PLOS ONE: Gradiente Ácido através Plasma Membrane pode conduzir Fosfato de Bond Síntese nas células cancerosas: Tumor ácida Milieu como um potencial energético Source

Abstract

cânceres agressivos apresentam uma conversão eficiente de grandes quantidades de glicose em lactato acompanhado por secreção ácida, fenômeno popularmente conhecido como o efeito Warburg. O microambiente ácida e alcalina o citosol criar um gradiente de protões (gradiente de ácido) através da membrana plasmática que representa a energia motriz protónica. Aumentar dados experimentais a partir de modelos fisiológicos relevantes sugerem que gradiente de ácido estimula a proliferação do tumor, e também podem apoiar as suas necessidades energéticas. No entanto, evidências bioquímicas direta ligando gradiente de ácido extracelular para geração de ATP intracelular estão faltando. Neste trabalho, nós demonstramos que as células cancerosas podem sintetizar quantidades significativas de fosfato-bonds de fosfato em resposta ao gradiente de ácido através da membrana plasmática. O fenómeno observado existe na ausência de glicólise e a síntese mitocondrial de ATP, e é única para o cancro. Ensaios bioquímicos usando células cancerosas viáveis, e vesículas de membrana do plasma purificados utilizando fosfato radioactivo, confirmou-síntese de ligação de fosfato de fosfato livre (P

i), e também a localização de esta actividade para a membrana plasmática. Além de ATP, formação predominante de pirofosfato (PP

i) a partir de P

I também foi observado quando as vesículas da membrana plasmática de células cancerosas foram submetidas a um gradiente de ácido trans-membrana. citosois câncer foram encontrados capaz de converter PP

i em ATP, e também estimular a síntese de ATP a partir de P

i das vesículas. Ácido gradiente criado através do metabolismo de glucose por células cancerosas, como observado em tumores, também provou ser crítica para a síntese-ligação de fosfato. Em resumo, estas observações revelam um papel de meio tumor ácida como uma fonte de energia potencial e pode oferecer um novo alvo terapêutico

Citation:. Dhar G, Sen S, Chaudhuri G (2015) Gradiente Ácido através Plasma membrana pode conduzir fosfato de bond Síntese nas células cancerosas: Tumor ácida Milieu como uma potencial fonte de energia. PLoS ONE 10 (4): e0124070. doi: 10.1371 /journal.pone.0124070

Editor do Academic: Marie-Joelle Virolle, Universidade de Paris do Sul, França |

Recebido: 01 de dezembro de 2014; Aceito: 25 de fevereiro de 2015; Publicação: 15 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Dhar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios para GC do Carl e Roberta Deutsch Foundation and Day Kelly. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

efeito Warburg é uma característica metabólica de células de cancro mais agressivo em que a maior parte da glicose é convertida em lactato na presença de oxigénio [1, 2]. A glicólise aeróbica é acompanhada por acidificação do microambiente do tumor [3, 4] que confere a vantagem de crescimento selectivo de células cancerosas por reprogramação metabólica [5-7], o aumento da capacidade de invasão [8-10] e regulação do ciclo celular [11]. células cancerígenas agressivas requerem ATP para gerar blocos de construção suficientes, como proteínas, lipídios e DNA para a proliferação. A conversão da glicose em lactato produz apenas duas moléculas de ATP em oposição a 38 moléculas quando acoplado a fosforilação oxidativa [12]. Portanto, mesmo que a glicólise aeróbica e acidificação extracelular confere vantagem de crescimento selectivo para o câncer, como discutido acima, a forma como as células cancerosas atender sua demanda de energia sob esta condição permanece um paradoxo.

gradiente de ácido ou motriz protónica força ao longo membranas é uma fonte de energia que é utilizado pelas mitocôndrias, cloroplastos e o mundo microbiano para sintetizar ligações de fosfato [12-16]. Primeira proposta por Peter Mitchell em sua teoria quimio-osmótica famosa [17], gradiente de ácido através da membrana continua a ser o método mais amplamente utilizado em sistemas vivos para armazenar a energia de combustíveis metabólicos como a energia potencial eletroquímico. A maquinaria celular subsequentemente utiliza esta energia para dirigir a síntese de ligações de fosfato de alta energia na forma de ATP e outras moléculas de alta energia para a utilização em processos celulares. [13, 16].

É interessante notar que, embora o pH extracelular das células cancerosas é ácida, o pH intracelular é mais alcalina quando em comparação com as células normais [3, 18, 19]. O pH intracelular alcalina e o pH extracelular ácida com a membrana de plasma no meio representa uma piscina substancial de energia motriz protónica. Tumores ser capaz de utilizar esta energia potencial armazenada para dirigir a síntese de-ligação de fosfato de alta energia nas células continuam a ser uma possibilidade. Existe uma forte evidência fisiológica para a importância de gradiente de ácido no câncer que já estão estabelecidos por outros investigadores. Observou-se que o aumento do pH extracelular por injecção de tampões alcalinos no ambiente tumoral reduzido o tamanho do tumor e metástases também inibiu [20, 21]. Além disso, as células cancerosas apresentam proliferação melhorada e capacidade de invasão no ambiente externo ácida [8-10, 22]. Esta evidência in vivo que indicam fisiológico gradiente de ácido, independente do modo de secreção de ácido, estimular a proliferação de células cancerosas e são também de suporte das suas necessidades energéticas. No entanto, têm faltado evidência bioquímica direta ligando gradiente de ácido extracelular para geração de ATP intracelular, e este é o foco do presente trabalho. É um desafio para confirmar a síntese de ATP em resposta ao gradiente de ácido com certeza, eliminando as contribuições de glicólise ou mitocôndrias em um sistema in-vivo. A inibição da glicólise ou mitocôndrias in vivo seria letal. No entanto, isto pode ser investigado utilizando células cultivadas e as vesículas da membrana de plasma purificados. fosfato radioactivo pode ser utilizado para confirmar se as novas ligações de fosfato são formados a partir de fosfato livre e não por permuta de ligação de fosfato. O trabalho aqui apresentado confirma que as células cancerosas podem sintetizar quantidades significativas de ligações de fosfato de fosfato em resposta ao gradiente de ácido através da membrana plasmática.

Materiais e Métodos

Materiais

celular linhas usadas foram obtidas de ATCC e foram cultivadas como indicado. As células foram colhidas quando 80-85% confluentes por desfazer-se com PBS frio contendo FBS a 10%, sem o tratamento com tripsina, para preservar as proteínas de superfície.

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i foram obtidos de Perkin Elmer e foi tratado com fosfatase alcalina de camarão seguido de inactivação de calor para remover contaminantes PP

i. Todos os outros produtos químicos, a menos que mencionado de outro modo foram adquiridos de Sigma Chemicals.

Ensaio para as quantidades de ATP em células em resposta ao ácido gradiente

As suspensões de células (2-3 milhões de células /ml) em PBS ou tampão bis-Tris, contendo 10% de FBS, e trazido até ao estado estacionário por incubação a 37 ° C durante 20-30 minutos, foram acidificada através da adição de 4 volumes de tampão de reacção (20 mM de bis-tris, 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM MgCl

2 ou por adição de pequenas alíquotas de HCl diluído. a reacção foi extinta com vortex com clorofórmio. a camada aquosa foi utilizado para medir o ATP utilizando o kit de ensaio de luminescência da luciferase (Promega).

Determinação da ordem de reação (n)

Declive da linha de log (a /a

o-1) ou log (a-a

o) contra o pH dá a ordem de reação. a

o e a são as quantidades de ATP antes e após a adição de ácido, respectivamente. os detalhes do modelo matemático são dadas no suplemento S1 Fig.

células carregando com

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i e resposta a

ácido

aproximadamente 10-12 milhões de células foram colhidas a partir de placas de cultura por desmantelamento em PBS frio-FBS a 20%. Eles foram, em seguida, lavou-se com tampão de suspensão de células SB que é HEPES 50 mM-MES (1: 1) pH 7,6, NaCl 100 mM, KCl a 2 mM, 2 mM MgCl

2, 0,2 mM de CaCl

2, espermina 0,4 mM (relativamente fresco), 0,25 mg /ml de BSA, e depois suspenso em 1 ml do mesmo tampão, incubadas a 37 ° C durante 30 minutos com agitação ocasional. O sedimento de células foi recuperado e suspenso em tampão fresco 500 ul SB e incubou-se a 37 ° C durante 5 minutos. A isto foi adicionado 5 | iM e 1 uM oligomicina atractiloseo e mantido em gelo durante 15 minutos. Foi adicionado ouabaina (0,2 mM) e incubou-se em gelo durante mais 15 minutos. acidificação local devido ao ajuste das células foi evitada em todos as etapas, invertendo suavemente os tubos ocasionalmente. Após incubação a 37 ° C durante 5 minutos, uma mistura de fosfato de pH frio de sódio a 7,5 e fosfato radioactivo (

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i) foi adicionada de tal modo que a concentração final de fosfato era de 1 mM, com cerca de 0,20 mCi /ml de radioactividade . Este foi, em seguida, incubadas em frio durante 45 minutos com rotação suave. O sedimento de células foi recuperado por centrifugação e lavou-se com 500 ul de tampão de lavagem (WB) que foi SB tampão contendo fosfato de sódio 1 mM, 0,2 uM bafilomicina em adição a oligomicina, atractiloseo e ouabaina como anteriormente. As células foram suspensas em WB para uma densidade de 10 milhões de células /ml e alíquotas de cerca de 175 ul foram feitas em tubos de 1,5 ml separados. Após incubação durante 1 minuto a 37 ° C, as suspensões de células foram acidificada ao pH desejado através da adição de pequenas alíquotas de HCl diluído e incubado durante 45 segundos a 1 minuto, após o que as células foram sedimentadas por centrifugação a baixa velocidade e o sobrenadante foi removido. Para o sedimento foi adicionado 75 ul de clorofórmio e vortex. O sedimento deve ser suspenso em clorofórmio para a lise eficaz das células. A partir da adição de ácido até o ponto em que foi adicionado clorofórmio foi considerado como o tempo de incubação em ácido e foi tipicamente cerca de 90 segundos a 2 minutos. 50 ul de tampão de extracção (EB), que foi de 1 mM de fosfato de potássio pH 6,5, EDTA 0,2 mM, adicionaram-se, em seguida, agitada em vórtice e mantidos no vibrador durante 10-15 minutos. Esta foi então centrifugada e a camada aquosa foi suavemente retirado e mantidos a -80 ° C. Para análise da amostra, cerca de 20 ul do extracto aquoso foram secas por Speed-Vac e analisadas por TLC. Alíquotas também foram utilizados para estimar a quantidade absoluta de ATP usando o kit ensaio de luminescência da luciferase (Promega).

Caracterização enzimática dos produtos de

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i carregado células

A aquosa extrair da acidificação de células foram diluídas com 4 volumes de tampão contendo Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,2 mM, MgCl 1

2. 10 ul desta mistura de reacção foi então tratada com enzimas diferentes (1 unidade), individualmente ou em combinação, juntamente com substratos adicionados. Um total de 8 diferentes reacções foram realizadas. Cada reacção tinha um objectivo específico na identificação da natureza dos nucleidos, conforme detalhado abaixo. O desaparecimento de uma banda durante uma reação característica indicou a sua identidade. 1. A fosfatase alcalina (P-ase, Promega) -Remove grupos fosfato terminais com ligação monoéster. Assim, podem indicar se as bandas têm ligações fosfato terminal. 2. fosfatase inorgânica (PP

i-ase, de New England Biolab) -hydrolyses pirofosfato (PP

i). GTP migra no mesmo local como PP

i na TLC, por isso, esta reacção pode diferenciar entre o PP

i e GTP. 3. fosfodiesterase (PDE) -cleaves a ligação fosfodiéster α-β, portanto, ele pode gerar PP

i a partir dos PNT e fosfato de PDN. Então bandas de NDP e NTP desapareceu com a aparência de uma banda de PP

i. 4. PDE seguido por PP

i-ase-PP

i gerado a partir da reacção com PDE foi clivado por PP

i-ase que confirmou que é PP

i e não GTP. 5. Adenilatoquinase (ADK) e AMP-lo 1 mM converte ATP para ADP, então a banda ATP diminuiu, enquanto banda ADP aumentou. GTP também pode atuar como substrato fraco para essa reação tão banda GTP também diminuiu. 6. Nucleotide difosfato cinase (NDK) e 1 mM ATP-NDK pode transferir fosfato terminal do ATP para os PPRs, então ADP e bandas PIB desapareceu. 7. NDK e 1 mM de ADP-ADP convertido em ATP através de transferência de fosfato a partir de GTP, o GTP, então a banda desapareceu.

Preparação da membrana plasmática

membrana de plasma foi preparado pelo método habitual de inchaço de células em tampão de baixa concentração salina e ruptura por passagem através de uma agulha 25 de calibre estreito. Os tampões e tempo foram escolhidos para melhor preservar a atividade. EDTA não foi adicionado durante a purificação. Tipicamente a 200 milhões de células foram desmanteladas e colhidas a partir de placas de cultura com PBS-FBS a 20% e lavou-se com tampão de fosfato de potássio a 5 mL de 2,5 mM, pH 7,5 e suspensa em 10 ml de tampão A, que era de 10 mM Hepes-MES (1: 1), NaCl 100 mM, KCl a 2 mM a pH 7,0. A isto foi adicionado PMSF 0,1 mM e 2% de FBS e mantido em gelo durante 20 minutos, após o que o fosfato de sódio, pH 7,5 foi adicionado a 1 mM. A suspensão de células foi lisada por 20 ciclos completos com 10 ml de seringa com agulha de calibre 25, enquanto ainda mantendo em gelo. A suspensão lisada foi centrifugada a 1000 x g durante 5 minutos para remover as células intactas e núcleos e depois a 5000xg durante 15 minutos para remover as mitocôndrias. O sobrenadante relativamente claro a partir deste passo foi então centrifugado a 75000xg durante 40 minutos em uma ultracentrífuga. O sobrenadante foi drenado para fora completamente e os sedimentos foram reunidas e lavadas com tampão B que foi tampão fosfato de sódio 1 mM e contendo 0,5 mg /ml de BSA ultra-pura (Invitrogen). Os sedimentos foram então suspensos em 300 ul de tampão A contendo 0,5 mg de BSA ultra-pura /ml e mantidas como 75 mL alíquotas a -80 ° C. Múltiplos de congelação-descongela afectada significativamente a actividade das enzimas. Para preservar a actividade do enzima, os peletes formados durante a centrifugação foram sempre suspensa por pipetagem suave e forte agitação em vórtice foi evitada em todos os passos. Todas as operações foram feitas em frio ou em gelo.

A concentração de proteína na preparação membranar.

Para determinar as concentrações de proteínas, as preparações de membrana foram feitas na ausência de BSA. Eles foram dissolvidos em 0,5% de SDS e a quantidade de proteína foi estimada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce de). Tipicamente, as concentrações de proteína foram na gama de cerca de 0,5 mg /ml. As membranas equivalentes a cerca de 12-15 | ig de proteína por reacção foram usados ​​como a concentração inicial da membrana durante a preparação das vesículas.

pureza de membrana e Western blot.

A análise de imunotransferência utilizando técnicas padrão foram realizadas para estabelecer a pureza das fracções da membrana plasmática. Os peletes de membrana foram dissolvidos por aquecimento, em 1% de SDS a 65 ° C durante 10 minutos. Os extractos celulares totais aquecidas em 1% de SDS a 65 ° C durante 10 minutos, foi utilizado como controlo. Os anticorpos contra ATPase de Na-K (ab7671, Abcam Cambridge) e E caderina (ab15148, Abcam, Cambridge) foram utilizados para determinar o enriquecimento de proteínas de membrana de plasma. Os anticorpos contra VDAC (ab34726, Cambridge, MA) e COXIV (ab124538, Abcam, Cambridge) foram utilizados para descartar contaminações provenientes de fracções de membrana mitocondrial. Os anticorpos contra GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge) foram utilizados para impedir a contaminação citoplasmática.

Preparação de vesículas de membrana de plasma rightside-out e resposta ácida

O método declarado aqui é um protótipo e mais do momento em que foi dimensionado de acordo com a necessidade do experimento. Tipicamente 150 ul de preparação da membrana plasmática foi diluída para 300 ul (depende da densidade da preparação de membrana) com tampão A contendo 0,5 mg /ml de BSA e em seguida, suspensa bem, aplicando 10 golpes com 1 ml de seringa com agulha de calibre 25. O volume final foi verificado e, se necessário, foi ajustado a 300 ul com o mesmo tampão. Nos passos seguintes, os ingredientes foram adicionados estritamente na ordem mencionada, considerando um volume final de 400 ul. Os ingredientes foram adicionados sequencialmente a uma concentração final como indicada: Hepes-MES (1: 1) pH 7,0 a 50 mM, KCl a 20 mM, fosfato de sódio a 1 mM, ouabaina a 0,2 mM, oligomicina 10 uM, bafilomicina a 200 nm , atractiloseo a 1 uM e BSA a 1 mg /ml. ADP ou outros ingredientes que precisavam de ser embalados em vesículas foram também adicionados se necessário. O pH foi então ajustado para 7,6 com 1 N hidróxido de sódio e confirmado pelo eléctrodo de pH. O volume foi verificado e, se necessário, foi ajustado com água para obter um volume final de 400 ul Após a adição de radioactividade. Este foi, em seguida, submetido a 10 cursos com 1 ml de seringa com agulha de calibre 25, antes da adição de radioactividade. 0,4 mCi /ml de

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I foi então adicionada e mantida em gelo durante 20 minutos, após o que foram aplicados 10 cursos com seringa. As vesículas foram agora selado pela seguinte sequência de passos. Relativamente solução espermina fresco foi adicionado a 1,6 mM, 10 cursos aplicado com a seringa, em seguida, MgCl

2 foi adicionado a 4 mM, mais 10 aplicadas pancadas com seringa e mantido em gelo durante 20 minutos. A isto foi adicionado a 10 uM valinomicina, mantidas em gelo durante 10 minutos, seguido por solução de CaCl

2 a 0,4 mM e incubado em gelo durante mais 10 minutos. Magnésio mais de 6 mM, espermina mais de 1 mM (final após diluição) e cálcio mais de 1 mM atividade inibida por isso o excesso de adição foi sempre evitado.

Ligação a ConA esferas.

300 ml de Con contas ( rad /GE Healthcare) foram lavadas duas vezes em 1 ml de tampão contendo 10 mM de Hepes-MES (1: 1) pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl 1 mM de

2, BSA a 0,25 mM (sem MnCl

2 foi adicionado). Após a última lavagem todo o líquido foi aspirado por pipetagem com pontas de carregamento de gel finas (que não permitem contas para chegar em) por imersão em profundidade as esferas. Este foi suspenso em 2 ml de tubo com 3 volumes de tampão de diluição (DB) no que diz respeito à preparação de vesículas, que neste caso seria de 1,2 ml. A composição da DB foi HEPES 50 mM-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM de NaCl, fosfato de sódio 1 mM, MgCl 4 mM de

2, CaCl 0,4 mM

2. Para a suspensão de esferas foi adicionado 400 ul de preparação de vesículas selado (de acima). Diluição de potássio nesta fase ajuda na ligação a contas de Con A, as quais são geralmente inibidos pelo teor elevado de potássio. O tubo foi selado com segurança e rodado gentilmente em frio durante 50 minutos para permitir a ligação sem danificar a membrana. As esferas foram lavadas 3 vezes com 3 volumes de tampão de lavagem a frio de gelo (WB) por centrifugação a 1500 rpm, 30 segundos. O tampão de lavagem continha 50 mM de Hepes-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM de NaCl, fosfato de sódio 1 mM, KCl 2 mM, MgCl 4 mM de

2, CaCl 0,4 mM

2, espermina 0,4 mM, 0,25 mg /ml de BSA ultra-pura, 0,1 mM de ouabaina, 2,5 uM oligomicina, 100 nM bafilomicina, 1 uM atractiloseo. Cada vez que todos os líquidos foram aspirados para fora da cama com finas pontas de carregamento de gel, mergulhando-o profundamente para dentro dos grânulos. Eficiência de lavagem foi marcada pela redução da radioatividade das esferas entre lavagem sucessiva usando contador Geiger. As pérolas foram então suspensas em cerca de 1 ml de tampão de lavagem, alíquotas de maneira uniforme até cerca de seis tubos (suspensão de 195 ul) e imediatamente utilizados para o ensaio de vesículas como detalhado abaixo.

grânulo vesícula ensaio ligado.

a suspensão de esferas foi incubada a 37 ° C durante 1 minuto e a ela adicionou medido quantidades de HCl 1 N para mudar o pH a valores desejados. Depois do intervalo de tempo desejado (5 segundos a 2 minutos), foi centrifugada durante 15 segundos a 1000 rpm e o sobrenadante foi removido rapidamente com pontas de carregamento de gel finas mergulhando-os em grânulos. 75 ul de mistura de clorofórmio metanol-2,5% foi então adicionada às esferas e agitadas. A isto foi adicionado 50 ul de tampão de extracção EB (1 mM de fosfato de potássio pH 6,5, EDTA 0,2 mM). A mistura foi, em seguida, mantidos em vibrador durante 30 minutos, centrifugada a 8000 rpm durante 10 minutos e a camada aquosa superior foi cuidadosamente retirado evitando usando clorofórmio finas pontas de carregamento de gel. As esferas foram re-extraída com mais 25 mL de EB, em vortex durante 5 minutos e centrifugação como anteriormente. As camadas aquosas a partir deste duas etapas foram reunidas e centrifugadas a 10000 rpm durante 1 minuto para precipitar os grânulos e a camada aquosa límpida foram retirados. Este foi, em seguida, mantida a -80 ° C. Para análise da amostra, aproximadamente 25-30 ul do extracto aquoso foram secas por Speed-Vac e analisado em TLC.

vesícula (IOV) ensaio

vesícula de membrana dentro para fora foram retirados em tampão contendo 10 mM de Hepes-MES-etilo (1,5: 1: 1) de pH 6,34, KCl a 2 mM, 150 mM de NaCl, 10 uM oligomicina e selado com MgCl 6 mM

2. Adicionou-se 10 uM valinomicina seguido por um quarto do volume do tampão anterior, mas contendo KCl a 150 mM em vez de NaCl.

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i (0,2-0,5 mM, 0,3 mCi /ml) e ADP (25 | iM, quando necessário), em seguida foram adicionados. Após breve alcalinização durante 90 segundos através da adição de alcali, 20 uM de pirofosfato, e /ou 20 fiM de ATP foram adicionados para diluir (protecção) os produtos radioactivos e agitadas com clorofórmio (contendo 2% de metanol). A camada aquosa foi analisada por TLC.

Preparação do extracto citosólico

(100 milhões de células /ml) foram deixadas inchar em K 2 mM de

2HPO

4 pH 7,4 durante 5 minutos após o que o tampão foi ajustado a 10 mM e NaCl a 100 mM. A isto foi adicionado dietilpirocarbonato a 1 mM, vanadato de 50 uM, 50 ^ M de pirofosfato e lisadas por passagem através de agulha de 25 gauge. Este foi centrifugado duas vezes a 13,000xg durante 15 minutos e em seguida, centrifugado a 74000xg durante 40 minutos ou sequencialmente passados ​​através de 0,65 uM, 0,22 uM e 0,11 uM coluna de membrana para remover as membranas. O teor de proteína foi de aproximadamente 3 mg /ml.

IOV e citosólica extrato combinação ensaio

citosol (5 ug de proteína) foi adicionado à mistura IOV contendo

32 P

i (0,2 mM , 0,3 mCi /ml) e ADP (100 uM) e alcalinizada rapidamente durante 10 segundos. A reacção foi extinta com dietilpirocarbonato 2 mM e 1/1000

th cocktail de inibidores de fosfatase B (Santa Cruz Biotech) e agitação em vórtex com clorofórmio (contendo 2% de metanol). A camada aquosa foi analisada por TLC.

Ensaio para a conversão de

32PP

i a ATP pela extracto citosólico

Os extractos citossólicos (2 ug de proteína) foi usada por cada 50 uL de reacção que continha Tris 10 mM, pH 7,5, NaH 1 mM de

2 PO?

4, NaCl 100 mM,

32PP

I (200 uM, 30 uCi /ml), MgCl 1 mM de

2 e 250 uM de ADP. As reacções foram arrefecidas com 1 mM de NHS-biotina (Pierce) e depois analisou-se por TLC.

Cromatografia em Camada Fina (TLC)

PEI-celulose placas de TLC de 250 um de espessura a partir de (JT Baker Inc.) foram usadas. As manchas foram desenvolvidos com 0,75 M KH

2 PO?

4, pH 3,5

Estatísticas

Todos os resultados apresentados como médias são apresentados como média ± 2.SD (SD:. Padrão desvio) a partir de três ou mais experiências independentes. Salvo disposição em contrário, os valores de p foram calculados pelo teste de Student de duas caudas:. (P 0,05 foi considerado como significativo)

Resultados

gradiente de ácido extracelular é crítico para altos níveis de ATP durante o aeróbio glicólise

Durante células cancerosas glicólise aeróbica consomem glicose para formar lactato com extrusão simultânea de ácido, que é reflectida pelo abaixamento do pH do meio externo [23]. Inicialmente, queríamos para investigar o papel crítico do gradiente de ácido na manutenção dos níveis de ATP durante a glicólise aeróbica. Concebemos um experimento para medir simultaneamente os níveis de ATP, lactato, glucose e o pH do meio externo em tempo real durante a glicólise aeróbica de células do cancro da mama altamente glicolíticas, MDA-MB-231 [24]. Nós também adicionamos 10 mM oligomicina, um inibidor da síntese de ATP mitocondrial genuíno, para eliminar qualquer contribuição de síntese de ATP mitocondrial. A glicólise foi iniciada pela adição de 0,1% de glucose. Alíquotas das suspensões de células foram retiradas a cada 5 minutos, adicionou-se com clorofórmio e imediatamente vortexadas para a lise eficaz das células e a inactivação das enzimas. A camada aquosa foi usado para a estimativa de metabolitos solúveis em água, como o ATP, glucose e lactato. Observou-se que a glucose foi consumida para formar lactato, houve uma diminuição constante no pH ao longo do tempo acompanhada por um aumento simultâneo nos níveis de estado estacionário de ATP nas células em relação ao valor de partida (Figura 1A). As células consumido glicose a uma taxa de 3,08 nmol /milhão de células /min (sd = ± 0,24, 7 conjuntos de dados) e produzido de lactato a uma taxa de 4,95 nmol /milhão de células /min (sd = ± 0,46, 7 conjuntos de dados ) (Figura 1B). Isto corresponde a quase 80,7% (D.P. = ± 8,78, 7 conjuntos de dados), a conversão de glicose em lactato sob esta condição, que é semelhante à observada por outros investigadores [25, 26]. Por outro lado, quando o ácido extrudido foi constantemente neutralizada pela adição de pequenas alíquotas de alcalino de modo a que o pH extracelular permaneceu constante em cerca de 7,4, os níveis de ATP não aumentou com o tempo em relação ao valor de partida (Figura 1C). No entanto, as taxas de consumo de glucose (3,46 nmol /min /milhão de células, sd = ± 0,17, 3 conjuntos de dados) e a produção de lactato (5,95 nmol /min /milhão de células, sd = ± 0,50, três conjuntos de dados) não exibiram alteração significativa (Figura 1D). Esta experiência indica que o gradiente de ácido extracelular desempenha um papel crítico durante a glicólise aeróbica, mesmo na manutenção de níveis elevados de ATP em células cancerosas. Isto encorajou-nos a investigar se o ácido extracelular gradiente sozinho pode conduzir a síntese de ATP em células de cancro, na ausência de qualquer glucose adicionada.

Para suspensões de células MDA-MB-231 em PBS-FBS a 10% contendo 10 uM oligomicina foi adicionada 0,1% de glicose sob agitação mecânica suave. O pH do meio (pH extracelular) foi monitorizada em tempo real enquanto o ATP, glucose e lactato foram medidos (por milhão de células) a partir de alíquotas recolhidas nos pontos de tempo indicados (barras de erro = 2.s.d., n = 3). (A) Firme ATP estado e extrusão de ácido (pH) durante a glicólise. Os valores de ATP aumentada continuamente em relação ao valor de partida com a redução gradual do pH do meio externo. (B) A glicose consumida (círculo aberto) e lactato produzido (círculo sólido) com o tempo para o experimento no painel A. (C) ATP estado estacionário em cima contínuo de neutralização do ácido. O ácido secretada foi continuamente neutralizada pela adição de pequenas alíquotas de álcali. Os valores de ATP permaneceu quase inalterada em relação ao valor inicial sob esta condição. (D) Glucose consumida (círculo aberto) e lactato produzido (círculo sólido) para o experimento no painel C. Estas experiências foram repetidas três vezes.

gradiente de ácido extracelular por si só é suficiente para conduzir a síntese de ATP em células cancerosas

Nós queríamos avaliar se gradiente de ácido extracelular por si só é suficiente para conduzir a síntese de ATP em câncer. A linha celular de cancro da mama MDA-MB-231 em tampão isento de glucose foi usado para padronizar o ensaio e para entender as características básicas da reacção. As células foram tomadas em tampão de suspensão livre de glucose e mantida a 37 ° C durante 20 minutos. Isto foi necessário para permitir que as células consomem glicose citosólica e para trazer os níveis basais de ATP para um estado constante durante o período das experiências. Eles foram, em seguida, acidificou-se e lisaram-se com clorofórmio, após o tempo indicado (5 segundos a 2 minutos). ATP produzido foi estimado a partir da camada aquosa por meio de ensaio de luciferase. Observou-se que a produção de ATP em resposta ao ácido extracelular foi rápido e robusto. concentração de ATP nas células aumentou rapidamente dentro de 20 segundos e atingiu um estado estacionário de 1 minuto e após a mudança do pH 7,5-7,0 (Fig 2A). A taxa de síntese de ATP calculado a partir dos primeiros 20 segundos foi de aproximadamente 1,5 nmoles /min /milhão de células. O aumento líquido de níveis de ATP no estado estacionário foi de cerca de 0,7 nmoles por milhão de células para este exemplo. Isto é equivalente a um aumento de 0,35 mM de ATP nas células [27]. Isto indica síntese substancialmente robusta de ATP, considerando que a concentração de estado estacionário de ATP nas células é de cerca de 1 mM. A pH 6,7, a taxa de síntese de ATP era demasiado rápida para monitorar com precisão, antes que atinge o estado estacionário. Foram monitoradas a quantidade de aumento ATP depois de 5 segundos da acidificação e estima uma taxa aproximada de cerca de 5,5 nmol /min /milhão de células (S.D. = ± 1,3, 3 conjuntos de dados). As células mantiveram a sua viabilidade e a integridade sob estas condições, tal como determinado por exclusão com azul de tripano. Quase todo o ATP produzido ( 98%) foi encontrada no pellet celular indicando produção intracelular de ATP exclusiva. Estas experiências confirmou que o ácido extracelular gradiente por si só é suficiente para dirigir a síntese de ATP em células cancerosas. de ruptura da membrana por congelação-descongelação, sonicação ou homogeneização mecânica também aboliu esta actividade, indicando que a membrana intacta era essencial para este fenómeno.

(A) Tempo cinética de produção de ATP, a pH 7,0. MDA-MB-231 (estado estacionário), a pH 7,5 em tampão isento de glucose, foram acidificados para pH 7,0 a 37 ° C durante o tempo indicado, extinguiu-se com clorofórmio e as quantidades de ATP foram determinados a partir da fracção aquosa. Os valores de ATP são por milhão de células (barras de erro = 2.s.d., n = 3). (B) Aumento dos níveis de estado estacionário do ATP com diminuição do pH extracelular. As suspensões de células (estado estacionário) a pH 7,5 em tampão sem glicose foram acidificadas para pH indicado durante 2 minutos a 37 ° C e extinguiu-se com clorofórmio. As quantidades de ATP nas células foram determinadas a partir da fracção aquosa. Aumento de ATP por milhão de células são mostradas (barras de erro = 2.s.d., n = 3). As escalas foram mantidas semelhantes para as células da mama MDA-MB-231 e MCF-10A, e para as células do pulmão A549 e Beas2 para comparação. A ordem da reacção (N) para esta experiência utilizando a equação de estado estacionário (ver métodos) é mostrado no suplemento (Fig S2). Os valores médios de n (inclinação) de múltiplos tais experiências são: MDA-MB 231, 0,89 (D.P. = ± 0,07, 7 conjuntos de dados); A549, 0,79 (D.P. = 0,06 ±, 4 conjuntos de dados) e PaCa-2, 2,12 (D.P. = ± 0,23, 6 conjuntos de dados). (C) a natureza reversível de gradiente de ácido formação de ATP dependente. suspensão de células MDA-MB-231 (estado estacionário), a pH 7,5 em tampão sem glicose foi acidificada de um modo passo a passo de pH 7,5-6,2 pela adição de pequenas ali quotas de ácido sob condições de agitação suave a 37 ° C. Em cada passo, o pH da suspensão de células foi notada e aliquotas foram retiradas após 2 minutos para a determinação de ATP (círculo sólido com linha a cheio). Depois de atingir um pH de 6,2, alíquotas de álcali foram adicionados de um modo passo a passo de trazer de volta o pH para 7,5 (círculo aberto e a linha pontilhada). O aumento nos níveis de ATP são por milhão de células (barras de erro = 2.sd, n = 3).

Seguindo estas experiências iniciais, o efeito do pH extracelular sobre os níveis de estado estacionário de ATP foi avaliado a pHs ‘medindo de 6,0 a 7,5. Foi utilizado um painel de linhas celulares de cancro agressivos obtidos a partir de diferentes tipos de tecidos, MDA-MB-231 (cancro da mama), A549 (cancro do pulmão) e MIA-PaCa-2 (cancro do pâncreas, doravante chamado PaCa-2), a fim de determinar a universalidade do fenômeno.

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