grupos foi avaliada utilizando o teste t de Student.

Nós investigamos ativação da via de estresse do retículo endoplasmático (ER), que está ligado ao DR5-regulação, conforme relatado anteriormente [ ,,,0],17]. CHOP é um do indutor mais potente de DR5 e a montante da apoptose, e frequentemente libertado durante o stress ER. Como mostrado na Figura 5A e 5B, embora CHOP foi marginalmente supra-regulados por tratamento tenovin-6 em todas as quatro linhas celulares de cancro gástrico, os níveis aumentados eram significativamente mais baixos do que em células de controlo tratadas com tapsigargina, que é um inibidor selectivo de sarcoplasmático /retículo endoplasmático Ca

2 + – ATPase e amplamente utilizado como um stressor celular ER [25], [26]. Nas outras mãos, IRE1, que é um sensor de tensão e ER localizado no montante de CHOP, foi ligeiramente sobre-regulada pelo tratamento tenovin-6 em todas as linhas celulares, mas não fosforilada e PERK ATF6. [27], [28]. Parecia improvável que tenovin-6 causada estresse ER levando à indução de DR5 em nossas células cancerosas gástricas

A:. A expressão de proteínas associadas com o estresse ER em linhas celulares de cancro gástrico, antes e após o tratamento com 10? M tenovin-6 . Tapsigargina em 3 uM foi administrado a células HEK293 como um controlo. Um dupleto de DR5 mostra seu precursor e isoformas maduros. B: Intensidade relativa de expressão de CHOP em linhas celulares testadas é mostrado. A significância estatística de diferenças entre os grupos foi avaliada pelo teste de Dunnett.

efeito antitumoral de tenovin-6 em combinação com agentes quimioterapêuticos

Finalmente, examinamos se tenovin-6 aumentou a antitumoral efeitos de agentes quimioterapêuticos incluindo o docetaxel, SN-38, cisplatina, 5-FU e, em linhas celulares de cancro gástrico. Quatro linhas celulares com peso

TP53

(MKN-45, NUGC-4), mt

TP53

(NUGC-3), e nulos

TP53

(KatoIII) foram tratados com estes agentes, isoladamente ou em combinação com duas doses (2 e 5 uM) de tenovin-6. As concentrações foram 0,25 nM de docetaxel, 1 nM SN-38, 0,5 ou 1 uM de cisplatina, e 0,25 uM de 5-FU. Como mostrado na Tabela 1 (e Figura S2), o docetaxel e SN-38 mostrou uma ligeira a moderada efeito sinérgico no tratamento tenovin-6 em três linhas celulares, e cisplatina com tenovin-6 apresentou um efeito sinérgico moderada em duas linhas celulares, enquanto 5-FU em combinação com tenovin-6 apresentou um efeito menor do que os outros agentes. Foram examinadas as expressões de DR5 após a administração de tenovin-6 com agentes quimioterapêuticos. DR5 up-regulação por tenovin-6 foi aprimorado com uma combinação de docetaxel em MKN-45 células (Figura S3).

Discussão

Nós demonstramos que tenovin-6 mostrou potente antitumor atividade acompanhada de morte celular por apoptose em células de cancro gástrico humano com peso

TP53

, bem como aqueles com mt

TP53

. Vários inibidores específicos de SIRTUINAS, tais como sirtinol, suramina, salermide, e tiobarbitúricos, foram relatados para inibir o crescimento celular em vários tipos de cancro [29]. A maioria dos pesquisadores descreveram os efeitos antitumor dos inibidores de sirtuína em linhas de células com peso

TP53

[15], [29] – [31], e atribuída estes para a activação da apoptose por meio de acetilação da p53. Enquanto isso, vários relatórios foram publicados nos últimos anos que mostravam as atividades antitumorais de inibidores da sirtuína em linhas celulares com mt

TP53

através de vias independentes de p53 [17], [18]. Nós mostramos que DR5 knockdown atenuou os efeitos antitumorais de tenovin-6 em

TP53

células cancerosas gástricas -null. A activação da via de sinalização do receptor de morte através de sobre-regulação de DR5 desempenha um papel essencial na morte celular induzida tenovin-6-, como mencionado em outros relatórios sobre os inibidores da sirtuína.

Tem sido relatado que a expressão aumentada de DR5 salermide e a apoptose induzida em células de cancro de pulmão de células não-pequenas humano transportando MT

TP53

[17]. Nesse relatório, o silenciamento simultânea de

SIRT1

e

SIRT2

, bem como salermide-regulada DR5, acompanhado do aumento da regulação das proteínas relacionadas com o stress do ER, tais como ATF4 e CHOP. Estes resultados sugerem que o estresse ER estava envolvido nesse indução DR5. Especulamos que tenovin-6 também levou a um aumento da expressão de DR5 por meio da ativação de estresse ER mediada por PERK, IRE1, ATF6 e CHOP. No entanto, ao contrário das expectativas, a via de sinal de estresse ER ativado por tenovin-6 não foi obviamente detectada. No entanto, houve clara evidência de que DR5 foi induzida por tenovin-6. Existem outras vias de mediadas-CHOP DR5 up-regulation: espécies de oxigénio reactivas (ROS), o

cinase 2-terminal (JNK) via c-jun NH, o percurso da proteína quinase activada por mitogénio p38, e assim por diante [ ,,,0],32] – [38]. No entanto, nós não examinamos essas vias aqui porque não foi possível identificar ativação CHOP em nosso estudo. Os nossos resultados sugerem que outras vias de p53 e CHOP-independentes participar na expressão induzida por DR5 tenovin-6-em células de cancro gástrico.

Demonstrámos que tenovin-6 induzida morte celular por apoptose através da activação da via de DR5. No entanto, o p53 e CHOP vias parecia improvável de ser envolvido neste indução de DR5, e o mecanismo de DR5 sobre-regulação permanece obscura. Nós, recentemente, investigou os efeitos antitumorais de tenovin-6 em várias linhas celulares de cancro do cólon, e encontrou a sua actividade antitumoral potente contra a maioria deles com up-regulação da DR5 bem [39]. No entanto, em células cancerígenas do cólon Caco2 (mt

TP53

), a morte celular por apoptose por tenovin-6 foi menos evidente e expressão DR5 não era fortemente regulado para cima. celular CaCo2 têm sido relatados para expressar elevado nível de proteínas de choque de calor conhecido como um supressor de DR5 [40] – [43]. Esta relação deve ser mais estudada no futuro. SIRT1 pode desacetilar histona H4 lisina 16 (H4K16), bem como H3K9, H3K14, e H1K26, que estão intimamente relacionados com o silenciamento de genes [11]. Além disso, ele tem muitos substratos correspondentes não-histonas: factores de transcrição, elementos de máquinas de reparação do ADN, os receptores nucleares, enzimas modificadoras de histonas, e moléculas de sinalização de células, como descrito noutro local [11] – [13]. Estas associações numerosas e complicadas de atividade SIRT1 está envolvido em várias funções biológicas, como a regulação da expressão gênica e DNA reparação de danos. As células cancerosas tendem a exigir essas funções de SIRT1, a fim de sobreviver, proliferar, e reparar danos genómicos catastrófico. Estudos recentes identificaram a capacidade de tenovin-6 para induzir a diferenciação e inibir a autofagia como parte dos seus efeitos anti-neoplásicas em células de leucemia [44], [45]. Pode dependem do comportamento de células de cancro como tenovin-6 afecta a actividade neoplásica. Mais estudos são necessários para esclarecer a ligação entre a via de morte mediada tenovin-6-e os papéis complexos de SIRT1.

Foram examinados os efeitos da combinação de docetaxel, SN-38, cisplatina e 5-FU com tenovin -6 porque eles têm sido amplamente utilizados para o tratamento de pacientes com cancro avançado gástrica [46], [47]. Ligeira a moderada efeitos sinérgicos de docetaxel e SN-38 com tenovin-6 nas linhas celulares de cancro gástrico, independentemente do

TP53

status, foram encontrados.

Embora os tratamentos envolvendo combinações de docetaxel e sirtuin inibidores não têm sido relatados, as combinações de docetaxel e outros inibidores de HDAC, tais como tricostatina a e suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) foram referidos como tendo efeitos sinérgicos relacionados com a activação de caspase ou acetilação tubulina em várias linhas celulares de cancro [48] – [50] . Em nosso estudo, ainda não está claro se a acetilação tubulina por tenovin-6 afetada sempre o efeito antitumoral, porque a acetilação tubulina foi mostrado apenas em uma linha de células. SN-38 (a forma activa de irinotecano) é um inibidor da topoisomerase I de ADN que actua apenas durante a fase S e interfere com a replicação do ADN e a divisão celular [51], [52]. inibidores de HDAC induzem acetilação das histonas e soltar a estrutura da cromatina, pela qual inibidor da topoisomerase podem acessar mais facilmente DNA, facilitando o dano ao DNA [51], [53]. Além disso, um notável aumento de geração de ROS foi relatada em células de pequenas células do cancro do pulmão após exposição simultânea a SAHA e topotecano (um derivado de camptotecina) [51]. O aumento da potência de tratamento que combina tenovin-6 e SN-38 pode ser atribuível a regulação da resposta cooperativa danos no ADN.

A vantagem da terapia combinada com tenovin-6 e cisplatina ou 5-FU foi menor do que com os outros agentes em células de cancro gástrico, embora diversos relatórios demonstraram a melhoria da apoptose por tratamento combinado com cisplatina ou 5-FU e outros inibidores de HDAC em outros tumores [54] – [57].

em relação à avaliação da toxicidade dos tenovin-6, foi utilizada uma linha celular de fibroblastos, como as células não tumorigénicas alternativos para prever a toxicidade contra células normais referentes aos relatórios anteriores [15], [18]. Foi difícil encontrar um controlo normal apropriado para estudos comparativos, e é, portanto, definitivamente necessário para estudar a toxicidade de tenovin-6 (em combinação com drogas anti-câncer)

in vivo

, utilizando modelos animais de xenotransplante.

Em conclusão, um inibidor da sirtuína, tenovin-6, mostrou um efeito antitumoral robusta contra as células cancerosas gástricas humanas. Este foi independente da

estatuto TP53 Comprar e foi induzida através de aumento da regulação do DR5.