Abstract

A longa RNA não codificante HOTAIR foi relatado para ser um biomarcador de prognóstico pobre em uma variedade de tumores malignos. No entanto, pouco se sabe sobre a associação de HOTAIR com câncer gástrico. Foi examinada a expressão de HOTAIR em 68 amostras de cancro gástrico utilizando quantitativo em tempo real de RT-PCR e analisaram a sua correlação com os parâmetros clínicos. O papel funcional da HOTAIR foi examinada através da geração de linhas celulares de cancro gástrico humano com aumentada ou suprimida a expressão HOTAIR. O crescimento independente de ancoragem foi avaliada por ensaio de agar mole. O HOTAIR aumentada ou suprimida expressando células de cancro gástrico foram injectados na veia da cauda ou a cavidade peritoneal de ratinhos imunodeficientes para examinar o efeito desta molécula em metástase e disseminação peritoneal. A expressão de HOTAIR foi significativamente maior em lesões de cancro do que em tecidos não-cancerosas adjacentes em cancros gástricos humanos. No tipo difuso de câncer gástrico, o grupo de alta HOTAIR (HOTAIR /GAPDH 1) mostrou invasão significativamente mais venosa, metástases em linfonodos frequentes e uma taxa de sobrevivência global inferior em comparação com o grupo de baixo HOTAIR (HOTAIR /GAPDH 1). A formação de colónias no agar mole foi melhorada de um modo HOTAIR-dependente. HOTAIR-expressando MKN74 formado mais metástases do fígado em comparação com o controle quando foram injectados na veia da cauda de ratinhos. Além disso, a reduzida expressão de HOTAIR em Kato III suprimida disseminação peritoneal. Estes resultados sugerem que HOTAIR desempenha um papel fulcral no desenvolvimento do cancro gástrico

citação:. Endo H, Shiroki t, Nakagawa T, M Yokoyama, Tamai K, Yamanami H, et al. (2013) expressão aumentada de Long RNA não codificante HOTAIR está associado com o desenvolvimento do câncer gástrico. PLoS ONE 8 (10): e77070. doi: 10.1371 /journal.pone.0077070

editor: Dajun Deng, Peking University Hospital do Câncer e do Instituto, China

Recebido: 10 de junho de 2013; Aceito: 05 de setembro de 2013; Publicação: 10 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Endo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por numbers24791480 JSPS KAKENHI concessão e 24.591.022 (http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html) e grant-in-aid de HIROMI Medical Research Foundation (http: //www.smtb .jp /pessoal /atribuição /gestão /público /example /pdf /natural 06a.pdf) e Daiwa Securities Fundação de Saúde (http://www.daiwa-grp.jp/dsh/grant/outline.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a incidência e mortalidade por câncer gástrico têm diminuído drasticamente ao longo dos últimos 50 anos na maioria das áreas do mundo, mas ainda continua a ser a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Apesar dos recentes avanços nas técnicas de diagnóstico, como a ampliação da endoscopia com imagem de banda estreita (NBI) [2], e em tratamento, incluindo terapia-alvo [3,4], ainda há um grande número de pacientes com câncer gástrico com mau prognóstico. O mecanismo patogênico contribuindo para a função biológica agressiva na esse tipo de câncer ainda precisa ser esclarecida.

Os projectos de sequenciação do genoma revelou que o genoma humano é composto de genes codificadores de proteínas inferior a 2%, e mais de 90% do genoma é transcrito como RNAs não-codificantes (ncRNA) [5-7]. Estes ncRNAs são classificados em dois grupos, dependendo do tamanho de nucleótidos. Micro RNAs são cerca de 18-25 nucleótidos de comprimento, enquanto longo de ARN não-codificante é composto por mais de 200 nucleótidos. HOTAIR é um RNA não-codificante tempo que foi identificado a partir de uma matriz de lavra costume do locus HOXC. HOTAIR foi mostrado para trimethylate Histon H3 lisina-27 da HOXD loco com o complexo repressor Polycomb 2 (PRC2) e inibir a expressão do gene HOXD, localizado num cromossoma diferente [8]. HOTAIR promove metástase através da interação com PRC2 para reprimir a transcrição de vários genes supressores de metástase em câncer de mama [9]. A expressão aumentada de HOTAIR está associada a invasão, metástase e mau prognóstico em uma variedade de cancros, tais como cancro da mama, do cólon, do pâncreas e cancro do pulmão [9-12]. No entanto, pouco se sabe sobre a expressão e /ou a função de HOTAIR no desenvolvimento de carcinoma gástrico. No presente estudo, investigamos o envolvimento de HOTAIR no desenvolvimento do cancro gástrico humano e analisou se a sua expressão se correlacionam com o comportamento agressivo de câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Tecidos

68 tecidos de câncer gástrico foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia em Miyagi Cancer Center (Natori, Japão), entre 2007 e 2011. Todas as amostras foram imediatamente congeladas logo após ressecção em azoto líquido e armazenadas a -80 ° C ou fixo em 10% de formalina tamponada e embebido em cera de parafina. Os cancros gástricos foram histologicamente classificados como tipo intestinal (n = 36), tipo difuso (n = 32) de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde e relatórios anteriores [13]. Nenhum paciente recebeu quimioterapia e radioterapia antes da cirurgia. Para análise estatística, a sobrevivência global foi definida por morte devido a qualquer causa, e foram usadas curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier.

As linhas celulares

O linhas celulares de cancro gástrico MKN74 (tipo intestinal) [14] e KATO III (tipo difuso) [15] foram obtidos a partir RIKEN Bioresource Center (Tsukuba, Japão). Ambas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco /Life Technologies Co., CA) contendo 10% de FBS inactivado (Euroclone, Milão, Itália) com 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Gibco /Life Technologies Co. , CA) e cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C.

preparação de ARN, transcrição reversa e quantitativa PCR em tempo real

O ARN total a partir de amostras congeladas e linhas de células foi extraído por isogene (Nippon Gene, Tóquio, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. cDNAs a partir de todas as amostras foram sintetizados a partir de 1,0 ug de ARN total por PrimeScript® primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Takara Bio, Siga, Japão) seguindo o protocolo do fabricante. A expressão de HOTAIR foi quantificada por LightCycler SYBR Verde Brilhante kit de qRT-PCR (Roche Applied Science, IN) seguindo o protocolo do fabricante com os conjuntos de iniciadores específicos de acordo com o estudo anterior [9]. O nível de expressão HOTAIR em cada amostra foi normalizada para o respectivo nível de expressão de GAPDH. A especificidade de cada reacção de PCR foi confirmada por análises de fusão curva.

expressão HOTAIR vector retroviral

HOTAIR ADNc humano (addgene, Cambridge, MA) foi amplificado por PCR e foi inserido no pBabe Puro vetor (pBabe -HOTAIR). retrovírus recombinante foi produzido com platina-A (Plat-A, na condição de pelo Prof. Kitamura) linhas celulares de empacotamento, como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, as células Plat-A foram transfectadas com pBabe -HOTAIR ou pBabe-Puro Vector (EV). Fugene-6 (Roche Applied Science) e de Opti-MEM I (Gibco tecnologias /Life Co.) foram adicionados seguindo o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, o sobrenadante contendo o retrovirus foi recolhido e passado através de um filtro de 0,45 um. células MKN74 foram infectadas com os retrovírus recombinantes e, em seguida, seleccionada com puromicina.

RNA de interferência

Para knockdown HOTAIR em Kato III, foram utilizados sistemas de RNAi Knockout ™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, foi elaborado quatro shRNA sequência alvo HOTAIR como mostrado na Tabela 1. Após o recozimento dos oligonucleótidos complementares shRNA, nós ligados os oligonucleótidos recozidos no vector pSIREN (shHOTAIR). Em seguida, as células transfectadas Plat-A com shHOTAIR ou pSIREN Vector (EV), e infectadas KATO III com os retrovírus recombinantes e seleccionadas com puromicina. As células transduzidas com o SH-HOTAIR2 e -3 vector foram escolhidos para posterior estudo. Cada

no experimento vitrto

foi realizada em triplicado, repetido três vezes e dados representativos são mostrados.

shRNA

Sequence

shHOTAIR-1sensegatccgaacgggagtacagagagattttcaagagaaatctctctgtactcccgttcttttttganti-senseaattcaaaaaagaacgggagtacagagagatttctcttgaaaatctctctgtactcccgttcgshHOTAIR-2 sensegatccgccacatgaacgcccagagattttcaagagaaatctctgggcgttcatgtggttttttg anti-senseaattcaaaaaaccacatgaacgcccagagatttctcttgaaaatctctgggcgttcatgtggcgshHOTAIR-3 sensegatccgtaacaagaccagagagctgttttcaagagaaacagctctctggtcttgttattttttganti-senseaattcaaaaaataacaagaccagagagctgtttctcttgaaaacagctctctggtcttgttacgshHOTAIR-4sensegatccaattcttaaattgggctggttcaagagaccagcccaatttaagaattttttttganti-senseaattcaaaaaaaattcttaaattgggctggtctcttgaaccagcccaatttaagaattgTable 1. Sequências de shRNA insere para expressar o vector shHOTAIR.

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crescimento celular ensaio

1 x 10

4 células foram semeadas por poço em placas de 96 poços no crescimento celular normal meios de comunicação. O ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio, tetrazole amarelo (MTT) foi realizada utilizando um kit de proliferação celular I (GE Healthcare Life Sciences, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. As medições de absorvância a 570 nm por VersaMax (Molecular Devices, CA) foram feitas para estimar a produção de MTT-formazano, após 24, 48 e 72 horas de incubação. O índice foi avaliada às 48 horas e 72 normalizada para que às 24 horas.

macia de ágar de ensaio de formação de colónias

Os ensaios de agar mole foram construídas em placas de 6 poços. A camada de base de cada poço consistiu de 1 mL com concentrações finais de 1 x media (RPMI-1640 mais 10% de FBS inactivado) e 0,6% de agarose de baixo ponto de fusão. As placas foram arrefecidas a temperatura ambiente até sólido, ponto em que uma camada de agar de crescimento de 1 ml verteu-se, que consiste de 1 x 10

4 células em suspensão em 1 x media e 0,3% de agarose de baixo ponto de fusão. As placas foram mais uma vez arrefecida à temperatura ambiente até que a camada de crescimento congelada. Mais 1 ml de 1 x sem meios de agarose foi adicionado em cima da camada de crescimento no dia 0 e novamente no dia 14 do crescimento. As células foram deixadas a crescer a 37 ° C durante 4 semanas e as colónias totais foram contados.

Animais

6 semanas de idade NOD fêmea /Shi-SCID-IL2Rγ

nula (NOG ) murganhos foram adquiridos a partir de Central Institute para Animais experimentais (CIEA, Kawasaki, Japão) e usado nesta experiência. Eles foram deixados aclimatar durante uma semana antes das experiências. Eles foram alojados em uma sala limpa da instalação de cuidados com os animais em Miyagi Cancer Research Center e mantido sob condições normais de temperatura, umidade e condições de iluminação cronometrados e desde libitum rato ad ração /água.

ensaio veia da cauda de metástase de células cancerígenas

Para avaliar o efeito de expressão HOTAIR em metástase transmitidas pelo sangue, nós injetado 1,0 x 10

5 células de HOTAIR- (n = 9) ou EV-expressando (n = 9) MKN74 com 0,2 ml de PBS na veia da cauda de ratinhos. Os ratinhos foram observados em geral, para sinais de doença por semana, durante a duração da experiência, e eles foram sacrificados 8 semanas após a injecção. Os pulmões, fígado, rins, glândulas supra-renais, e baços dos ratos foram extirpados e foram investigados macroscopicamente sobre a presença de metástase.

metástase peritoneal

1,0 X 10

6 células de shHOTAIR- (n = 5) ou EV-expressando (n = 5) KATO III foram injectados com 0,2 ml de PBS no peritoneu de ratos, para avaliar o efeito da expressão HOTAIR em metástase peritoneal. Os ratinhos foram observados em geral, para sinais de doença por semana, durante a duração da experiência, e eles foram sacrificados 8 semanas após a injecção. A presença de nódulos e ascite na cavidade peritoneal foi investigada.

Histologia e imunohistoquímica

Os tecidos excisados ​​foram fixados em formalina a 10% tamponada por 24 horas, em seguida, corte e embebidos em parafina para microscópica investigação. As amostras foram cortadas em secções de 4 um de espessura e corados com hematoxilina e eosina (H E). Foi investigada a presença de micro-metástases que não foi reconhecido macroscopicamente. Os tumores reconhecidos foram investigados imunohistoquímica utilizando anticorpo primário para citoqueratina humana (Anti Cytokeratin Baixo, DC10 /5D3, Nichirei Co, Tóquio, Japão) para se certificar de que eles foram obtidos a partir de células de câncer gástrico humano injetado. Após desparafinização, as secções de tecido foram incubadas em metanol com peróxido de hidrogénio a 0,3% em água destilada durante 20 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena. A recuperação de antígenos foi realizada por pressão de cozedura a 95 ° C durante 5 min em 10 mM de tampão citrato, pH 6,0, e, em seguida, deixou-se arrefecer à temperatura ambiente durante 30 minutos. biotina endógena ou locais de ligação a avidina foram bloqueados por incubação sequencial durante 30 minutos. As secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário descrito acima e foram feitos reagir com o segundo anticorpo. Um complexo de peroxidase avidina-biotina foi utilizado para detectar o segundo anticorpo. A coloração foi visualizada com diaminobenzidina (DAB). As secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e lavada utilizando um gradiente de etanol a xileno.

A análise estatística

A correlação da expressão HOTAIR com clinicopatológicas variáveis ​​do paciente e a taxa de metástases no injectado camundongos foram analisados ​​pelo teste do qui-quadrado. A significância estatística das diferenças entre os 2 grupos foi determinada por meio do teste de Wilcoxon e

valor P

(

0,05) foi considerado estatisticamente significativo. diferença estatística entre os 3 grupos foi avaliada pelo teste de aço Dwass ou análise de Bonferroni e

P valor

( 0,017) foi considerado como probabilidade de sobrevivência geral estatisticamente significativa foi analisado pelos métodos de Kaplan-Meier e avaliadas por log-rank teste e

valor P

( 0,05) foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-Ekuseru Toukei 2012 (social Survey Research Information Co., Ltd., Tóquio, Japão). O

valor P

( 0,05) foi considerado como estatisticamente significativa

Ética

O Conselho de Revisão Institucional do Centro de Câncer Miyagi (MCC) aprovou este protocolo de estudo,. e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente (Permit Number: MCC-22-30). O protocolo de experiências com animais foi aprovado pelo Comité de MCC animal Cuidado e Uso (Permit Number: MCC-AE-2011-12).

Resultados

A expressão HOTAIR de amostras de cancro gástrico humano

os níveis de expressão hOTAIR de tecidos não cancerosos cancerosas e adjacentes dos pacientes com câncer gástrico foram examinadas por qRT-PCR e normalizada pelo nível de expressão de GAPDH. O nível de expressão significativo de HOTAIR era 4,952 ± 6,462 e 3,804 ± 6,721 (HOTAIR /GAPDH ± desvio padrão) em lesões de carcinoma e não-cancerosas, respectivamente. Os níveis de expressão HOTAIR foram significativamente mais elevados nas lesões de carcinoma comparação com aqueles das lesões não-cancerosas (

P

= 0,019, Figura 1A).

A, os níveis de expressão de HOTAIR cancerosos e cancerosos adjacentes os tecidos de doentes com cancro gástrico foram examinados por qRT-PCR e normalizado pelo nel de express de GAPDH. Os níveis de expressão HOTAIR foram significativamente mais elevados nas lesões de carcinoma comparação com aqueles das lesões não-cancerosas (

P

= 0,019). B e C, os tecidos com cancro gástrico humanos foram ainda classificados de acordo com o nível de expressão HOTAIR em um grupo de alta HOTAIR (HOTAIR /GAPDH 1,0) e do grupo de baixa HOTAIR (HOTAIR /GAPDH 1,0) na intestinal (B ) e tipo difuso (C) de câncer gástrico, respectivamente.

associação entre a expressão de HOTAIR e os fatores clínico-patológicos em cancros gástricos humanos

os tecidos com cancro gástrico humanos foram histologicamente classificados em intestinal (n = 36) e os tipos difusos (n = 32). Os tecidos com cancro gástrico humanos foram ainda classificados de acordo com o nível de expressão HOTAIR no grupo de alta HOTAIR (HOTAIR /GAPDH 1,0) e do grupo de baixa HOTAIR (HOTAIR /GAPDH 1,0) (Figuras 1B e C). A associação da expressão de HOTAIR com as características clinicopatológicas do tipo intestinal e difuso do cancro gástrico é resumido nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. No tipo intestinal de câncer gástrico, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a expressão HOTAIR e os achados clínico-patológicos (Tabela 2). Além disso, nenhuma relação significativa foi observada entre a expressão HOTAIR ea sobrevida global, embora o grupo de alta HOTAIR tenderam a apresentar menor sobrevida do que o grupo de baixa HOTAIR (Figura 2A). Por outro lado, uma associação significativa foi encontrada entre a expressão HOTAIR e metástase linfática (P = 0,043), infiltração venoso (

P

= 0,0083) e sobrevida global curta (

P

= 0,018) no cancro gástrico tipo difuso (Tabela 3 e Figura 2B). No entanto, não houve associação entre o palco e expressão HOTAIR.

HOTAIR baixo

HOTAIR alta

P valor

Age73.07 ± 9.1870.87 ± 10.650.53Gender0.63Male1016female37T0.87T1, T2610T3, T4713N0.26N078N1, N2 , N3615Ly0.68ly069ly1, LY2, ly3714v0.19v089v1, v2, v3514Stage0.501,27153,4680.50Table 2. A associação de expressão HOTAIR com características clinicopatológicas em tipo intestinal de câncer gástrico.

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HOTAIR baixo

HOTAIR alta

P valor

Age59.250 ± 10.7566.35 ± 10.160.07Gender0.71male812female48T0.87T1, T212T3, T41118N0.043*N086N1,N2,N3414ly0.40ly067ly1,ly2,ly3613v0.0083*v0119v1,v2,v3111Stage0.311,2783,4512Table 3. A associação de expressão HOTAIR com características clinicopatológicas em tipo difuso de câncer gástrico.

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A, No tipo intestinal de câncer gástrico, nenhuma relação significativa foi observada entre a expressão HOTAIR e sobrevida global, embora o grupo de alta HOTAIR tenderam a apresentar menor sobrevida do que o grupo de baixa HOTAIR. B, o grupo de alta HOTAIR mostrou sobrevivência significativamente menor do que o grupo de baixa HOTAIR no tipo difuso de câncer gástrico (

P

= 0,018).

Geração de HOTAIR para cima e as células e correlação com a viabilidade celular

regulada Para avaliar o papel funcional da hOTAIR no desenvolvimento do câncer gástrico, geramos estavelmente hOTAIR expressar MKN74 células (MKN-hOTAIR) e de forma estável shHOTAIR expressando células KATO III (KATO- shHOTAIR). qRT-PCR A análise revelou que as células MKN-HOTAIR expressa um nível de HOTAIR cerca de 10 vezes a do EV expressando (MKN-EV) ou células MKN74 parentais e que a expressão desta molécula foi reduzida de 30 para 70% em células KATO-shHOTAIR em comparação com EV transduzidas (KATO-EV) ou células parentais KATO III (KATO-EV) (Figura 3A). Os resultados do ensaio de MTT demonstraram que nem para cima nem para baixo-regulação-regulação da proliferação celular afectada HOTAIR cancro gástrico (Figura S1).

A, os níveis de expressão relativos HOTAIR em linhas celulares de cancro gástrico foram analisados ​​por qRT- A análise de PCR. células MKN-HOTAIR expressa cerca de 10 vezes maior níveis de HOTAIR do que as células MKN74 parentais e MKN-EV. Por outro lado, a expressão de HOTAIR em células KATO-shHOTAIR foi reduzido em 30 a 70% em relação a células KATO III e KATO-EV parentais. B, O gráfico de barras que demonstra a expressão relativa da HOTAIR em linhas celulares de cancro gástrico, tecidos normais e carcinoma do estômago analisada neste estudo. Expressão de HOTAIR foi normalizada para a da GAPDH. Os valores são expressos relativamente a 1,00 para a expressão em células MKN74 parentais.

macia de ágar de ensaio de formação de colónias

Para elucidar as funções de HOTAIR no crescimento independente de ancoragem de células de cancro gástrico, utilizamos um ensaio em agar mole. células MKN-HOTAIR formado um maior número de colónias do que as células MKN-VE (

P

= 0,009, Figura 4A). Consistente com este achado, as células KATO-shHOTAIR mostraram significativos menos colónias do que as células KATO-EV (Figura 4B). Além disso, as células de cancro gástrico com nível de expressão HOTAIR semelhante (MKN-HOTAIR e shHOTAIR-3, Figura 3B) formada números semelhantes de colónias, indicando que o crescimento independente de ancoragem de células de cancro gástrico foi regulada de forma HOTAIR-dependente.

Potencial de crescimento independente de ancoragem de células de cancro gástrico foi avaliado por ensaio de agar mole. células MKN-HOTAIR formado números significativamente maiores de colónias do que as células MKN-VE (

P

= 0,009) (A), enquanto as células KATO-shHOTAIR mostraram significativamente menos colónias do que as células KATO-EV em HOTAIR forma de expressão (EV contra HOTAIR2 sh-,

P

= 0,016 e EV contra sh-HOTAIR3,

P

= 0,0035) (B).

celular

expressão HOTAIR e câncer gástrico metástase e peritoneal divulgação

Desde HOTAIR aumentou o crescimento dependente de ancoragem independente de ancoragem, mas não das células cancerosas gástricas, a hipótese de que HOTAIR pode contribuir para metástases à distância e /ou disseminação peritoneal, em vez de invasão direta para os órgãos vizinhos. Para abordar esta questão foi empregado um ensaio veia da cauda e injeção peritoneal de células para examinar se a expressão HOTAIR promove metástase -borne sangue e disseminação peritoneal, respectivamente. Como esperado, as células MKN-HOTAIR freqüentemente exibiu metástases hepáticas (

P

= 0,01) em comparação com células MKN-EV. Além disso, os números e tamanhos dos tumores hepáticos metastáticos foram maiores significativa com células MKN-HOTAIR do que com células MKN-EV (

P

= 0,03 e

P

= 0,019, respectivamente, Figuras 5A e B). Curiosamente, um rato injectado com MKN-HOTAIR mostrou metástases para o rim e glândula adrenal, para além do fígado, enquanto que com as células MKN-EV tumores metastáticos formado apenas no fígado. Consistentemente, disseminação peritoneal foi significativamente reduzida (1/5,

P

= 0,009) quando HOTAIR foi inactivado em células KATO III, enquanto todas as células de controlo formado difusão peritoneal (5/5) (Figuras 6A e B). Os tumores metastáticos foram confirmados histologicamente e eles mostraram coloração positiva intensa para citoqueratina humana (Figuras 5C e 6C).

A, O efeito de HOTAIR em metástase foi investigado por ensaio de veia da cauda. 1,0 x 10

5 de células que expressam HOTAIR (MKN-HOTAIR, n = 9) e células de controlo (MKN-EV, n = 9) foram injectados na veia da cauda de ratinhos. células MKN-HOTAIR mais frequentemente mostrou metástases hepáticas (

P

= 0,01) em comparação com células MKN-EV (painel esquerdo). Além disso, os números (painel do meio) e os tamanhos dos tumores hepáticos metastáticos (painel direito) foram significativos maior com células MKN-HOTAIR do que com células MKN-VE (

P

= 0,03 e

P

= 0,019, respectivamente). B, Os tumores metastáticos podem ser claramente reconhecidos macroscopicamente (seta). C, as células tumorais glândulas formadas e foram pensados ​​para ser derivado a partir das linhas injectados gástricas humanas de células de cancro (painel esquerdo, HE, ampliação original 40X). Estas células tumorais mostrou imunorreactividade intensa para citoqueratina humana (painel da direita).

A, disseminação peritoneal foi significativamente reduzida (1/5,

P

= 0,009), quando HOTAIR foi inativado em células KATO III por transdução shRNA, enquanto todas as células de controle formado disseminação peritoneal (5/5). B, O rato com disseminação peritoneal mostrou ascite sangrentas (painel esquerdo) e nódulos (seta no painel à direita) na cavidade peritoneal. C, Os nódulos na cavidade peritoneal consistia de células cancerosas, e alguns deles tinham mucina como um carcinoma de células em anel de sinete. Eles foram pensados ​​para ser derivada a partir das linhas injetados humanos gástricas celulares de cancro (HE, aumento original x 100) uma vez que estas células apresentaram imunorreatividade intensa para citoqueratina humana (painel da direita).

Discussão

neste estudo, foi investigada a expressão de HOTAIR no câncer gástrico e examinar a sua concordância com as características clínico-patológicas, incluindo prognóstico dos pacientes. Os nossos resultados mostraram claramente a expressão aumentada de HOTAIR em tecidos de cancro em comparação com os tecidos não-cancerosas do estômago e que a expressão de alto nível desta molécula foi associado com a metástase de linfonodo, invasão e sobrevivência venosa pobre no tipo difuso de cancro gástrico. Estes resultados são consistentes com o estudo recente mostrando que a sobre-regulação de HOTAIR é encontrado no cancro gástrico em comparação com tecidos normais e está correlacionada com a fase do tumor e a metástase de linfonodo [17]. Além disso, HOTAIR-expressando células cancerosas gástricas exibiu o reforço do crescimento celular independente de ancoragem

in vitro Comprar e metástases para o fígado

in vivo

enquanto que a expressão reduzida de HOTAIR em células cancerosas gástricas resultou em diminuição do crescimento independente de ancoragem e disseminação peritoneal, o que sugere que HOTAIR desempenha um papel essencial na progressão do cancro gástrico.

maior expressão de HOTAIR foi detectada em células de cancro do que nos correspondentes células não tumorais em vários cancros, incluindo o da mama, cólon, fígado, pâncreas e cancro nasofaríngeo [9-11,18-20]. Nestes cancros, HOTAIR também foi mostrado estar associado com a metástase e /ou mau prognóstico. Além disso, alto nível de expressão HOTAIR foi correlacionada com a curta sobrevida livre de doença no câncer de pulmão [12]. Por conseguinte, os nossos resultados presentes são consistentes com estudos anteriores que indicam que a expressão de HOTAIR está envolvido na agressividade aumentada de vários tipos de células de carcinoma. Por outro lado, não conseguimos encontrar efeito prognóstico negativo de HOTAIR no tipo intestinal de câncer gástrico, embora o grupo de alta HOTAIR tendiam a mostrar a sobrevida global mais curto em comparação com o grupo de baixo HOTAIR. Isso pode ser devido ao pequeno número de pacientes no estudo atual, uma vez que a expressão forçada de HOTAIR em uma linha de células de câncer gástrico intestinal (MKN74) ganhou o fenótipo agressivo

in vitro

e

in vivo

. Investigações posteriores com grande número de amostras, além do estudo experimental utilizando outras linhas celulares de cancro gástrico intestinal seria necessário para resolver esta questão.

No presente estudo, não foi encontrada associação entre a expressão HOTAIR e crescimento celular em câncer de intestino. Na mama, cólon e cancro do fígado, o envolvimento de HOTAIR no crescimento celular não foi demonstrado [9,10,18], enquanto HOTAIR promovido e reduziu a proliferação celular em câncer pancreático [11] e câncer de pulmão [12], respectivamente. Além disso, nenhuma diferença significativa foi encontrada no crescimento do tumor subcutâneo em ratos NOG entre as células de controlo HOTAIR-expressar e no estudo atual (dados não foram apresentados). Com base nestes resultados, é provável que a ligação entre a expressão HOTAIR e a proliferação celular é dependente do tipo de cancro. Em contraste, o crescimento independente de ancoragem de células de cancro gástrico foi claramente reforçada de uma maneira HOTAIR-dependente. Além disso, a expressão HOTAIR causou mais metástase para o fígado e outros órgãos, e um defeito de HOTAIR suprimiu a disseminação peritoneal de células do carcinoma gástrico. Estas observações, juntamente com o facto de a expressão HOTAIR contribui para a metástase em vários carcinomas [9-12,18], sugerem que HOTAIR é principalmente envolvidos no processo metastático em vez de no crescimento do tumor primário.

Em conclusão, HOTAIR expressão reforçada no tipo difuso de cancro gástrico foi associado à incidência de invasão venosa e de prognóstico reservado, independentemente do factor T, e forçado expressão de HOTAIR em células de cancro gástrico promoveu o crescimento celular independente de ancoragem

in vitro Comprar e metástases para o fígado

in vivo

. Estes resultados indicam que HOTAIR é susceptível de ser envolvido no desenvolvimento do cancro gástrico e pode também ser um alvo terapêutico para o tratamento do cancro gástrico.

Informações de Apoio

Figura S1.

A associação da proliferação de células com expressão HOTAIR. Os resultados do ensaio de MTT avaliada às 72 horas foram normalizadas para que às 24 horas. Não houve relação entre a expressão HOTAIR e proliferação de células de câncer gástrico

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077070.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos à professora Kitamura (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão), para proporcionar células de platina-A.