PLOS ONE: Functional folato receptor alfa é elevada no sangue de cancro do ovário Patients

Abstract

Fundo

Apesar da baixa incidência, o câncer de ovário é a quinta maior causa de mortes por câncer e tem a maior taxa de mortalidade de todas as malignidades ginecológicas entre as mulheres americanas. A taxa de mortalidade seria reduzido com um marcador de detecção precoce. O alfa do receptor de folato (FRα) é uma escolha lógica para um biomarcador devido à sua sobre-expressão predominante no cancro do ovário e a sua expressão exclusiva em apenas alguns tecidos normais. Em trabalhos anteriores, observou-se que os pacientes com cancro do ovário tinham níveis séricos elevados de uma proteína que se ligou a um anticorpo monoclonal específico em relação FRα-a indivíduos saudáveis. No entanto, não foi mostrado que a proteína foi detectada FRα funcionais intactas. No presente estudo, o objetivo foi determinar se pacientes com câncer ovariano (n = 30) tinham níveis elevados de soro de um completamente funcional FRα intactas em comparação com controles saudáveis ​​pareados (n = 30).

Metodologia /Principais Constatações níveis

FRα no soro foram analisadas por dois métodos, análise immunoblotting e um ensaio fólico radiomarcado microfiltração à base de ácido vinculativo. Usando o imunoensaio, observou-se que os níveis de FRα foram mais elevados no soro de pacientes de cancro do ovário, em comparação com os controlos. Resultados semelhantes foram também observados utilizando o ensaio de ligação de microfiltração, que mostrou que o FRα circulante é funcional. Importante, também descobrimos que os níveis de FRα foram comparáveis ​​entre os primeiros e avançados pacientes em estágio.

Conclusões

Nossos resultados demonstram que os doentes com cancro do ovário têm níveis elevados de FRα intactas funcionais. Estes resultados suportam o uso potencial de circular FRα como um biomarcador de câncer ovariano precoce

Citation:. E Basal, Eghbali-Fatourechi GZ, Kalli KR, Hartmann LC, Goodman KM, Goode EL, et al. (2009) Funcional folato receptor alfa é elevada no sangue de ovário pacientes com câncer. PLoS ONE 4 (7): e6292. doi: 10.1371 /journal.pone.0006292

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril de 2009; Aceito: 11 de junho de 2009; Publicação: 20 de julho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Basal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta concessão foi apoiada por doações do Instituto Nacional do Câncer, K01-CA100764 e R03-CA121386. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a quinta maior causa de morte por câncer e tem a maior taxa de mortalidade de todas as malignidades ginecológicas entre as mulheres americanas com uma estimativa de 21.650 novos casos e um gt antecipado 15.500 mortes em 2008 [1]. A maioria dos pacientes com cancro do ovário presente com doença avançada (fases III-IV) e têm uma sobrevivência de 5 anos de tipicamente 30%. O facto de que a sobrevivência de pacientes com doença de fases I-II varia de 60% -90%, dependendo do grau do tumor [1], [2] sugere o potencial para uma alta taxa de cura com detecção de doença mais cedo. Uma vez que os sintomas físicos estão ausentes nas fases iniciais de cancro do ovário, estão sendo feitos esforços para desenvolver ensaios para os biomarcadores sangue ou tecidos.

Embora o CA-125 de soro, uma glicoproteína de superfície de célula do ovário (ou seja, uma mucina) do desconhecido significado biológico, é elevada em 80% dos pacientes com cancro epitelial do ovário avançado, este marcador tem um valor preditivo positivo de 10% na doença fase inicial [3]. Para além disso, CA-125 também está associada a várias condições não malignas, tais como a gravidez, a endometriose, adenomiose, miomas uterinos, doença inflamatória pélvica, menstruação, e quistos ovarianos benignos. CA-125 também está associada com outros estados malignos tais como o pâncreas, da mama, do pulmão, gástrico, do cólon e cancros [4]. Embora o CA-125 é útil para o seguimento da quimioterapia do paciente e na detecção de recidiva precoce em pacientes com câncer de ovário já conhecidos, não é útil para identificar doença em estágio inicial [5].

O folato α do receptor (FRα), uma molécula de 38-40 kDa, é um membro bem caracterizado da família do receptor de folato (FR) com elevada afinidade para os folatos. FRα está ancorado à membrana celular através de uma porção de glicosilfosfatidilinositol e transporta folatos por meio de um processo de endocitose [6]. FRα apresenta a distribuição de tecido normal limitada, com expressão mensurável restrita às superfícies apicais de alguns tipos de epitélio, predominantemente no pulmão, rim e plexo coróide, mas é sobre-expresso em uma gama de tumores sólidos, incluindo o cancro do ovário, cancro de não pequenas do pulmão de células , cancro da mama, cancro do rim e no osteossarcoma de alto grau [7] – [10]. Esta expressão ao longo de alta afinidade FRα em alguns tipos de câncer podem ter surgido para atender aos requisitos celulares para a síntese e crescimento [11] DNA.

Além de sua localização na superfície celular, FRα também pode ser derramado para o sangue. Derramamento foi inicialmente identificado durante o desenvolvimento do folato ensaios que utilizaram FR isento de células purificada como uma proteína de ligação de ligação de radioligando. Nestes estudos, verificou-se que havia frequentemente uma grande discrepância na avaliação de folato total sérico quando ensaiadas depois de extracção de calor em comparação com o soro nativo [12]. Quando vertente, FRα ligará folato circulante, desde que a afinidade está na gama de nM. Agora é bem entendido que derramamento complica a interpretação dos ensaios de folato no soro e, possivelmente, mascara a presença do receptor funcional a menos que um tratamento com ácido é empregue para libertar o folato endógena e permitir a saturação FRα com o ácido fólico radiomarcado. Esta discrepância nos níveis de ácido fólico entre os níveis séricos e calor extraído nativa conduziu à identificação de FRα circulando em algumas amostras de sangue do cordão umbilical e na parte do soro materno [13]. Importante, FRα libertado a partir de células epiteliais normais não deveria contribuir para níveis FRα no soro, uma vez que o receptor é invariavelmente localizadas à superfície apical do epitélio polarizada, onde a sua clivagem vai entregar o receptor livre em um lúmen que naturalmente drena a partir do corpo através o seu próprio orifício.

estudos recentes sugerem que FRα também pode ser derramado para o sangue de tumores, que oferece uma oportunidade de acessar e medi-lo como um marcador tumoral do câncer em estágio precoce. A expressão predominante de FRα no cancro do ovário, entre todas as fases, tem estimulado o interesse em aplicá-lo como um alvo terapêutico e biomarcador [14]. O objetivo do estudo foi determinar se FRα funcional intacta é derramado para a circulação e para avaliar o seu potencial como um biomarcador de circulação. Este objectivo é suportada pelo trabalho anterior que mostraram que os pacientes com cancro do ovário têm níveis elevados de uma proteína do soro que reage com anticorpos anti-FRα [15]. O que ainda não foi responderam se os anticorpos detectados toda FRα e se a proteína detectada foi um receptor funcional de folato (FR). Assim, no presente estudo, os níveis de circulação da FRα no sangue de pacientes com cancro do ovário foram examinados utilizando um ensaio de microfiltração

baseada-3H-FA, que foi desenvolvido para detectar FRα funcional. Além disso, um ensaio de imunotransferência foi utilizada para confirmar a presença da proteína inteira específica FRα. Como será mostrado, pacientes com câncer ovariano demonstrar níveis elevados de FRα na circulação de apoio a sua potencial utilização como um biomarcador da doença.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O Mayo clínica IRB aprovou o estudo e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos.

assuntos

Cada caso de cancro do ovário foi correspondida primeiro a um controle fêmea em coleta de sangue no prazo de 6 meses (todos os 30 casos combinado com êxito), e, em seguida, dentro de 5 anos de idade. Vinte e nove casos foram pareados com sucesso. O caso 30 foi correspondida em coleta de sangue no prazo de 6 meses e idade dentro de 9 anos para um controle elegíveis. casos elegíveis eram pacientes, mais de 20 anos de idade, com diagnóstico histológico de câncer epitelial de ovário primário. Uma amostra de sangue de 40 mL (pré-operatório) foi recolhido, processado, aliquotado e armazenado a -80 ° C, tal como soro. A média de idade (± SEM) dos doadores do sexo feminino saudáveis ​​pareados por idade e pacientes foram de 61 ± 3 e 60,63 ± 3 anos, respectivamente. Outras paciente e do tumor características são apresentados na Tabela 1.

insumos e reagentes

O ácido fólico foi obtida a partir de Alexis Biochemicals. filtros de centrifugação (10.000 dalton de corte) foram adquiridos a Millipore (Burlington, MA). ácido fólico tritiado [3,5,7,9-

3H] sal de sódio, (

3H-FA, 1 mCi /ml) foi adquirido a partir de American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, Missouri), e Ready cofre de cocktail de cintilação líquida era de Beckman Coulter. Os anticorpos anti-FRα, MOv18 /ZEL e F5753 foram de Alexis Biochemicals (San Diego, CA) e US Biológica (Swampscott, MA), respectivamente.

Preparação de lisatos celulares de tumor e os sobrenadantes da cultura de células como fontes de FRα

células KB são células de carcinoma nasofaríngeo humano epidermóide que expressam elevados níveis de FRα [16] – [18]. As células KB foram cultivadas em meio constituído por RPMI isento de folato 1640, suplementado com 55 uM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina, piruvato 1 mM de sódio, tampão HEPES 10 mM, 100 IU /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e soro fetal bovino a 10%. Os sobrenadantes foram preparadas por centrifugação do meio condicionado a 4 ° C para remover células não ancoradas. As aliquotas de sobrenadantes de 4 dias foram armazenadas a -80 ° C até ser usado como uma fonte de FRα associada não-celular. Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de monocamadas confluentes KB por ciclos repetidos de congelação-descongelação seguido de centrifugação para remover os restos. Para ambos os sobrenadantes e os lisados ​​de células, as concentrações de proteína foram determinadas por densidade óptica. Células MCF-7 de cancro da mama humanas foram usadas como um controlo negativo e FRα-preparado de modo semelhante às células KB. Lisados ​​(5-10 mg de lisados) e sobrenadantes (10-20 ul) foram utilizados para o desenvolvimento de ensaio e como controles.

3 H-fólico ligação de ácidos ensaio

Medição de folato receptores em casos e controlos foi uma modificação de um método previamente descrito [19]. Amostras (10 ul) foram carregados para dentro da câmara superior de um par de tubos de filtração e diluiu-se com 50 ul total, com uma solução de solubilização (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 25 mM de

n-octilo

-β-D-glucopiranósido, EDTA 5 mM, e 0,02% de azida de sódio). Os tubos foram centrifugados e filtração os filtros tratados com a solução de acetato 30 mM (pH 3,0) para remover endógena FA seguido por centrifugação e duas lavagens com a solução de solubilização. Em seguida, os pares de tubos de filtração foram incubadas quer com uma FA frio 1000X de uma soluo de ligao (Na 10 mM

2P

4, KH 1,8 mM

2 PO?

4, NaCl 500 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4, e 25 mM de

N-

octil-β-D-glucopiranósido) ou com a solução de ligação por si só, e as amostras foram incubadas 2 horas à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugada. solução contendo Binding

3H-FA foi então adicionado a todas as amostras, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C com agitação suave. Os filtros foram centrifugadas e lavadas com PBS contendo 50 mM de

n-octil-

β-D-glucopiranósido para eliminar o desacoplado

3H-FA. Limite

3H-FA retida nos filtros foi removido com 100 ul de PBS contendo 4% de Triton X-100 e transferidas para um frasco com cocktail de cintilação líquida, e a actividade foi medida num contador Beckman LS6000IC de cintilação. A ligação específica foi determinada subtraindo-se a actividade na presença de um excesso de FA frio a partir da actividade da mesma amostra sem FA competição.

A imunoprecipitação e análise de imunotransferência de FRα

FRα no soro foi directamente medido utilizando a análise de imunotransferência de imunoprecipitados. As amostras de soro (100 uL), os lisados ​​(25 ug KB ou células MCF-7) ou KB sobrenadantes foram pré-apagada duas vezes com proteína G-Sepharose e de 5 ug cada um dos anticorpos monoclonais, MOv18 /ZEL e F5753, foram adicionados a cada amostra e incubou-se durante 1 hora a 4 ° C. Proteína G Plus Sepharose esferas foram, em seguida, adicionado e a mistura foi deixada a rodar durante a noite a 4 ° C. As esferas foram então recolhidas com centrifugação e lavou-se com 600 ul de tampão de lise (Tris-HCl a 20, pH 7,5, NaCl 150 mM, Na 1 mM de

2EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton, e inibidores de protease). Os grânulos foram decantados e fervidas em tampão de Laemmli. As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE sob condições não redutoras, seguida por blotting. As manchas foram sondadas com anticorpo MOv18 /ZEL (5 ug /ml em 2% de leite em pó magro, 0,1% de Tween 20 em TBS) seguido por secundário anti-rato IgG a peroxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo (1:5000 em 2% não gordura do leite seco em 0,1% de Tween 20), e desenvolvidos por quimioluminescência aumentada com Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate durante 5 minutos (Pierce, Rockford, IL, EUA). As manchas foram então expostos a posições de cinema e da banda de raios-X e densidades da banda foram calculados usando um sistema computadorizado de análise de imagem (sistemas UVP Biochem Imaging, Upland, CA).

Análise Estatística

A níveis médios de circulando FRα, detectado com qualquer ensaio ou immunoblotting análise, entre os casos e controles de ligação do ligando-foram comparados usando o Wilcoxon combinado teste de pares. Em alguns casos, a análise de regressão linear foi utilizada para examinar a correlação estatisticamente significativa. As proporções foram testadas usando o teste exato de Fisher. Em todos os casos, um teste bilateral foi usado e o valor de p menor ou igual a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

A detecção de FRα usando ensaios de ligação de microfiltração e imunotransferência

Em esforços iniciais para medir os níveis circulantes de FRα por estudos de ligação

3H-FA, estudos preliminares foram feitos para determinar os atributos do ensaio de filtração microcentrífuga. amostras de sobrenadante de células KB foram incubadas com quantidades crescentes de

3H-FA na ausência e presença de excesso de FA frio e, em seguida, medido a recuperação do limite

3H-FA. Como mostrado na Figura 1A, entre 10 e 120 nmol /L

3H-FA, a ligação total aumentou de um modo linear. Quando o excesso de FA fria foi adicionado, a quantidade ligada foi reduzida para os níveis de fundo. As concentrações calculadas de FA durante este intervalo de (10-120 nmol /L) foram consistentes e nenhum dos valores foram significativamente diferentes (não mostrado). Os resultados mostram que o ensaio é capaz de medir FRα longo de uma vasta gama de concentrações de FA

Painel A:. Dez mL alíquotas de sobrenadante da cultura KB foi diluída para 50 ul com tampão que continha concentrações de

3H-FA pulsada, sem (total ligado) ou com 1000X FA frio. Após a incubação, não ligado FA foi removido por microfiltração. São mostrados o CPM retida pelo microfiltro. Também é mostrado fundo a que está vinculado, na ausência de KB sobrenadantes e sem excesso de FA frio. * P 0,05. Cada ponto de dados é a média (± SE) de 3 repetições. A linha a tracejado é inserir a linha de regressão linear da ligação total apresentada com os correspondentes valores de p e r. O painel B mostra que a quantidade de ligação específica é dependente dos níveis de entrada. Neste caso, quantidades crescentes de soro contendo uma proteína espigão de KB foram examinados. Esta experiência é representativa de 2 experimentos diferentes. Painel C mostra a concentração de FA, que foi obrigado tanto em sobrenadantes KB ou uma amostra de soro representante de um caso e controle, comparando a 30 KD e 10 microfiltros de corte. Experiência é representativo de duas experiências. O painel D mostra um exemplo representativo da análise de imunotransf erência de FRα. Seta = M

r proteína 38000; KD = quilodaltons; IP = imunoprecipitação. Pista 1, sem soro IP W; pista 2, IP do KB lisado; pista 3, IP de soro pré-aclarados com KB lisado pico; pista 4. IP do soro sozinho, pista 5, KB lisado não IP; pista 6, IP KB lisado sem soro.

De modo a determinar a quantidade mínima de soro necessária, uma amostra de soro de controlo normal (100 ul) foi misturado com lisado de células KB (5 ug) e volumes diferentes (0-40 ul) foram testados quanto à ligação

3H-FA. Como se mostra no exemplo experiência representativa na Figura 1B, o ensaio de micro-filtro pode detectar a ligação da FA num volume tão pouco quanto 10 ul. No entanto acima de 20 ul de soro, verificou-se que os microfiltros não sempre facilmente escoar. Assim, foi utilizado um volume padrão de 10-20 mL de casos e controles.

Embora o trabalho antes tinha usado 30 filtros de corte KD para medir FRα em amostras de tecido [19], houve uma preocupação de que alguma perda pode surgiram como uma consequência de uma variação no tamanho dos poros, resultando na presença de alguns poros do filtro que iria permitir a passagem do 38 kDa FRα. Portanto, os testes foram feitos comparando 30 KD e 10 filtros de corte KD. Em geral, havia apenas pequenas diferenças. Por exemplo, como mostrado na Figura 1C, não havia nenhuma diferença notável na FA ligado ao utilizar lisados ​​de células KB KB de sobrenadantes. Em contraste, pequenos aumentos foram observados consistentemente nas amostras de soro, quando utilizando os filtros de corte de 10 kD. Assim, o ponto de corte de 10 kD foi usada para medir FRα nos soros de casos e controlos.

Numa tentativa para confirmar os resultados de microfiltração, um método de imunoprecipitação e imunotransf erência foi estabelecido. Tal como mostrado na Figura 1D, FRα pode ser imunoprecipitada a partir de soro (100 ul) e imunotransferidas resultando na detecção do 38 KD FRα. No geral, estes resultados mostram que o ensaio de microfiltração pode ser usado para detectar FRα em pequenas amostras de soro. Além disso, a análise immunoblotting revela a presença de intacta FRα de corpo inteiro.

Os pacientes com câncer de ovário não tratado têm elevados níveis médios de circulando FRα, em comparação com controles pareados

paciente (ie casos) características são detalhado na Tabela 1. os ensaios de ligação microfiltro e imunotransferência revelou que soros derivados dos casos continham níveis significativamente mais elevados de FRα relativamente aos controlos (Figura 2A-C). A análise de regressão linear de todas as medições a partir de ambos os casos e controlos revelaram que não havia uma correlação significativa entre os resultados dos ensaios de microf iltração e imunotransferência (Figura 2D). Para avaliar quais ensaio pode ser potencialmente mais adequados para o desenvolvimento como um biomarcador de teste, cortes foram estabelecidos a partir dos valores do grupo de controlo em ambos os ensaios, usando a média e dois desvios padrão. Com esta estratégia, maior do que 95% dos valores de controlo caiu abaixo do ponto de corte. Como mostrado na Figura 3, utilizando esta estratégia, 13% e 27% dos casos foram considerados como tendo níveis de FRα elevada nos ensaios de imunotransferência e de microfiltração, respectivamente. A análise estatística pelo teste exato de Fisher mostrou que a fração de casos com níveis elevados de FRα, conforme detectado com o teste immunoblotting, foi significativamente diferente do que a fração de controles considerada positiva. Em contraste, a fracção de casos detectados com o ensaio de microfiltração não foi significativa, sugerindo que o ensaio de imunotransferência podem potencialmente ter um melhor valor preditivo positivo.

O painel A mostra o número de circulação de receptor de folato (FRs) extrapolado a partir de o ensaio de microfiltração assumindo uma razão molar 01:01 de FA:FR em ambos os casos e os controlos correspondentes painel B mostra o sinal obtido densitométrica utilizando imunotransferência. Os valores de P nos painéis A e B são calculados utilizando o teste de pares combinados de Wilcoxon e cada barra representa a média ± S.E.M. Painel C: Pista 1, controle negativo imunoprecipitação; pista 2, ligado de controlo negativo (MCF-7); pista 3, controlo positivo (KB) lisado); pista 4, amostra de soro de controlo; pista 5, combinado amostra de soro do cancro do ovário; pista 6, amostra de soro de controlo; pista 7 combinado amostra de soro de cancro do ovário. Seta = M

r proteína 38000; KD = quilodalton. O painel D mostra a análise de regressão linear correlacionando os dados de ensaio de ligação de microfiltração e os dados immunoblotting. Cada ponto de dados representa um indivíduo único. símbolos abertos representam os controles saudáveis ​​e símbolos fechados são pacientes.

Painel A e B mostram a percentagem de casos e controles que foram consideradas positivas por microfiltração ou immunoblotting ensaio, respectivamente, com pontos de corte estabelecido como a média além de dois desvios-padrão dos valores de controlo. O p-valor foi calculado pelo teste exato de Fisher.

Níveis de FRα circulantes são comparáveis ​​entre o início e avançado da doença

Nós testamos se havia alguma correlação entre os níveis circulantes FRα e uma variedade de características clínicas, bem como a expressão FRα dentro do tumor. Descobrimos que os níveis circulantes de FRα (como immunoblotting avaliada) foram comparáveis ​​entre os primeiros (Fases I /II, n = 15, 16 ± 2 au) e estádio avançado (estádios III /IV, n = 15, 12 ± 2 au, p = 0.24) pacientes como mostrado nas Figuras 4A. As diferenças na circulação FRα entre os pacientes em fase inicial e avançada, tal como avaliado por ensaios de ligação também não foi significativa (1,4 ± 0,3 vs 1,0 ± 0,2 p . 0,2, Figura 4B). Importante, os níveis de FRα em pacientes na fase inicial foram significativamente mais elevada do que todos os controlos (n = 30, 7 ± 0,9 UA, imunotransferência, p 0,0001 e 0,6 ± 0,1 nmoles de ligação /L, P = 0,02).

os painéis a e B mostra a comparação entre os sinais densitométricos fase de ensaio e microfiltração precoce e tardio, respectivamente. Cada ponto de dados representa um único indivíduo e a linha horizontal representa a média. valores de p apresentados foram calculados utilizando um teste t de Student.

Não foram observadas correlações significativas entre circulando FRα e quer idade, grau, o estado de recorrência ou extensão de debulking (ideal vs. sub-óptima) (p 0,05). Tumores de 27 de 30 pacientes tiveram alta expressão FRα, consistente com trabalhos anteriores e, portanto, o tamanho da amostra não foi grande o suficiente para determinar se a expressão tumor FRα foi associado com níveis de FRα no sangue. No entanto, um dos três tumores (1 limítrofes serosa e 2 limítrofes mucinoso) com baixa FRα associado a um tumor, apenas 1 limítrofe mucinoso demonstrado baixos níveis circulantes de FRα. Isto sugere que circula FRα pode não se correlacionam bem com os níveis tumorais. Na verdade, em nossos estudos anteriores, observou-se algumas discrepâncias no FRα coloração diferentes focos de tumor (recorrentes e lesões metastáticas) [14].

Discussão

O câncer de ovário vezes escapa de detecção por causa da falta de definitivos primeiros sintomas. Assim, o cancro do ovário apresenta em fase avançada em ~ 70% dos pacientes. Os biomarcadores em uso hoje não são adequados para a detecção de câncer em estágio precoce. Portanto, não é surpreendente que o câncer de ovário é a causa número um de morte entre todas as doenças malignas ginecológicas nos últimos anos. Atualmente marcadores disponíveis CA-125 e perfis proteômicos falta de sensibilidade, especificidade e /ou reprodutibilidade. Há clara necessidade de marcadores de diagnóstico para detectar o câncer de ovário em estágios iniciais. A molécula expressa quase exclusivamente no tecido patogênico faria um biomarcador ideal e um tal candidato promissor é receptor de folato (FR-α). FR-α é altamente sobre-expresso na maioria dos cancros do ovário, mas exibe expressão limitada em tecidos que são responsáveis ​​por toda a retenção do corpo de folatos (por exemplo, placenta, rim e plexo coróide). No presente estudo, testamos se era viável para detectar FRα circulantes em pacientes com cancro do ovário e se o FRα circulante foi de full-length e funcional.

Os nossos dados mostram que os pacientes com câncer de ovário têm níveis elevados de FRα em relação aos controles saudáveis. Estes resultados sugerem que circula FRα poderia potencialmente ser desenvolvido como um biomarcador. Os níveis aumentados de FRα doença em fase inicial indica que a regulação positiva de FRα pode ocorrer no início da carcinogénese do ovário em alguns pacientes. Na verdade, Toffoli e colegas descobriram que quase 79% dos pacientes com estágio inicial (I e II) cancro do ovário overexpressed FRα, que era essencialmente idêntica à proporção de pacientes em estágio avançado que tinha expressão FRα [9]. Observamos em nossos estudos que os níveis circulantes de FRα em pacientes em estágio inicial não foi diferente do que os pacientes em estágio avançado. No entanto, Toffoli e colegas descobriram que enquanto que a proporção foi semelhante, os níveis de FRα no tumor foram significativamente mais elevados nos pacientes em estágio avançado. A falta de correlação pode indicar que há outros factores que regulam os níveis séricos. Por exemplo, Mantovani e colegas descobriram que as amostras de urina humanos normais foram fortemente positivas para FRα reactividade imunológica, o que sugere que não existe um mecanismo para a sua depuração rápida do rim [15]. Uma vez que os túbulos proximais do rim expressam fortemente a proteína, pode-se concluir que o rim tem uma estratégia bem desenvolvido para eliminar FRα para evitar que se acumule no sangue e prevenir a absorção de FA em tecidos [19]. Isto é apoiado em estudos de modelagem murino cinéticos que têm mostrado que, como o tumor progride, aumento nos níveis de urina de FRα preceder os níveis de soro consideravelmente [15].

FRα Intact é uma proteína de 38 kDa e em nosso ensaio de immunoblot, anticorpo anti-MOv18 /ZEL detectada uma proteína com o mesmo peso molecular. Além disso, mostrámos que o ensaio de microfiltração detectado proteico funcional, que tomados em conjunto sugere que FRα derramado por cancro do ovário está intacta e funcional. A presença de FRα na circulação de doentes tem um significado terapêutico como uma série de terapias têm sido desenvolvidos que FRα da superfície das células-alvo em doentes de cancro [20]. Estes FRs circulantes podem ligar-se e interfere com a eficácia clínica. Isso pode explicar altas taxas de falha observada em algumas imunoterapias FRα dirigidos em pacientes com câncer de ovário. Por exemplo, Kershaw e colaboradores desenvolveram um método em que as células autólogas T de pacientes foram gene modificado com um receptor quimérico que continha um anticorpo de cadeia simples FRα específico acoplado à cadeia gama do receptor Fc de [21]. Enquanto as células segregadas de IFN-γ em resposta a FRα, eles falharam para localizar a localização do tumor, uma falha, que pode ser explicada através da circulação FRα que saturado os receptores quiméricos. Portanto, a análise de circular FRα em pacientes com câncer pode ajudar a determinar os níveis de anti-FRα alvejado receptores quiméricos necessários para o sucesso da terapia. Além disso, também descobrimos que elevada circulante FRα era funcional, o que sugere a interferência potencial com uma série de terapias de droga conjugado com ácido fólico que têm sido desenvolvidos que requerem um local funcional de ligação [20], Uma das dificuldades, contudo, na medição de soro níveis de FRα é a falta de um ensaio de qualidade. Enquanto os nossos ensaios de ligação foram capazes de detectar uma diferença entre casos e controlos, os resultados obtidos sugerem que o ensaio de imunotransf erência pode ser potencialmente mais útil na detecção de níveis elevados. No entanto, como com qualquer ensaio de mata-borrão, o utilitário é limitada pela sua complexidade técnica (ou seja, imunoprecipitação seguido por immunoblotting) e os resultados obtidos com este ensaio são apenas semi-quantitativa.

Em conclusão, nossos resultados demonstram que o câncer de ovário pacientes, incluindo aqueles com doença precoce, têm níveis elevados de FRα intactas funcionais, em comparação com controles saudáveis. Com mais desenvolvimento, incluindo amostras maiores estágio inicial de câncer de ovário e melhorou o desempenho do ensaio, o uso de FRα como um biomarcador para o câncer de ovário pode ser viável.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Dr. Linda E. Kelemen por suas valiosas discussões com o manuscrito.

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