Humana
Abstract
RB1
-inducible enrolada-coil 1 (RB1CC1, também conhecido como FIP200) desempenha um papel na melhoria da via RB1 através da ligação directa a um montante região 201bp rico em GC (desde o início ATG) da
RB1
promotor. Aqui, nós identificada hSNF5 e p53 como os parceiros de ligação de RB1CC1 por ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência. Interação entre essas moléculas e da via RB1 foi analisada por ensaios de imunoprecipitação da cromatina, luciferase-repórter, reversa reação em cadeia de polimerase e immunoblot. A supressão do crescimento do tumor por RB1CC1 foi avaliada por citometria de fluxo ou por um ensaio de crescimento celular. O complexo RB1CC1 nuclear envolvendo hSNF5 e /ou p53 activado transcrição da
RB1
,
p16
e
p21
, e crescimento de células tumorais suprimida. Além disso, a expressão RB1CC1 nuclear significativamente correlacionados com os de RB1 e p16 no tecido do cancro da mama
in vivo
, eo índice de proliferação Ki-67 era dependente de p53, bem como RB1CC1. O presente estudo indica que RB1CC1 juntamente com hSNF5 e /ou p53 aumenta a via RB1 através da ativação da transcrição do
RB1
,
p16
e
p21
. é esperado Avaliação da expressão RB1CC1 combinado com RB1 e estado de p53 para fornecer informações úteis na prática clínica e futuras estratégias terapêuticas no cancro da mama
Citation:. Chano T, Ikebuchi K, Ochi Y, Tameno H, Tomita Y, Jin Y, et al. (2010) RB1CC1 Ativa Pathway RB1 e inibe a proliferação e Cologenic sobrevida no câncer humano. PLoS ONE 5 (6): e11404. doi: 10.1371 /journal.pone.0011404
editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de novembro de 2009; Aceito: 09 de junho de 2010; Publicação: 30 de junho de 2010
Direitos de autor: © 2010 Chano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por KAKENHI (Grant-in-Aid para a Investigação científica em áreas prioritárias; No. 20.012.025) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão; e da Sociedade Japonesa de Laboratório Fundo de Medicina para a Promoção da Investigação Científica. Estas fontes de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar, preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A proteína supressora de tumor retinoblastoma (RB1) regula a progressão do ciclo G1 /fase S de células e é um mediador fundamental de sinalização antiproliferativa. Embora a fosforilação desempenha um papel importante na regulação funcional de RB1, a regulação da transcrição de RB1 é muito menos conhecido [1]. RB1-inducible enrolada-coil 1 (RB1CC1: o símbolo usado aqui, que é aprovado pela Organização [HUGO] Comité de Nomenclatura do Genoma Humano Gene, que também é conhecido como FIP200, proteína que interage com a família quinase de adesão focal de 200 kDa) foi identificado como um regulador do caminho que RB1 em particular Melhora
RB1
transcrição [2], [3]. Recentemente, demonstrámos que RB1CC1 nucleares liga-se a um 201bp região rica em GC a montante (a partir de iniciação ATG) do promotor de RB1 e activa a expressão de [4] RB1. Um rearranjo genético de
RB1CC1
também tem sido sugerida para ser envolvido na tumorigénese de cancro da mama [3], [5]. Curiosamente, foi relatado que se liga e estabiliza RB1CC1 p53 [6], sugerindo que RB1CC1 pode ser um mediador importante que liga as vias de RB1 e p53. Nosso estudo investiga o mecanismo de aprimoramento RB1CC1 da via RB1. RB1CC1 forma um complexo com p53 e /ou hSNF5, um fator-remodelação da cromatina, nos núcleos celulares, e ativa a transcrição de
RB1
,
p16
e
p21
. Além disso, RB1CC1 nuclear correlaciona-se significativamente RB1 e p16 expressão no tecido do cancro da mama
in vivo
.
Resultados
RB1CC1 forma um complexo com hSNF5 e /ou p53
inicialmente tentaram identificar proteínas RB1CC1 de ligação em células MCF-7 de cancro da mama por um ensaio de imunoprecipitação seguida por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS /MS). Um factor de cromatina remodelação, hSNF5 (também conhecido como BAF47 ou INI1) foi co-imunoprecipitada com RB1CC1 (Fig. 1A). O ensaio suspenso utilizando RB1CC1 deletion-mutantes revelou que era necessária a região C-terminal da RB1CC1 (aa 1364-1594) para a interacção com hSNF5 (Fig. 1B e C). O N-terminal da RB1CC1 também interage com o p53 [6], por isso, considerado que RB1CC1 pode formar um complexo com hSNF5 e /ou p53 para inibir o crescimento do tumor. A formação do complexo entre RB1CC1, hSNF5 e p53 foi avaliada por ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência. RB1CC1, hSNF5 e p53 foram co-imunoprecipitada com dois tipos de anticorpos que reconhecem sítios diferentes de RB1CC1 (AA 25-271 e 549-817.); a composição de cada um dos precipitados é diferente, provavelmente devido às fracções preferíveis de cada anticorpo (Fig. 1D). RB1CC1-1 e anticorpos -2 tendem a ligar-se com maior preferência para as fracções nucleares e citoplasmáticos, respectivamente. hSNF5 e p53 abundantemente nuclear (que pode ser fosforilado e mais lentamente mobilizado em PAGE) pode ser de um modo preferido co-precipitado com o complexo entre o anticorpo e RB1CC1 nuclear RB1CC1-1. Reciprocamente, o anticorpo pode ligar-se RB1CC1-2 dominantemente a RB1CC1 citoplasmática abundante, bem como hSNF5 e alguns de p53 no citoplasma. RB1CC1, hSNF5 e p53 foram co-localizados nos núcleos celulares com a excepção de nucléolos (Fig 1E e F;. A Fig. S1). Os dados indicaram que RB1CC1 forma um complexo com hSNF5 e /ou p53, principalmente em núcleos celulares.
(A) MCF-7 lisados celulares foram imunoprecipitados (IP) com anticorpo anti-RB1CC1 e analisadas por SDS-PAGE seguido por coloração com prata. A molécula que foi co-imunoprecipitada com RB1CC1 foi identificado como hSNF5 por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS /MS). (B) da Bandeira-RB1CC1 e HA-hSNF5 foram co-transfectados em células HEK293. Os lisados foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Flag ou anticorpos anti-HA, e analisados por imunomanchas como indicado. As setas indicam os sinais co-imunoprecipitada. (C) As células HEK293 foram transfectadas com HA-hSNF5 tanto de tipo selvagem (cheio) e Flag-RB1CC1 variantes; tipo selvagem (wt), DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC e FCC. Diagramas esquemáticos de RB1CC1wt e mutantes são também indicadas no lado esquerdo. O rectângulo mostra o local de ligação para hSNF5, e o rectângulo tracejado indica que para a p53. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-HA e imunotransferidas como indicado. (D) MCF-7 lisados foram imunoprecipitados com dois tipos de anticorpo anti-RB1CC1 e foram analisadas por imunocolorações. (E) RB1CC1 (verde), hSNF5 (vermelho), p53 (azul) e a imagem mesclada em células HeLa. Cada proteína é marcada por imunofluorescência Alexa 488, 594 ou 350, respectivamente. Barra de escala, 50 mm. (F) RB1CC1 (verde), DAPI e a imagem mesclada em células HeLa. RB1CC1 é por Alexa 488 marcado com imuno, e DAPI é exibida com fluorescência azul em núcleos celulares. Barra de escala, 50 mm.
RB1CC1 se liga e ativa os promotores de RB1, p16 e p21, cooperando com p53 e /ou hSNF5
RB1CC1 [2], [4] , [6] e hSNF5 [7], [8], [9], [10] aumentar a transcrição de moléculas envolvidas na via de RB1, por isso examinado se RB1CC1, hSNF5 e se ligam a p53 para as regiões do promotor de
RB1
,
p16
e
p21
. Cromatina imunoprecipitação (chip) ensaios usando anticorpos contra RB1CC1, hSNF5 e p53 indicou que os fragmentos de promotor de
RB1
,
p16
e
p21
, que foram amplificados a partir da cromatina de células HeLa , foram precipitados por cada um dos anticorpos (Fig. 2A), sugerindo que as moléculas são recrutados para as regiões promotoras da via de RB1. O envolvimento destes três moléculas na expressão de
RB1
,
p16
e
p21
foram validados através da introdução sh-RNA para
RB1CC1
(sh –
RB1CC1
),
hSNF5
(sh-
hSNF5
) e
p53
(sh-
p53
) em células HeLa . Os efeitos knockdown no
RB1CC1
,
hSNF5
,
p53
,
p21
,
p16
e
RB1
expressão de mRNA foram analisados por semi-quantitativa por RT-PCR. sh-
RB1CC1 Comprar e sh-
hSNF5
diminuição dos níveis de mRNA de
RB1
,
p16
e
p21
, enquanto sh-
p53
diminuiu apenas
p21
mRNA (Fig. 2B). Em outras palavras, RB1CC1 e hSNF5 são obrigados a manter transcrições de
RB1
,
p16
e
p21
, enquanto que p53 é especificamente necessário para a transcrição da
p21
. RB1CC1 activado significativamente os promotores de
RB1
,
p16
e
p21
(Fig. 2C), e do knockdown de RB1CC1 suprimiu-los (Fig. 2D). Estas melhorias de promotor por RB1CC1 foram comparados entre HeLa, células TTC642 (hSNF5-null) e H1299 (p53-null), a fim de validar a exigência de hSNF5 ou p53 quando RB1CC1 ativa
RB1
,
p16 Comprar e
p21
. RB1CC1 foi incapaz de proporcionar um aumento significativo de
RB1 Comprar e
p16
promotores em TTC642 células, e teve apenas um pequeno papel em
p16
e
p21
transcrição em células H1299 (Fig. 2E). Considerando a via RB1 iniciada por RB1CC1, RB1CC1 requer hSNF5 para o realce de
RB1 Comprar e p53 para o realce de
p21
transcrições, mas ambos hSNF5 e p53 são necessários para o aprimoramento RB1CC1 de
p16
transcrição. Em resumo, RB1CC1 requer interação com ambos hSNF5 e p53 para fornecer uma forte ativação de
RB1
,
p16
e
p21
promotores.
(A ) imunoprecipitação da Cromatina (ChIP de ensaio) foi realizada em células HeLa. A cromatina foi imunoprecipitada por anticorpos anti-RB1CC1, anti-p53, ou anticorpo anti-hSNF5. Cada precipitado DNA foi analisado por PCR quantitativa e semi-quantitativo utilizando os primers específicos do promotor de
RB1
,
p16
e
p21
. As intensidades de sinal foram definidas com base aquelas oriundas de DNA de entrada (2 ng /mL) de células HeLa, que foram definidos como 1,000. (B) semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada com o número ciclo individual para cada transcrição em células HeLa tratadas com ARNsh para
RB1CC1
,
hSNF5
ou
p53
. Sh-
GL3
, sh-
p21 Comprar e sh-
p16
foram utilizados como controle. Parênteses indicam os números do ciclo de PCR. (C-D) em células HeLa, a actividade de luciferase do promotor de
RB1
,
p16
e
p21
aumentou significativamente após a transfecção do plasmídeo que expressa RB1CC1 (RB1CC1wt) (
C
) e diminuiu acentuadamente após o knockdown de RB1CC1 usando sh-
RB1CC1
-1 e -2 (
D
), em comparação com células transfectadas com pcDNA ou sh-RNA precipitação, respectivamente, como controles. Os valores indicam as médias ± erros padrão de experimentos em quadruplicado. (teste t de Student; asteriscos (*) indicam diferenças estatisticamente significativas entre pcDNA e RB1CC1wt ou entre corrida e sh-
RB1CC1
*, p . 0,05, e ** p 0,01). A eficiência da expressão excessiva ou knockdown de RB1CC1 foi validado por manchas de Western, tal como indicado nos painéis superiores. (E) após a introdução de RB1CC1wt, as actividades da luciferase dos promotores para
RB1
,
p16
e
p21
foram comparados entre HeLa, TTC642 (hSNF5-null) e H1299 células (p53). Asteriscos (**) indicam diferenças estatisticamente significativas (teste t de Student; p 0,01). Entre HeLa e TTC642 ou entre HeLa e H1299
RB1CC1 ativa a via RB1 e suprime o crescimento de tumores
para avaliar se RB1CC1 aumenta vias RB1 para suprimir o crescimento de células de câncer, as células HeLa foram lentivirally transduzidas com
RB1CC1
cDNA ou shRNA. A expressão ectópica de RB1CC1 aumentou os níveis de proteína de p53, p21, p16 e RB1, e inibiu o crescimento celular (Fig. 3A e B, painel esquerdo). Em contraste, o knockdown de RB1CC1 endógena por SH-
RB1CC1
diminuiu os níveis de p53, hSNF5, p21 e p16, e aumentado o crescimento celular (Fig. 3A e B, painel da direita). Os mesmos experimentos em duas linhas de células de câncer de mama (MCF-7 e SK-BR3) obtiveram resultados semelhantes (Fig. S2A-D).
RB1CC1
-transduced células, o número de /G1-se células em fase G0 foi aumentada concomitantemente com a diminuição do número de células em S e G2 /M fases. Introdução de sh-
RB1CC1
diminuiu a população G0 /G1 e aumentou as populações de células no S e /M G2. (Fig 3C;. A Fig. S2E)
células HeLa (A) foram lentivirally transduzidas com
RB1CC1
ou sh-
RB1CC1
. Os lisados foram imunotransferidas como indicado. ensaios (B) de crescimento em células HeLa transduzidas como em
a
. Os dados foram quantificados a partir de experiências em triplicado (inferior da coluna). imunotransfer�cias representativos, pratos e significa número de colónias ± erros padrão são mostrados. (C) após a modificação de expressão de lentivírus RB1CC1, as células NIH3T3 foram analisadas por citometria de fluxo.
RB1CC1 Comprar e sh-
RB1CC1
são indicadas pelo vermelho (à esquerda) e azul (à direita), respectivamente. Os dados (média ± desvio padrão percentagens) foram confirmadas em experiências em triplicado, e um gráfico representativo de citometria de fluxo é demonstrado. pLenti6 e sh-GL3 foram utilizados como controle. As setas indicam que o aumento (seta para cima) e diminui (de seta) foram estatisticamente significativas de acordo com o teste t de Student; p . 0,05 (D) RB1CC1, hSNF5 e forma p53 do complexo de transcrição em núcleos de células, e ativar
RB1
,
p16 e
p21
em conjunto, os dados acima referidos indicou que RB1CC1 formado um complexo com hSNF5 e /ou p53, e ativado globalmente a transcrição da
RB1
,
p16
e
p21
(Fig. 3D).
análise Expressional das moléculas envolvidas na via RB1CC1-RB1 em cancros da mama
in vivo
Para avaliar a correlação entre a atividade proliferativa e da via acima referida RB1CC1 da ativação RB1 envolvendo p53 e hSNF5 no tecido tumoral
in vivo
, avaliamos o estado expressional de RB1CC1, RB1, p16, p21, Ki-67, p53 e hSNF5 em 59 casos de câncer de mama. Quatro casos de nullizygotes RB1 indicaram um elevado Ki-67 índice de proliferação (médias ± erros padrão = 69,7 ± 6,6%). A imunorreactividade de p53-referindo-se a expressão de p21-se divididas em duas categorias, “normal” (p53nor) para coloração fraca e “anormal” (p53ab) para a coloração forte, que altamente indicou que a proteína p53 mutante foi acumulada. Havia 41 e 14 casos de p53nor e p53ab, respectivamente, nesta série. hSNF5 foi altamente conservado em cancros da mama, independentemente do estado de p53 ou RB1CC1 (dados não mostrados). A imunofenotipagem para RB1CC1 foram quantitativamente classificada como I-III. Grau III, expressando RB1CC1 abundantemente nos núcleos celulares, foi registrada como RB1CC1 (+), ao passo que os graus I-II sem RB1CC1 nuclear foram registados como (-) (Fig. 4A). Como relatado anteriormente [4], a expressão de RB1 foi muito bem correlacionada com a expressão RB1CC1 nos casos registados como RB1CC1 (+) e foi maior do que no RB1CC1 (-) dos casos (Fig. 4B, esquerda). A expressão de p16 foi também positivamente correlacionada com a expressão RB1CC1 nuclear (Fig. 4B, 2
nd esquerda). Rotular índices de p21 e Ki-67 em casos p53nor – mas não nos casos p53ab – foram bem correlacionados com o estatuto de RB1CC1 expressão (Fig. 4B, 3
rd esquerda e direita). Juntos, o estatuto de RB1CC1 e p53 expressão foram associados com o aumento da expressão de RB1, p16 e p21, que por sua vez influenciaram o índice Ki-67 da actividade de proliferação em cancros da mama clínicos. Portanto, o estado imuno-histoquímica de RB1 e p53, bem como a de RB1CC1 deve ser bons preditores da actividade proliferativa; Assim, a via RB1CC1-RB1 demonstrada nas nossas experiências poderia desempenhar um papel importante na progressão do cancro da mama clínica
(A) Os graus de imuno-histoquímica de RB1CC1 foram classificados como I-III:. I, na coloração negativa tanto citoplasma e núcleo; II, mancha positiva apenas no citoplasma e negativo em núcleos; III, mancha positiva no núcleo e /ou citoplasma. Os graus III, expressando RB1CC1 abundantemente nos núcleos celulares, foram registrados como RB1CC1 (+), enquanto os graus I-II, sem RB1CC1 nuclear foram registrados como RB1CC1 (-). Barra de escala mostra 50 um. (B) Correlação entre RB1CC1 e RB1, p16, p21 ou Ki-67 no p53normal (gráficos superiores) e anormais (gráficos inferiores) casos. RB1CC1 (-) ou (+) estado é indicado na linha horizontal, e cada índice de marcação está indicada numa linha vertical nos gráficos. Um estado de p53 anormal foi definido como um caso de cancro da mama, quando mais de 50% das células tumorais foram fortemente positivos para p53, enquanto que menos de 10% das células foram positivas para p21. Nesse caso altamente indicado que a proteína p53 mutante foi acumulada, e que as funções intactas de p53 (como activação da transcrição para o
p21
) foram perda. Estudante de
t
-test foi utilizado para avaliar as correlações (*, p 0,05; e ** p 0,01)
Discussão
RB1CC1 é. um novo regulador de RB1 que desfosforila RB1 [2], [6] e aumenta a sua expressão [2], [4]; Além disso, um rearranjo genético de
RB1CC1
pode estar envolvido na tumorigénese do cancro da mama [3], [5]. Mais recentemente, informamos que RB1CC1 nuclear ativa diretamente o
RB1
promotor através de uma região rica em GC montante 201bp (-201 /U-GCbox) [4]. Para esclarecer mais precisamente o mecanismo molecular da acção RB1CC1, um ensaio de imunoprecipitação seguida por LC-MS /MS foi tentada, e um factor de cromatina remodelação, hSNF5 foi identificado. RB1CC1 também interage com o p53, assim RB1CC1 é pensado de modo a formar um complexo com hSNF5 e /ou p53. Pensa-se que induz RB1CC1
RB1
[2], [4], e que hSNF5 melhora
p16
(também conhecido como INK4a ou CDKN2A) e /ou
p21
(também conhecido como CIP1, WAF1 ou CDKN1A) [7], [8], [9], [10]. Na verdade, ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência indicaram que um complexo entre RB1CC1, hSNF5 e formas p53 no núcleo das células, e chip, RT-PCR quantitativa e os ensaios de luciferase para
RB1
,
p16
e
p21
têm sugerido que os melhoramentos da transcrição coordenados destas moléculas são afectados pelo complexo incluindo RB1CC1, hSNF5 e p53. No entanto, RB1CC1, hSNF5 e p53 não são igualmente importantes para a estimulação de cada um dos promotores de
RB1
,
p16
ou
p21
, enquanto três moléculas são recrutados para cada promotor. Por exemplo, silenciando
p53
em células HeLa não teve efeito sobre a transcrição da
RB1
e RB1CC1 sobre-expressão pode ativar o
RB1
promotor H1299 (p53- null) células. Estes significa que p53 não é essencialmente necessário para
RB1
transcrição, e que RB1CC1 e hSNF5 podem cooperar para ativar
RB1
transcrição. Assim, todas as três moléculas não são sempre necessários para a ativação de cada um dos promotores, enquanto que todos os três são necessários para as transcrições coordenados de
RB1
,
p16
e
p21
. Temos também estabeleceu anteriormente que RB1CC1 nuclear se liga e ativa o
RB1
promotor [4]. Curiosamente, um ponto de mutação no -201 /U-GCbox do
foi identificado RB1
promotor em uma família retinoblastoma hereditário [11]. Deve ser salientado que a -201 /U-GCbox de
RB1 Comprar e a ligação complexo transcricional que inclui RB1CC1, hSNF5 and play p53 papéis importantes na carcinogênese humana.
No presente estudo , RB1CC1, em colaboração com hSNF5 e p53, activa a via de RB1 e suprime o crescimento de células tumorais. A fim de activar a via RB1 eficazmente, RB1CC1 devem ser expressos nos núcleos celulares e deve formar um complexo com hSNF5 e /ou p53, como sugerido nos dados de imuno-histoquímica e imunocitoquímica deste estudo. PIASy (uma proteína de inibidor de proteína STAT activada y) interage com o terminal C (aa 1350-1594) de RB1CC1 e recruta um complexo interagir entre PIASy e RB1CC1 do citoplasma para os núcleos [12]. Além disso, PIASy regula negativamente a actividade mammalian target of rapamycin (mTOR) estimulada por RB1CC1 citoplasmática, e positivamente activa a via de sinalização de p53-p21 em conjunto com RB1CC1 nuclear [12]. Estes dados parecem ser compatíveis com os nossos dados apresentados na sublocalização do complexo composto de RB1CC1, hSNF5 e p53. O complexo molecular nuclear, incluindo RB1CC1, hSNF5, p53 e PIASy adicional, podem formar uma grande componente da transcrição para activar a via de RB1 coordenadamente e reprimir a tumorigénese no tecido da mama humana.
expressão nuclear de RB1CC1 poderia ser importante para a supressão do tumor. Como relatado anteriormente, RB1CC1 situa-se não só no núcleo, mas também no citoplasma [4], [6], [13], [14]. RB1CC1 citoplasmática tem sido sugerida para ser o equivalente de levedura Atg17, e vários estudos indicaram que as funções RB1CC1 como uma molécula essencial na regulação autofagia [13], [14], [15]. Autophagy tem sido implicada na tumorigénese, mas o seu papel preciso é ambígua. É concebível que a autofagia tem diferentes papéis nos diferentes estágios, ou contextos, de tumorigênese. Young et al. [16] relataram que a autofagia medeia a senescência mitótico, uma janela para o desenvolvimento do tumor inicial. Sugerimos que a transição citoplasmática-nuclear de RB1CC1 desempenha um papel chave em associação autofagia-senescência. Nossos dados
in vitro Comprar e
in vivo
sugerem que RB1CC1 desempenha papéis diferentes de acordo com a sua localização subcelular. RB1CC1 Nuclear forma um complexo com hSNF5, p53 e qualquer outro componente que contribui para a transcrição da via de RB1, indicando uma possível ligação à senescência mitótico. No entanto, RB1CC1 citoplasmática parece desempenhar nenhum papel como um supressor de tumor ativação da via RB1.
expressão RB1CC1 Nuclear significativamente correlacionados com os de RB1 e p16 no tecido do cancro da mama
in vivo
, independentemente da o estado de p53. Ki-67 índice de proliferação e expressão p21 foram afetados por ambos RB1CC1 e p53, eo índice Ki-67 também dependia estatuto RB1. As expressões de RB1, p16 e p21 afectar o índice Ki-67 da actividade proliferativa, de modo que o estado imuno-histoquímica de RB1 e p53, bem como a de RB1CC1 pode prever a actividade proliferativa do tumor. Assim, a presente dados sugerem que a progressão dos cancros da mama foi sob o forte influência de RB1CC1, bem como o estado de p53 e RB1. Esperamos que a avaliação imuno-histoquímica combinado de RB1, RB1CC1 e p53 irá fornecer informações sobre suas aplicações clínicas, como a possível utilização como biomarcadores de prognóstico.
Em resumo, temos relatado aqui que RB1CC1, ligando o RB1 e p53 vias como um mediador possível, forma um complexo com hSNF5 e /ou p53, que aumenta a via RB1 globalmente. Avaliação imunoistoquímica do RB1 e p53, em combinação com RB1CC1 pode ser um biomarcador úteis em ensaios clínicos de rotina, convenientes e proporcionar uma previsão do comportamento biológico das neoplasias da mama e /ou os tumores de outros órgãos.
Materiais e Métodos
cultura celular
TTC642 foi gentilmente cedido pelos Drs. Shigeru Ohta, Hiroyuki Shimada e Timothy J. Triche (Childrens Hospital Los Angeles, Los Angeles, CA). células HeLa, HEK293, as células MCF-7, SK-BR3 e H1299 foram adquiridos da American Type Culture Collection (MD), e cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10%. Todos os meios de cultura celular foram suplementados com penicilina (50 unidades /ml) e estreptomicina (50 mg /ml).
Anticorpos e reagentes
de coelho anti-soros contra RB1CC1 (AA. 25-271, 549 -817 como cada epitopo) foram criadas tal como anteriormente relatado [4], [17], e a IgG purificada foram utilizados nas experiências. Anti-p53 (FL-393) e anti-p21 (F-5) foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (CA). Anti-HA (3F10) foi a partir de Roche (Alemanha). Anti-Flag (M2) e α anti-tubulina (DM 1A) foram adquiridos a Sigma (MO). Os outros anticorpos eram da BD Biosciences (CA).
imunoprecipitação do complexo de proteínas seguido por espectrometria de líquido conjunto chromatography- de massa (LC-MS /MS)
As células MCF-7 de cancro da mama foram lisadas em tampão de lise EBC contendo Tris-HCl 50 (pH 8,0), NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), 0,25% de desoxicolato de sódio, na 0,2 mM
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4, 100 mM de NaF e cocktail de inibidor de protease a 1% (Wako Chemicals, Japão), e, em seguida, centrifugada durante 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. O sobrenadante de 5 ml (~10mg /ml) foi incubada com 100 ug de anti-anticorpo primário purificado RB1CC1 IgG a 4 ° C durante a noite. Os imunocomplexos foram ligados a proteína G-agarose (Pierce, IL) durante 2 h adicionais a 4 ° C e lavadas cinco vezes com NETN (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5% NP- 40). As proteínas ligadas à proteína G-Sepharose foram eluídas por adição de tampão de amostra Laemmli SDS contendo Tris-HCl 62,5 (pH 6,8), 10% de glicerol, 5% 2-mercaptoetanol, 2% de SDS, e 0,01% de azul de bromofenol para o gel e ferver por 3 min. Após centrifugação a 10.000 x g durante 2 min, o sobrenadante foi sujeito a SDS-poliacrilamida de electroforese em gel (SDS-PAGE), e as proteínas separadas foram visualizadas por coloração com prata. A banda específica fortemente coradas foi em gel digerida com tripsina e os péptidos recuperados foram analisados utilizando um espectrómetro de massa de electropulverização de iões armadilha (LCQ, Finnigan MAT, CA) acoplado em linha com HPLC capilar (Magic 2002, Michrom BioResorces, CA) para adquirir espectros de espectrometria de massa /espectrometria de massa (MS /MS). Os dados derivados a partir do espectro MS /MS foram utilizados para pesquisar uma base de dados de proteínas compiladas, que era composto de NR e uma base de dados de seis-quadro de leitura traduzida base de dados EST, para identificar a proteína utilizando o programa publicamente disponível PROWL (http: //prowl.rockefeller.edu).
DNA e gene plasmídeo de transferência
externo e mutantes de deleção internos para
RB1CC1
(GenBank não. NM_014781) foram gerados no pcDNA3.1 vector plasmídico (Invitrogen), por uma combinação de manipulações baseados em PCR com os iniciadores externos apropriados nas posições descritas abaixo e digestão com enzimas de restrição. Os nucleótidos de todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN.
RB1CC1
mutantes DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC e FCC excluídos os aminoácidos 863-1083, 1078-1363, 1364-1594, 1-1356, 824-1594 e 1-863, respectivamente ( A Fig. 1C, painel esquerdo). A transfecção foi realizada utilizando FuGENE HD (Roche) de acordo com as recomendações do fornecedor. Os vectores plasmídicos de ARNi para
RB1CC1
foram preparados como descrito previamente [17]. Resumidamente, dois tipos de vetores lentiviral sh-RNA (sh-
RB1CC1
-1 e -2) correspondentes a diferentes sites de destino (nt. 2070-2090 e nt. 4611-4631, respectivamente) em
RB1CC1
ARNm (GenBank. NM_014781) foram sintetizados in vitro através da inserção de oligonucleótidos artificiais no pSIH1-H1-Puro vector SH-ARN (Sistema Biosciences, CA). Vetores para sh-RNA de
hSNF5
e
p53
foram preparados por OpenBiosystems (AL). Para controles não silenciar, sh-
GL3 Comprar e vetores mexidos foram adquiridos de Sistema de Biociências e OpenBiosystems, respectivamente. Além disso, humano
RB1CC1
ADNc foi subclonado num vector pLenti6 (Invitrogen). -Lenti vírus transferência SH-ARN ou ADNc foi preparada com cada mistura de embalagem, de acordo com as instruções de cada fabricante. Clonado e células expandidas foram selecionados na presença de puromicina ou blasticidina, respectivamente, e utilizadas nos experimentos.
Pull-down ensaio
marcada com Flag-tipo selvagem (wt)
RB1CC1
ou seus mutantes (DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC e FCC) foram transfectados em células HEK293 combinados com hSNF5 marcada com HA (completo). As células foram lisadas em tampão TNE (Tris-HCl a 20, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1% de NP-40 e 1 mM de Na
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4 contendo uma mistura de inibidores de protease). Os lisados foram centrifugados, e os sobrenadantes foram incubados com anti-Flag ou anti-HA grânulos imobilizados durante 2 h a 4 ° C. As contas foram lavadas cinco vezes com tampão TNE e fervida na presença de tampão de amostra Laemmli SDS. Os complexos de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidos para filtros de membrana de PVDF e sujeitas a análise de imunotransferência com os anticorpos indicados.
A imunoprecipitação para detectar o complexo de proteína
MCF-7 de células de monocamada foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e raspadas para NP-40 tampão de lise arrefecido em gelo (20 mmol /L de Tris (pH 8,0), 137 mmol /L de NaCl, 1% de NP-40, 10% glicerol) suplementado com o cocktail inibidor de protease a 1% (Wako Chemicals) e 3 mmol /l de Na
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4. Os lisados foram incubados em gelo durante 20 minutos, clarificada por centrifugação e a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio do ácido bicinconínico (Pierce). As soluções que contêm de 400 a 1000 ug de proteína foram brevemente pré-aclarados com pérolas de proteína G-agarose (Pierce) e depois utilizado para a reacção de imunoprecipitação com 2 tipos de anti-RB1CC1 coelho IgG policlonais ou IgG normais de coelho de controlo, a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação com esferas de proteína-G durante 2 horas para recolher os complexos imunes. Finalmente, as esferas foram lavadas com tampão NP-40 cinco vezes, ressuspensas em tampão de amostra de SDS, fervidos, resolvida em SDS-PAGE e analisados por imunomanchas como descrito abaixo.
A análise de imunotransferência
As células foram lisadas em geral por transferência de Western tal como descrito por Sarbassov, et al [18]. Depois de limpar os materiais lisadas por centrifugação a 15.000 x g durante 1 min, os sobrenadantes foram fervidas em tampão de amostra de SDS. Proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) filtros. Após o bloqueio dos filtros com TBS-T (Tris-HCl a 10 (pH 7,6), cloreto de sódio 150 mM, 0,1% de Tween 20) contendo 5% de albumina de soro bovino (BSA), os filtros foram incubados durante a noite com os anticorpos primários indicados em TBS-T contendo 2% de BSA, a 4 ° C. Os filtros foram então lavados em TBS-T e incubadas durante 1 h em peroxidase de rábano conjugado com anti-rato, anti-coelho, ou IgG anti-rato (GE Healthcare, UK) diluído 1:20,000 em TBS-T contendo 2% de BSA . Após várias lavagens com TBS-T, a imunorreactividade foi detectada utilizando o sistema ECL (GE Healthcare) de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante.
imunofluorescência
células MCF-7 e HeLa foram cultivadas em lâminas de câmara LabTek ™ (BD Biosciences) para 70% de confluência, fixadas com 1% de formol tamponado a 70% de etanol, e, em seguida, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100. O primário de coelho anti-IgG RB1CC1, rato anti-hSNF5 IgG2a (BAF48) e IgG de coelho anti-p53 (FL393) foram conjugados com Alexa 488, 594 e 350 pelo kit rotulagem ZenonTM (Molecular Probes).