Abstract

Zero gravidade faz com que várias alterações no metabolismo e função do corpo humano e experimentos no voo espacial demonstraram alterações no crescimento e progressão do câncer. Este estudo relata o genoma de largura de perfil de uma linha-DLD-1 de células de câncer colorretal expressão, e uma linha-MOLT-4 linfoblastos de células leucémicas, sob microgravidade simulada em um esforço para compreender os processos centrais e as funções celulares que estão desregulados entre ambas as linhas celulares . morfologia celular alterada, a viabilidade celular reduzida e um perfil de ciclo celular aberrante em comparação com seus controles estáticos foram observados em ambas as linhas celulares sob microgravidade. O processo do ciclo celular em células DLD-1 foi marcadamente afectada com viabilidade reduzida, reduzida capacidade de formação de colónias, uma população apoptótica e a desregulação dos genes do ciclo celular, oncogenes, e progressão do cancro e marcadores de prognóstico. A análise do DNA microarray revelou 1801 (regulada) e 2542 (reprimidos) genes ( 2 vezes) em DLD-1 culturas sob microgravidade enquanto MOLT-4 culturas diferencialmente expressos 349 (regulada) e 444 (reprimidos) genes ( 2 vezes) sob microgravidade. A perda de capacidade proliferativa das células foi corroborada com a regulação negativa do processo do ciclo celular como demonstrado pelo agrupamento funcional dos dados de microarranjos de DNA usando termos ontologia gene. O perfil de expressão ampla do genoma também mostrou desregulação significativa de gene pós-transcricional silenciar máquinas e múltiplos genes do hospedeiro microRNA que são potenciais supressores de tumor e proto-oncogenes, incluindo

MIR22HG

,

MIR17HG

e

MIR21HG

. O

MIR22HG

, um gene supressor de tumor era um dos genes regulados positivamente mais alta nos dados de microarray que mostram uma regulação positiva de dobragem de 4,4 log sob microgravidade. PCR em tempo real validou a desregulação no gene de acolhimento, demonstrando uma regulação positiva dobra 4,18 log do miR-22 microRNA. dados de microarrays também mostrou desregulação dos alvos diretos de miR-22,

SP1

,

CDK6

e

CCNA2

Citation:. Vidyasekar P, Shyamsunder P , Arun R, R Santhakumar, Kapadia NK, Kumar R, et al. (2015) Genome largo perfil de expressão de linhas de células cancerosas cultivadas em microgravidade revela desregulação significativa do ciclo celular e microRNA Gene Networks. PLoS ONE 10 (8): e0135958. doi: 10.1371 /journal.pone.0135958

editor: Zheng Li, Pequim College Hospital Union Medical, CHINA

Recebido: 26 de fevereiro de 2015; Aceito: 28 de julho de 2015; Publicação: 21 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Vidyasekar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Organização de Desenvolvimento de Pesquisa de Defesa (DLS /81/48222 /LSRB-189 /ID /2009 e DLS /81/48222 /LSRB- 273 /SH DD /2013) para RSV. url: https://www.drdo.gov.in/drdo/boards/lsrb/fplsrb.htm

concorrentes interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

microgravidade em vôos espaciais tem sido demonstrado que afetam a fisiologia de uma célula consideravelmente [1]. gravidade normal (1 g) afeta a cultura 2-dimensional por células depositando na superfície da placa de cultura de tecido (TCP), onde as células dependentes de ancoragem aderir e proliferar como uma monocamada com interacções célula-célula muito limitadas. A aceleração de gravidade e reduzida (menos do que 1 g) no espaço, remove o efeito da gravidade, permitindo que as culturas de células no espaço de ter movimento sem impedimento do meio de cultura, num ambiente livre de cisalhamento e, como as células não são limitados por qualquer força direccional, movimento irrestrito de células dentro do meio. Sob tais condições, as células tendem a fundir-se e formam agregados criando três ambientes tridimensionais (3D) onde eles interagem em planos múltiplos [2]. O efeito da gravidade reduzida não se restringe a alterações nas condições de cultura, como o meio original pode produzir alterações na fisiologia fundamental da célula. Embora o mecanismo de acção de maneira a gravidade, ou a falta dela, afecta as funções celulares e moleculares ainda não é clara, que tenha sido estabelecido que microgravidade ou gravidade zero afecta os processos vitais da célula e importante, microgravidade foi mostrado para alterar o crescimento do cancro e progressão [3-5]. No entanto, diferentes tipos de câncer respondem de forma diferente à microgravidade por perder ou melhorar processos e funções celulares. Neste estudo foram cultivadas linhas celulares representativas de tumores DLD-1, MOLT-4 e HL-60 num sistema de cultura de células de rotação (RCCS) que microgravidade simulada sólidos e hematológicos. O RCCS é um sistema mecânico que simula gravidade reduzida na terra, cancelando o vetor direcional através de rotação constante de um Rácio Vessel alta Aspect (HARV). Isso mantém as células em queda livre constante e um ambiente livre de cisalhamento permitindo que as células a se unir e formar agregados 3D [2]. Estes agregados são mantidas em condições de queda livre experiência e de reduzida gravidade para o restante do período de cultura. Colocámos a hipótese de alterações fisiológicas para as funções celulares tais como a proliferação celular e a viabilidade pode ser comprovada com mudanças nos processos fundamentais da célula tais como a expressão do gene. Para relacionar as mudanças fisiológicas, como um perfil de ciclo celular alterada com a desregulação da expressão do gene, em tempo real análise de PCR para os genes do ciclo celular, oncogenes e desenvolvimento de câncer e marcadores de progressão foi realizado. Genoma vasta de perfis de expressão por microarrays de ADN destas linhas de células cultivadas sob microgravidade revelou a desregulação de várias vias no cancro e mais importante, corroborados com alterações fisiológicas observadas para a célula. Nós também utilizamos o perfil de expressão gênica para investigar desregulação nas vias centrais para o cancro, tais como o sistema de sinalização Notch e desregulação na pós gene transcrição máquinas silenciamento. O perfil de expressão gênica também revelou desregulação dos genes hospedeiros de microRNA em microgravidade incluindo o supressor de tumor significativa, miR-22 em DLD-1.

Materiais e Métodos

cultura celular

DLD-1 é, uma linha celular aderente epitelial derivada de um adenocarcinoma colorretal (Dukes tipo C). MOLT-4 é um t linfoblastos, linha de células em suspensão derivadas de uma leucemia linfoblástica aguda, enquanto a linha de células HL-60 é uma promyeloblast derivada de leucemia promielocítica aguda. As linhas celulares foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Ciência celular, Pune, na Índia e foram mantidas em DMEM-F12 (DLD-1) ou RPMI1640 (MOLT-4,-60 HL) meio suplementado com soro fetal bovino a 10% (Life Technologies, EUA) a 37 ° C numa incubadora humidificada de 5% de CO2 em 25 milímetros

3 placas de cultura de tecido (TCP) e em 10 ml

3 vasos de relação de aspecto elevadas (harv) dentro de um sistema de cultura de células de rotação (RCCS). As linhas celulares foram introduzidos no HARV 10 ml por meio de seringas de 5 ml e uma velocidade de rotação de 27 rotações por minuto (RPM) foi padronizada com base na agregação de células DLD-1 carregado em 0,5 X 10

6 células dentro de 24 a 48 horas . As células foram cultivadas em HARV por um período máximo de 72 horas com meio adicional injectado no HARV a cada 16 a 24 horas para prevenir a formação de espuma ou bolhas de ar. Conteúdo do HARV foram transferidos a 60mm TCP, sem dissociar agregados celulares, para observação micrográfica de rotina e outros ensaios baseados em células usando pipetas de 10 ml. 0,25% de tripsina-EDTA foi utilizado para a dissociação dos agregados de células e culturas de monocamada quando necessário.

extracção de RNA total e ADNc conversão

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Alemanha) . 2 × 10

6 células foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS. O ARN foi isolado a partir destas células, conforme as instruções do fabricante. 1,5 ug de ARN total foi convertido em cDNA usando MMLV-RT (Thermo Scientific, EUA) e iniciadores oligo-dT (NEB, EUA). miARN conversão em cDNA foi realizada usando haste-laçada da transcriptase reversa (RT) iniciadores sem o ditiotreitol (DTT) e o passo de desnaturação de ARN para manter a integridade do iniciador em ansa pedunculada.

Microarray Analysis

análise Microarray foi realizada com amostras de RNA a partir de linhas DLD-1 e MOLT-4 de células cultivadas em microgravidade e em condições estáticas em repetições. dados de expressão para cada amostra foi obtida na matriz Affymetrix GeneChip PrimeView Humano. A hibridação foi realizada durante a duração de 16 horas a 60 rpm a 48 ° C e digitalizado no Digitalizador GeneChip 3000 microarray 7G. Os dados em bruto foi extraída após a digitalização de slides e conjuntos de dados brutos foram analisados ​​usando GeneSpring GX 12,6 software seguido pela expressão diferencial de genes (DE), dobre a mudança análise de agrupamento.

análise Gene ontologia

Os genes DE foram estudados para a sua superabundância em diferentes Gene ontologia (GO) termos, bem como as vias usando o software de análise de microarray DAVID (A Base de Dados para a anotação, visualização e integrado Discovery) [6]. Duas ferramentas no programa DAVID foram utilizados, gene ferramenta de classificação funcional ea ferramenta de anotação agrupamento funcional. A ferramenta de anotação funcional DAVID foi usado para destacar os termos GO relevantes associados com a lista gene apresentado pelo agrupamento de conteúdo de anotação semelhantes, redundantes e heterogêneos da mesma ou de diferentes recursos para grupos de anotações com base na hipótese de que as anotações semelhantes devem ter membros de genes semelhantes. enriquecimento Gene é baseado no conjunto de genes apresentados que são altamente associados a determinados termos, que é estatisticamente medidos pela Fisher Exact no sistema de DAVID. Neste estudo, foi utilizada a pontuação de enriquecimento de grupo que é a média geométrica de todos os p-valores de membros individuais de um cluster anotação correspondente. A maior pontuação indica um cluster altamente enriquecido, que por sua vez indica o significado biológico do cluster na lista.

em tempo real de amplificação por PCR

real time PCR foi realizada utilizando SYBR em tempo real verde PCR kit de Qiagen em um Mastercycler Eppendorf, EP realplex (Eppendorf, Alemanha). a expressão de ARNm relativa foi determinada por normalização para a expressão de um gene de manutenção, beta-actina e para a expressão do gene U6 microARN. lista Primer é fornecido na Tabela S1.

Western blot

As células foram lisadas com Radio Immuno Precipitation Assay (RIPA) tampão, misturado com tampão Laemmli amostra (1 ×) e fervida. As proteínas foram sujeitas a 12% de SDS-PAGE e electrotransferidas para membrana de nitrocelulose BioRad, 0,22 (BioRad Laboratories, EUA). Membrana foi bloqueada com solução salina tamponada com Tris mais 0,2% de Tween 20 (TBS-T) contendo 3% de BSA (Sigma Aldrich, EUA), seguido por incubação durante a noite anticorpo primário e lavagem com tampão de TBS-T. O anticorpo secundário (anti-rato, conjugado com HRP, 1: 10.000 Sigma Aldrich EUA) diluídos em tampão de bloqueio foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente e lavou-se de novo com TBS-T. proteínas de anticorpos reactivos foram detectados por meio de quimioluminescência aumentada, Amersham ECL Além disso, os reagentes de detecção de mancha Western (GE Health Care, Reino Unido). detalhes de anticorpo são apresentados na Tabela S1.

citometria de fluxo para análise do ciclo celular

As células foram colhidas e lavadas em PBS antes da fixao em etanol frio a 70% que foi adicionada gota a gota ao sedimento enquanto vórtex. As células foram fixadas durante 30 min a 4 ° C. As células fixadas foram lavadas duas vezes em PBS e centrifugadas a 250 g numa centrífuga. As células foram incubadas com 50 uL de uma de 100 ug /ml de caldo de ARNase e 200 ul de iodeto de propídio (50 ug /ml de solução). Um BD FACSCalibur (EUA) citómetro de fluxo foi usada para analisar a população de células para as alterações do ciclo celular.

CFU- ensaio

As células foram cultivadas em metil celulose a 10X a concentração final de (0,3 mL de células a 3 ml de metil-celulose). Tubos foram agitados para garantir as células e os componentes foram bem misturados. Metil celulose foi dispensado usando uma seringa 3cc e espalhar uniformemente no prato por agitação suave. As culturas foram incubadas a 37 ° C, 5% CO2 em ar e ≥95% de humidade. As colónias foram então coradas com violeta de cristal (0,5 mg /ml em 1% de metanol) durante 20 minutos e secas ao ar após a lavagem com água destilada. colónias coradas foram visualizadas sob uma Nikon Eclipse Ti microscópio de contraste de fase.

A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em repetições e os resultados foram expressos em média ± S.D. A significância estatística foi calculada utilizando teste t de Student com o programa Prism 5 (software GraphPad, EUA).

Resultados e Discussão

Cultura de células em microgravidade

A disponibilidade de uma superfície de adesão para células no TCP é um estímulo para o crescimento de células aderentes, tais como, DLD-1 e, portanto, as culturas estáticas no TCP eram confluentes (Fig 1A). lentas rotações por minuto (RPM) do HARV (16 rpm, a Figura 1B) não permitir que as células a fundir-se as células, mas poderiam formar agregados a 27 RPM (Fig 1C). A coloração com AO /EB demonstrou nenhuma morte celular em culturas TCP estáticas (Fig 1D), mas revelou morte celular em culturas de microgravidade de DLD1 em 16 RPM (Fig 1E). A viabilidade celular foi melhorada quando as células agregados em 27 RPM (Fig 1F). Quando estes agregados celulares foram enzimaticamente dissociada e cultivadas num TCP após 48 horas em ambiente de microgravidade, células levou 48 horas para aderir (Figura 1G, Dia 2), enquanto as células a partir de culturas estáticas aderidas no prazo de 24 horas (Figura 1G, dia 1) e produzida confluentes culturas por dia 4. microgravidade foi mostrada para afectar várias funções celulares [7] e a expressão ou funcionamento de moléculas de adesão celular pode ser afectada [8] a redução do número de células DLD-1 que podem aderir ao TCP. Quando tais agregados de células foram plaqueadas em TCP sem dissociação enzimática, a morfologia das células DLD-1 foi alterado (Fig 1H e 1I). Cristal coloração com violeta de células cultivadas em cultura em monocamada estática mostra a morfologia típica de células DLD-1 (Fig 1H) enquanto que os agregados de células assumem um padrão de crescimento semelhante a uma cultura de explante e as células periféricas continha uma grande citoplasma e no núcleo (Figura 1I). A célula alargada talvez devido a alterações do citoesqueleto durante o crescimento em microgravidade [9] ou células, tendo perdido o controle sobre o ciclo celular, podem acumular proteína pré-mitótico no citoplasma com o núcleo poliplóide em [9] o aumento em tamanho. A formação de colónias de ensaio (CFA) no DLD 1-culturas em microgravidade deslocado para TCP estática após dissociação enzimática (Figura 1J e 1K) revelou o potencial reduzido de células DLD-1, para formar colónias (Figura 1K), em comparação com células estáticas (Fig 1J). A capacidade proliferativa reduzida em culturas de microgravidade foi confirmada por um ensaio de viabilidade celular utilizando MTT. culturas estáticas foram 41% mais viável do que 27 culturas RPM e 75% mais viável do que 16 culturas RPM em microgravidade (Fig 2A). Quando estes resultados são considerados em conjunto, microgravidade parece afectar significativamente a viabilidade e a proliferação de células DLD-1. A citometria de fluxo de análise PI carregado células DLD-1 cultivadas sob microgravidade foi comparado com o perfil do ciclo celular das culturas em suspensão estática TCP e estática no subpavimento de agar (Fig 2B, 2C e 2D). Por falta de ancoragem, as culturas de células em suspensão em agar estáticos também agregar semelhante ao RCCS, no entanto, a simulação de microgravidade está ausente. DLD-1 em culturas de microgravidade tinha uma população substancial das células na fase G0 sub embora uma grande população de células era ainda viável em microgravidade (Fig 2C). monocamada estática, culturas TCP foram completamente viável (Fig 2B) e significativamente, as culturas de suspensão estáticos não demonstrou uma fase sub G0 e teve perfil semelhante ao controle estático (Fig 2D). Fig 2E mostra a média da população fase sub G0 entre as três condições de cultivo em réplicas de análise do ciclo celular, que confirmou que a viabilidade reduzida era um efeito exclusivo de microgravidade em agregados celulares DLD-1. A linha de células MOLT-4 cresce como uma cultura em suspensão e não se agregar favoravelmente em microgravidade em rotações altas ou baixas, mostrando células individuais na HARV (figura 2F, 16 RPM HARV). No entanto, a viabilidade celular foi reduzida em 20% em comparação com o controlo estático em ambos RPM a 48 horas (Figura 2G), que são correlacionados com o número de células reduzido sob observação microscópica após 48 horas (Figura 2F, 16 RPM harv). Citometria de fluxo detectado uma pequena população apoptótica (Sub fase G0) na análise do ciclo celular de MOLT-4 culturas em microgravidade em 16 RPM (Fig 2H e 2I)

A culturas de células DLD-1.; cultura estática (controle) B DLD-1 cultura Microgravidade em 16 RPM cultura C DLD-1 Microgravidade na coloração 27RPM diferencial para detectar culturas população apoptótica D DLD-1Static culturas em monocamada E Microgravidade de DLD1 em 16 culturas RPM F Microgravidade de DLD1 em 27 RPM G ensaio de adesão e proliferação celular Top painéis estáticos culturas, inferiores culturas painel de microgravidade deslocado para mudanças TCP H morfológicas estáticos em DLD-1; O violeta de cristal a coloração de células DLD-1 em cultura de monocamada estática I coloração violeta cristal de células DLD-1 após a transferência de agregados de células de microgravidade para ensaio de capacidade de formação de TCP J Colony; culturas estáticas K Colony formando ensaio de capacidade; DLD-1 células após a transferência de agregados celulares de microgravidade para TCP

Um ensaio de viabilidade celular para células DLD-1; Viabilidade medida para culturas de microgravidade (16 RPM e 27 RPM) e culturas estáticas usando B análise do ciclo celular MTT para células DLD-1; análise C do ciclo celular estático; Microgravidade D análise do ciclo celular; suspensões estáticos em underlays agar E a média da população G0 sub em réplicas de análise do ciclo celular para microgravidade, estática e culturas em suspensão estática de células DLD-1 F MOLT-4 cultura de células estáticas e Microgravidade culturas de MOLT-4 G ensaio de viabilidade celular Viabilidade medida para as culturas de microgravidade (16 RPM e 27 RPM) e culturas estáticas usando a análise do ciclo celular MTT H; Análise I ciclo celular estático; culturas de microgravidade de MOLT-4.

PCR em tempo real para análise de expressão gênica

Para afetar processos centrais de câncer, como a proliferação celular e ciclo celular, microgravidade deve influenciar significativamente as funções fundamentais do da célula tais como a expressão do gene. Medimos os níveis de mRNA de genes importantes envolvidos no ciclo celular e progressão do câncer para verificar a sua desregulação sob microgravidade. Ciclina níveis de expressão do gene influenciam significativamente a progressão e metástase do cancro uma vez que podem dirigir a proliferação celular ou apoptose. Cdk são essenciais para G1 /S e G2 /M transições de fases do ciclo celular e a sua expressão genética desregulada pode afectar a progressão do ciclo celular. A transcrição da

CDK1

é regulado de tal forma que ele funcione durante o prophase mitótico e metaphase [10].

CDK1

expressão foi regulada negativamente em MOLT-4 e regulada em DLD-1 (5 vezes em relação controle estático) (Fig 3A). A expressão de genes fundamentais para o desenvolvimento e progressão do cancro, que incluem oncogenes e marcadores de células-tronco do câncer potenciais, foram desregulados em microgravidade.

CD117

(receptor tirosina quinase c-kit) expressão foi regulada 11,2 vezes em MOLT-4 e reprimidos por 0,2 vezes em DLD-1 sob microgravidade (Fig 3A). a alta expressão de c-kit protege as células de carcinoma do cólon contra a apoptose e aumenta seu potencial invasivo [11]; portanto, c-kit downregulation em DLD-1 sob microgravidade pode ser significativo. DLD-1 constitutivamente mais expressa o

MYC

gene [12] em condições normais. Superexpressão de

MYC

sensibiliza células para a apoptose e sob microgravidade

MYC

expressão do gene foi ainda aumentada em DLD-1 por três vezes (Fig 3A). MOLT4 expressaram níveis de

baixou MYC

(0,4 vezes) em microgravidade (Fig 3A).

JUNB

codifica um regulador da transcrição de genes de proliferação de células e faz parte da família do gene precoce imediato [13]. Um dos genes mais importantes a ser desreguladas em ambas as linhas celulares em microgravidade,

JUNB

é regulada positivamente em condições de microgravidade de 2,1 e 1,2 vezes em células MOLT-4 e DLD-1, respectivamente (Figura 3A).

A

CDK1

gene ciclo quinase -cell,

CD117

-proto-oncogene,

JUNB

-transcription fator eo gene precoce imediato,

MYC

-proto-oncogene expressão em DLD-1 e em tempo real de análise de PCR MOLT-4 B na HL-60

CCNE1

e

CDK2

,

CCNB1

e

CDK1

, Oncogenes:.

CD117

e

MYC

, câncer marcadores prognósticos

CD105

,

CD90 Comprar e

CD71

gene análise da expressão em HL-60, uma linha de células de leucemia promielocítica

Como um controle adicional para tumor de sangue (e de suspensão) culturas, verificamos os níveis do ciclo celular de expressão gênica genes e oncogenes em uma linha de células de leucemia promielocítica, HL-60. PCR em tempo real revelou o regulamento acima de

CCNE1

e

CDK2

em culturas Harv com

CDK2

sendo significativamente up-regulada (1,1 e 1,8 vezes, respectivamente) (Fig 3B) .

CCNB1

e

CDK1

expressão do gene foi desregulado com

CDK1

sendo até regulado 1,5 vezes e

CCNB1

regulada negativamente em 0,8 vezes (Fig 3B). Significativamente, os oncogenes proto

CD117

e

MYC

foram altamente até regulamentada em microgravidade por 4,7 vezes e 10,8 vezes, respectivamente (Fig 3B). Semelhante à linha de células DLD-1, HL-60 também expressa através da

MYC

gene constitutivamente sob condições padrão. Os marcadores prognósticos

CD71

,

CD105

e

CD90

foram desregulados sob microgravidade em 0,75 vezes (reprimidos), 1,4 vezes (regulada) e 2,1 vezes (regulada), respectivamente ( Fig 3B). Endoglina (

CD105)

auxilia a neovascularização in câncer [14] e

CD90

expressão indica um prognóstico positivo como células progenitoras de leucemia em LMA que são capazes de manter a doença in vitro e in vivo não fazer expressam CD90 [15]. tempo real A análise de PCR de um marcador do ciclo celular candidato, Oncogene, factor de transcrição e progressão do cancro demonstrou tanto a regulação positiva e a regulação negativa. Como o ciclo celular é regulada por uma multiplicidade de factores, muitos dos quais poderiam ser afetados por microgravidade, a regulação negativa “coletiva” ou desregulação dos processos associados com o ciclo celular pode validar a parada fisiológica observada ou redução na proliferação celular sob microgravidade. Para este objectivo, uma grande expressão do genoma de perfil usando microarranjo de DNA foi realizado. O perfil genômico também nos permitiu especular sobre o efeito da microgravidade em vias centrais no cancro, tais como o sistema de sinalização Notch, e os níveis de expressão do novo reguladores, tais como microRNA.

análise de Microarray da DLD-1 e MOLT- 4 células cultivadas em microgravidade

análise Microarray revelou 1801 e 2542 genes cima e para baixo regulados mais de 2 vezes em células DLD-1 cultivadas em microgravidade em relação ao controle estático. MOLT-4 culturas sob microgravidade diferencialmente expressos um total de 349 e 444 genes cima e para baixo regulados mais de 2 vezes, respectivamente. A Tabela 1 representa uma pequena lista de genes comuns desregulados entre ambas as linhas celulares. Uma lista completa dos genes altamente desregulados entre ambas as linhas celulares são fornecidas nas Tabelas S2, S3 e S4. Os genes altamente desregulados representados nas tabelas de informação de suporte contêm genes candidatos interessantes, como o ribonucleótido-redutase M2 (

RRM2

) subunidade que é o gene mais baixo regulamentada em DLD-1 sob microgravidade. RRM2 sobre-expressão pode ser associada com o cancro Colo rectal (CRC), a progressão e pode desempenhar um papel importante na infiltração e metástase de CRC [16]. Ele serve como um biomarcador de prognóstico e prevê pobres sobrevivência de câncer colorretal [17]. Enquanto ambas as linhas celulares exibiram alterações no ciclo celular e a viabilidade celular, microgravidade eliciou uma resposta maior a partir da linha celular de tumor sólido DLD-1. estresse letal Sub pode empurrar uma célula em um estado que é semelhante ao envelhecimento replicativo [18]. induzida pelo estresse senescência prematura (SIPS) pode ocorrer após danos no DNA, o estresse oxidativo e tratamento com inibidores da histona deacetilase [18]. O fenómeno de SIPS pode explicar a perda de viabilidade celular em ambas as linhas celulares. Microarray Analysis revelou a infra-regulação do gene do retinoblastoma (

RB1 ​​

; -0,42 log mudança vezes) em células DLD-1 sob microgravidade e quanto à presença da proteína RB1 é necessário para SIPS [19], a resposta de células DLD-1 a microgravidade pode não ser através do SIPS e suas vias relacionadas. Por outro lado as células MOLT-4 mostram a expressão regulada positivamente RB1 (mudança de dobragem 0,47 log) sob microgravidade e a perda de viabilidade celular pode ser atribuída a SIPS. Isto também pode explicar a relativamente menor número de genes que foram diferencialmente expressos em células MOLT-4 em comparação com o perfil de expressão de genes de células DLD-1 sob microgravidade. Outros marcadores de SIPS, apolipoproteína J e fibronectina, que são sobre-expressos em senescência replicativa e SIPS [19], não foram diferencialmente expressos em DLD-1 ou células MOLT-4 em microgravidade. O mecanismo de SIPS não é claramente compreendido ainda e se microgravidade pode ser um gatilho para vias SIPS precisa ser confirmada. Os dados discutidos nesta publicação foram depositados em Omnibus Gene Expression do NCBI e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE69271 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69271) . Os genes expressos diferencialmente a partir dos dados de microarray foram estudados quanto à sua superabundância em termos diferentes Gene ontologia (GO), bem como vias usando o software de análise de microarray DAVID. A pontuação de enriquecimento termos GO individuais que os genes associados com foi usado para identificar os processos que foram significativamente desregulado. GO ou análise funcional de enriquecimento foi realizada com mais de dois genes dobra-diferencialmente expressos em ambas as linhas celulares. classificação funcional de genes com base na similaridade de função ou a família foi levada a cabo.

Validação de genes candidatos selecionados a partir de dados microarray

análise Microarray revelou a regulação positiva de

CCNB1

e a regulação para baixo dos

ROMO1

e

HES1

genes quando as células MOLT-4 foram cultivadas em microgravidade (Fig 4A). Da mesma forma, a análise de microarray demonstrou a regulação para baixo dos

CDK2

gene ea regulação positiva de

STAT3

e

HEY1

genes em células DLD-1 cultivadas em microgravidade (Fig 4B). microarrays análise revelou que ambas as linhas de células comumente mostrou a regulação para baixo dos

CCNE1

ea regulação positiva de

CD71 Comprar e

CD44

genes (Fig 4C, Fig 5A). Significativamente, a desregulação do gene acolhimento microRNA-22 e suas metas também estava sob microgravidade (Fig 5B). a expressão de ARNm destes genes candidatos representativos da progressão do ciclo celular, regulação da transcrição e cancro foram validados por PCR em tempo real quantitativa. Ciclina B1, que foi classificado como constitutivamente sobre-expresso em cancros colo-rectais humanos [20] é mais expresso em células MOLT-4 que mostraram um aumento de 7,5 vezes da

CCNB1

expressão de mRNA sob microgravidade (Fig 4A). expressão reduzido de

ROMO1

leva à inibição do crescimento celular [21] e células MOLT-4 expressa 0,5 vezes menos

ROMO1

do que o controle estático (Fig 4A). Transcricional e controladores de replicação regular oncogenes e marcadores prognósticos e eventos do ciclo celular influência.

HES1

é um repressor transcricional e está envolvido na reparação do ADN [22] e

HES1

a expressão do gene é controlado pelo entalhe e sistema de sinalização junho [23].

HES1

expressão do gene é regulada negativamente em 0,7 vezes em MOLT-4 (Fig 4A) sob microgravidade.

CDK2

expressão genética em células DLD-1 foi de 0,5 vezes menor em relação ao controle estático (Fig 4B), enquanto

HEY1

, um regulador da transcrição foi altamente até regulada por 10,3 vezes (Fig 4B). transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (

STAT3

) é um factor de transcrição que é activado oncogénica e expressas de forma aberrante em muitos cancros colorrectais [24] e a regulação positiva de genes é validado por RT-PCR (Figura 4B). a expressão do gene da ciclina E1 é regulada negativamente em ambas as linhas celulares sob microgravidade (Fig 4C). A ciclina E1 controla a progressão do ciclo celular durante a fase G1 pela sua interacção com ciclina cinase dependente 2 [25]. De igual modo, ambas as linhas celulares expressavam níveis de

CD71, que codifica uma glicoproteína transmembranar que é responsável pela absorção de ferro celular (Figura 4C) reduzido. DLD-1 expressa níveis significativamente mais baixos (0,42 vezes) na microgravidade. maior expressão de

CD71

está associada com prognóstico negativo para muitos tumores sólidos e alguns linfomas [26,27] e numerosos estudos encontraram uma correlação positiva entre o armazenamento de ferro e o risco de tumores, como no carcinoma colorectal [28 ]. Significativamente, a

gene CD44

foi regulada em ambas as linhas celulares (Fig 4C, Fig 5A). Enquanto a maioria das isoformas de

CD44

estão associados com a forma maligna da doença, algumas formas de

CD44

impedir as células tumorais se espalhem para fora do local primário [29]. Como

CD44

é expresso em ambos os cancros do cólon e cânceres linfóides e, como análise de mRNA envolveria múltiplas variantes, investigamos os seus níveis de proteína em DLD-1 e MOLT-4 culturas em microgravidade. Western blotting para isoforma padrão de

CD44

mostra os níveis mais elevados da proteína em ambas as linhas de células de mais de controle estático (figura 5A). A análise densitométrica das bandas e normalização com valores de p-actina demonstra regulamentação significativa acima do

proteína CD44

em microgravidade. microARN foram identificados como potenciais oncogenes ou supressores de tumor [30]. O gene de acolhimento miR-22,

MIR22HG

foi altamente regulada em DLD-1 (Log dobra 4.4), mas não diferencialmente expressos em MOLT-4 (Fig 5B). miR-22 funciona como um supressor de tumor por meio da regulação pós-transcricional da p21 para determinar o destino das células [31]. Ele reprime a progressão do câncer através da indução de senescência celular [32] e controla EVI-1 expressão oncogene em células de cancro da mama metastático [33]. Alguns alvos de miR-22, como

SP1

,

CDK6

e

CCNA2

também foram significativamente subregulado (Fig 5B), enquanto outros, como a p21 (

) não foram significativamente desregulado. O receptor X farnesoid regula miR-22 que tem como alvo

CCNA2

em células do cólon e câncer de fígado [34]. PCR em tempo real para o miR-22 microRNA também mostrou uma regulação positiva dobra 4,18 log em células DLD-1 sob microgravidade (Fig 5B) confirmando a mudança vezes observado na análise de microarray. Time PCR real para miR-22 targets-

CCND1

e

CDKN1A

no entanto, não mostrou desregulação significativa com -0,09 vezes log (down regulation) e 0,11 log vezes (até regulamentação) mudança, respectivamente (Fig 5B).