Abstract
Fundo
Gypenosides (Gyp), os principais componentes de
Gynostemma pentaphyllum
Makino, são amplamente utilizados na medicina tradicional chinesa. O presente estudo teve como objetivo investigar o efeito anti-câncer e os mecanismos subjacentes da Gyp sobre células de câncer colorretal humanos SW-480.
Materiais e Métodos
O efeito inibitório do Gyp no SW-480 células foi avaliada pelo ensaio de MTT. A morte celular apoptótica foi detectada por análise de coloração e fragmentação de ADN Hoechst 33342 nuclear. A apoptose foi analisada utilizando D coloração de anexina V-PE /7-amino-actinomicina. integridade da membrana celular foi avaliado com citometria de fluxo após coloração PI. Mudanças de potencial de membrana mitocondrial (
Δψ
m) foram detectados por citometria de fluxo análise da rodamina 123 (Rh123). O papel das espécies reactivas de oxigénio (ROS) na morte celular induzida Gyp foi investigada pela geração de ROS intracelular e limpador geral ROS. ensaio de cicatrização foi realizada para investigar a migração Gyp inibido de SW-480 células
in vitro
. Além disso, as alterações no microfilamentos F-actina foram analisados por FITC phalloidin coloração toxina e as alterações morfológicas foram avaliadas sob microscópio eletrônico de varredura (MEV).
Resultados
Depois do tratamento Gyp, observou-se a permeabilidade da membrana plasmática de células SW-480 foi aumentado,
Δψ
m foi reduzida significativamente, o nível de ROS nível intracelular foi aumentada, a fragmentação do ADN e morfologia apoptótica. As células tratadas com cigano exercer grave colapso rede de filamentos, bem como a redução significativa do número de microvilosidades. Gyp induzida as mudanças de viabilidade celular, migração celular, a geração de ROS intracelular e morfologia nuclear foram aliviados, obviamente, pelo NAC.
Conclusão
Os resultados deste estudo implicou que ROS desempenham um papel importante na Gyp toxicidade induzida celular e apoptose, e os danos mitocôndrias pode estar a montante da geração de ROS tratamento pós Gyp. Os resultados do presente estudo fornecem novas evidências para os mecanismos anti-tumorais pelo qual Gyp induz a apoptose
in vitro
Citation:. Yan H, Wang X, Niu J, Wang Y, Wang P , Liu Q (2014) efeito anti-câncer e os mecanismos subjacentes da Gypenosides sobre colorrectal humano Câncer SW-480 Cells. PLoS ONE 9 (4): e95609. doi: 10.1371 /journal.pone.0095609
editor: Nukhet Aykin-Burns, da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas; Faculdade de Farmácia, Estados Unidos da América
Recebido: 16 de dezembro de 2013; Aceito: 27 de março de 2014; Publicação: 21 de abril de 2014
Direitos de autor: © 2014 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Plano Nacional de “Twelfth Five-Year” para a Ciência e Tecnologia (2011BAI06B05). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte no mundo, com cerca de um milhão de novos casos e 500.000 mortes por CRC ao redor do mundo a cada ano [1], [2]. Há muitos fatores de risco para CRC, incluindo idade avançada, doenças inflamatórias intestinais, história médica de pólipos adenomatosos benignos, história familiar de CRC, baixa ingestão de frutas e legumes, alta ingestão de gordura animal e carnes processadas [3], [4] .
no tratamento clínico CRC, as terapias tradicionais, como radioterapia, quimioterapia e cirurgia não são o melhor método de cura para ela por causa de mau prognóstico e os efeitos colaterais graves. Portanto, em busca de terapias anti-tumorais novos é extremamente urgente. Agora, a medicina natural na terapia do câncer tem despertado grande preocupação no país e no exterior, devido à sua segurança, effiiciency e efeitos colaterais mínimos [5].
Gypenosides (Gyp), a medicina popular popular na China, é os principais componentes de extractos de
Gynostemma pentaphyllum
Makino. Ela existe principalmente como dammarane triterpene glicosídeos de tipo (Figura 1). GYP tinha sido conhecida pelos seus efeitos benéficos largamente para o tratamento de hepatite, hiperlipoproteinemia e doenças cardiovasculares [6] – [8]. Estudos têm mostrado que cigano tem uma actividade de acções anti-inflamatórias, anti-trombótico, antioxidantes e anti-cancro [9] – [12]. Mas, até agora, não há nenhum relatório sobre o efeito anti-tumoral induzida Gyp em cânceres colorretais humanos. Assim, no presente estudo, a citotoxicidade e apoptose das células SW-480 induzida por Gyp foram investigados. Papel das espécies reactivas de oxigénio (ROS) em morte celular induzida Gyp foi analisada pela geração de ROS intracelular e ROS limpador. Estes resultados podem fornecer evidências para o papel de Gyp como um agente anti-cancro colorectal potente na aplicação clínica.
Materiais e Métodos
produtos químicos e reagentes
Gyp foi gentilmente cedido pelo Ankang Pharmaceutical Institute da Universidade de Pequim. O pó foi dissolvido em 80% de etanol (EtOH) para obter uma solução stock de 100 mg /mL, a qual foi esterilizada por filtração de membrana de 0,22 um. 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltertrazolium brometo de tetrazólio (MTT), rodamina 123 (Rh123), Hoechst 33342, iodeto de propídio (PI) e N-acetilcisteína (NAC) foram adquiridos a partir de a Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EUA). 2 ‘, 7’- dichlorodihydrofluorescein-diacetato (DCFH-DA) e FITC-faloidina foram fornecidos pela Molecular Probes Inc. (Carlsbad, CA, EUA). Goiaba nexina Reagente foi obtido a partir de Millipore Corporation (Billerica, MA, EUA). Todos os outros reagentes eram produtos comerciais de grau analítico.
Cultura celular
As células do cancro do cólon SW-480 humanas foram obtidas a partir do banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China. A linha celular foi cultivada em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina (100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) e 1% de glutamina no frasco de cultura de células sob uma humidificada com 5% de CO
2 e 95% de ar a 37 ° C.
a avaliação da viabilidade das células após tratamento cigano
Para investigar o efeito de cigano na proliferação de células SW-480, as células foram semeadas em placas de 96 poços pratos. Várias concentrações (0, 70, 100 e 130 ug /ml; 80% de etanol foi usado como o controlo de solvente) de cigano foram adicionados e as células foram incubadas durante vários períodos de tempo, a uma densidade de 1 x 10
5 células /mL, respectivamente. A viabilidade celular foi determinada usando ensaio de MTT [13]. A absorvância a 570 nm foi registada usando um leitor de microplacas (Bio-Tek ELX800, EUA). A viabilidade das células de amostras de cigano tratada foi então obtido por meio da comparação com o controlo.
Análise por Citometria de Fluxo de Membrana Celular Integridade
PI é um corante de membrana fluorescente impermeante-que mancha os núcleos por intercalação entre as bases empilhadas do ácido nucleico. Desde PI entra na célula apenas se a membrana da célula se torna permeável, ele é amplamente utilizado em pesquisa morte celular para medir a integridade da membrana plasmática. Quando ligado a ácidos nucleicos, o máximo de absorção para o PI é 535 nm e a emissão de fluorescência máxima é 617 nm [14]. As células em placas de 24 poços foram tratadas com a concentração indicada de cigano para 6, 12, 24 e 48 h, respectivamente. Em seguida, as células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS, coradas com 5 ug /ml de PI durante 5 min no escuro e analisadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados usando FCS Expresso V3 (De Novo Software).
Exame de Membrana Mitocondrial Potencial (Δψ
m)
Para estudar o
Δψ
m muda, as células foram coradas com Rh123, que entra selectivamente mitocôndrias com uma membrana intacta e potencial é retido no mitocondrial [15]. Uma vez que o potencial de membrana mitocondrial é perdido, Rh123 é subsequentemente lavada para fora das células. As células em placas de 24 poços foram tratadas com a concentração indicada de cigano durante 4 e 8 h. As células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 500 ul de 1 jag /ml de Rh123 e incubou-se a 37 ° C durante 30 min no escuro. As amostras foram, então, imediatamente detectada por citometria de fluxo. Os dados foram analisados usando FCS Expresso V3 (De Novo Software).
Citometria de Fluxo de Análise de DNA fragmentação
Para analisar a fragmentação do DNA, o fluxo de detecção de citometria de hypoploidy DNA após a adição de PI para as células morrem e permeabilização-los por congelação-descongelação foi realizado [14]. O tamanho dos fragmentos de DNA aparece como um histograma de ADN hipoplóides. Para investigar o efeito de cigano em danos no ADN de células SW-480, foi realizada a fragmentação do ADN oligonucleosomal por citometria de fluxo. As células em placas de 24 poços foram tratadas com várias concentrações de cigano para 6, 12, 24 e 48 h, respectivamente. As células foram então coradas com 5 ug /ml de PI e analisadas quanto ao teor de ADN por citometria de fluxo.
Hoechst 33342 Coloração
A fim de observar as mudanças de morfologia de núcleos de células de tumor após tratamento cigano, foi utilizada a coloração Hoechst 33342. Após o tratamento com a concentração indicada de cigano para 6, 24 e 48 h, as células foram coradas por 10 uM Hoechst 33342 durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, as células marcadas foram lavadas três vezes com PBS e observadas utilizando um microscópio de fluorescência com filtros de excitação padrão. O comprimento de onda de excitação e comprimento de onda de emissão eram 346 nm e 460 nm, respectivamente.
Análise de Apoptose celular
apoptose celular foi detectado após o tratamento com a concentração indicada de cigano durante 12 e 24 h. A quantificação da apoptose das células foi medido pelo ensaio de goiaba nexina, que utiliza anexina V-PE para detectar a fosfatidilserina na membrana externa das células apoptóticas. O corante de membrana-impermeabilizante, D-7-amino actinomicina, também é utilizada como um indicador da integridade da membrana celular. Resumidamente, 100 células L de cada amostra foi suspensa numa mistura de 100 ul de Anexina V-PE e tampão de ligação 7-ADD. Após incubação à temperatura ambiente durante 20 min, as amostras foram analisadas por citometria de fluxo. A população foi dividida em três grupos: as células vivas com fluorescência de baixo nível, as células em apoptose em fases anteriores com fluorescência verde, e as células em apoptose final com ambos fluorescência vermelha e verde
Cicatrização Ensaio
.
As células foram semeadas em placas de 24 poços e incubou-se 24 h. Em seguida, as células em poços individuais foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta e tratou-se com a concentração indicada de cigano. Após 24 horas de incubação, as células foram fotografadas por microscopia de contraste de fase.
microfilamentos Análise
Após tratamento diferente, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 minutos a 37 ° C. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 7 min e bloqueadas com BSA a 1% em PBS durante 1 h a 37 ° C. Entre cada passo descrito acima, as células foram lavadas três vezes com PBS durante 5 minutos a 37 ° C. células de bloqueio se seguiram foram coradas com 5 ug /ml de FITC-faloidina durante 1 h a 37 ° C no escuro. As imagens foram obtidas por uma varredura a laser microscópio confocal (TCS SP5, Leica, Alemanha).
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) Observação
Depois de 24 h após vários tratamentos, as células em cada grupo foram fixados em solução tampão fosfato 2,5% de glutaraldeído, lavadas com PBS e desidratado pelo álcool classificado, ponto crítico-seco do CO líquido
2 e ouro atomizados. As superfícies das células foram observadas por microscopia eletrônica de varredura (S-3400N, Hitachi, Japão).
Detecção de intracelulares Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) Geração e Seu Papel na Gyp causou citotoxicidade
a fim de determinar mudanças no nível de ROS, medimos a conversão oxidativa da sonda fluorescente sensível 2 ‘, 7′-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-dA) a fluorescente 2′, 7’-diclorofluoresceína (DCF). DCFH-DA facilmente se difunde através da membrana da célula e é hidrolisada enzimaticamente por esterases intracelulares para formar DCFH não fluorescente, o qual é, em seguida, rapidamente oxidado para formar DCF altamente fluorescente na presença de ROS, e a intensidade de fluorescência é proporcional a produção de ROS. As células em placas de 24 poços foram tratadas com a concentração indicada de cigano durante 4 e 8 h. As células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 500 ul de 10 mM DCFH-DA e incubou-se a 37 ° C durante 30 min no escuro. As amostras foram, então, imediatamente detectada por citometria de fluxo. Os dados foram analisados usando FCS expresso V3 (De Novo Software).
Para investigar o papel das ROS na morte celular induzida cigano e apoptose, NAC (5 mM) foi utilizado como um inibidor de ROS adicionado ao meio de cultura antes de carregar Gyp por 1 h. A diminuição da viabilidade celular, a geração de ROS intracelular, o
Δψ
perda de m, as alterações morfológicas nucleares e de inibição da migração celular foram especialmente analisados como descrito acima.
Análise Estatística
Os dados são expressos como média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada por análise de uma via de variância. A significância estatística foi estabelecido em
p
. 0,05
Resultados
Efeitos do Gyp no celular Viabilidade
Figura 2 mostrou que Gyp inibida SW-480 proliferação celular de um modo dose e dependente do tempo. A viabilidade foi significativamente reduzida quando a dose cigano foi de 70 ug /mL ou acima (
P
0,01) e a incubação prolongada aumentou a perda de viabilidade. Os valores de IC50 foram cerca de 91,77 e 83,8 ug /ml quando as células foram incubadas com cigano durante 24 e 48 h, respectivamente.
SW-480 foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com 0, 70, 100 e 130 ug /ml de cigano para 24 e 48 h. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Cada valor é expresso como uma média ± S.D. de, pelo menos, três determinações independentes. One-way ANOVA foi utilizado para comparações de grupo múltipla significa seguido pelo teste t de Dunnett. **
P Art 0,01 versus o controlo. (Barras de erro = SD, n = 3).
induzida por Gyp Plasma Membrane danos de SW-480 Cells
coloração PI combinado com citometria de fluxo foi utilizada para avaliar Gyp induzida por danos da membrana celular. Em SW-480 células, danos na membrana como um acontecimento precoce da lesão celular induzida cigano (Figura 3). Após incubação durante 6 h, a percentagem de células com fluorescência de PI superior gradualmente aumentado de 10.07% para 21.93% quando as células foram expostas a gama de dose cigano 70-130 ug /ml. As células expostas a 70 ug /ml de cigano não mostraram aumento muito dano da membrana celular com o tempo de incubação prolongado. Enquanto as células após /ml tratamento cigano 100 ug /ml e 130 ug, os danos da membrana celular foi grandemente aumentado pelo tempo de incubação prolongado, cerca de 46,27% e 67,87% de células exibido alta fluorescência de PI em 48 h após o tratamento, respectivamente.
as células foram tratadas com Gyp para 6, 12, 24 e 48 (eixo vertical) versus fluorescência de PI (eixo horizontal).
o Δψ
m Perda de induzida por Gyp SW-480 Cells
coloração Rh123 combinado com citometria de fluxo foi utilizada para avaliar Gyp induzida por
Δψ
m muda. Como mostrado na Figura 4, que mostra que a perda induzida cigano de
Δψ
m bastante cedo e causou a redução de
Δψ
m de uma dose e tempo- forma dependente. Após 4 h de incubação, a percentagem de células com
Δψ
perda m aumentou de 9,9% para 28,8% quando cigano aumentou de 70 ug /ml a 130 ug /ml. Quando o tempo de incubação um aumento de 4 a 8 h, a percentagem de células com
Δψ
m perda aumentada de 16,65% a 20,95%, quando cigano foi de 100 ug /ml.
Células foram tratados com cigano durante 4, 8 h e marcadas com rodamina 123 e analisadas por citometria de fluxo. Os histogramas mostram número de canal de Cell (eixo vertical) vs. rodamina 123 fluorescência (eixo horizontal).
induzida por Gyp DNA Fragmentação do SW-480 Cells
Para determinar o DNA danificando actividade de cigano, a percentagem de células danificadas foi analisada utilizando a coloração de PI por citometria de fluxo, tal como descrito nos métodos. Como mostrado na Figura 5, cigano fragmentação de ADN induzida foi de uma maneira dose e dependente do tempo. Nenhuma fragmentação de ADN significativa foi detectada por dose diferente de cigano após tratamento de 6 h, enquanto que uma quantidade significativa de fragmentação do DNA em larga escala foi observada pela dose mais elevada cigano (100, 130 ug /ml) após 12 h de incubação, e o DNA danos na dose de cigano inferior (70 ug /ml) células tratadas não reforçada com o tempo de incubação prolongado. Após 48 h de incubação, o fragmento de ADN de grupo de controlo é 2,37%, aumentou para 10,03%, 26,33% e 56,07% quando cigano concertration foi de 70, 100 e 130 ug /ml, respectivamente.
Células eram tratadas com Gyp para 6, 12, 24 e 48 (eixo vertical) versus fluorescência de PI (eixo horizontal).
induzida por Gyp alterações morfológicas de SW-480 Cells
Figura 6 mostraram os resultados de Hoechst 33342 coloração em SW-480 células tratadas por Gyp. Ligeiramente foi observada celular azul e homogênea no grupo controle. As células nos grupos tratados cigano mostraram aumento da coloração de Hoechst 33342 e as alterações da morfologia celular em um cigano-dose e o modo dependente do tempo de incubação. Quando a concentração Gyp estava acima de 100 mg /ml, células SW-480 foram seriamente danificada com coloração nuclear azul brilhante e as imagens de fase células indicadas foram encolhidos para tipo redondo anormal, e o número de células diminuiu significativamente.
Células foram tratados com Gyp nas concentrações indicadas para 6, 24, 48 “Materiais e métodos”.
Detecção de celular apoptose por citometria de fluxo
as taxas apoptóticos foram medidos por anexina V -PE e 7-ADD coloração após 12,24 h seguintes vários tratamentos. As fracções de células em cada quadrante foram analisadas pela estatística quadrante [16]. Como mostrado na Figura 7, as percentagens de células com coloração de anexina V-positivas aumentou gradualmente de uma forma dependente da concentração, após tratamento cigano, sugerindo que poderia induzir cigano resposta apoptótica em células SW-480. No grupo de controlo não tratada, 94,85% das células eram viáveis, 1,45 população de células% estava na fase inicial da apoptose (inferior direito) e população de células 2,95% estava na fase tardia da apoptose (canto superior direito). Enquanto, após 12 h de incubação com cigano, a população de células apoptóticas (inferior direito + direito superior) aumentou de 25,40% para 38,70% quando a concentração do fármaco aumentou de 70 ug /ml a 130 ug /ml. Quando o tempo de incubação aumentou de 12 a 24 h, a população celular por apoptose aumentou de 29,45% a 41,70%, quando cigano foi de 100 ug /ml.
Concentrações
Os gráficos de pontos de Anexina V e 7-AAD absorção após indicados em células SW-480. As células foram analisadas em 12, 24 h após o tratamento.
Gyp inibiu a migração de SW-480 In vitro
Para verificar ainda mais o efeito inibitório do Gyp na migração de células SW-480, uma ferida cura ensaio foi realizado (Figura 8). A capacidade de cicatrização de feridas de células reflecte o seu movimento e migração sobre a superfície na qual eles estão ancoradas para o crescimento. Comparado com 0 h após o ferimento, após 24 h de incubação, as células muito densas no controle cresceu gradualmente ao espaço intercalar da ferida, as células em 70 ug /ml Gyp grupo tratado mostrou ligeira diferença com a diferença de controle com controle, enquanto as células em 100 ug /e /ml Gyp grupos tratados ml 130 ug raramente cresceu para o espaço intermédio da ferida, e a densidade celular foi seriamente diminuída.
as células em placas de 24 poços foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta e as células foram incubadas com cigano durante 24 horas. As células foram fotografados sob microscopia de contraste de fase (200 × ampliação).
Análise microfilamentos
Está bem estabelecido que os elementos do citoesqueleto foram intimamente relacionado com a movimentação das células [17], [ ,,,0],18]. As mudanças de organização F-actina em microfilamentos SW-480 células depois tratados cigano foi investigada por microscopia de fluorescência utilizando FITC-faloidina etiquetada toxina. Como mostrado na Figura 9, as células de controlo apresentaram uma matriz regular de filamentos de actina definidos presentes ao longo das células, uniformemente distribuídos no citoplasma, enquanto que as células em 100 ug /cigano ml mostrou uma desorganização de filamentos de actina, um aumento de fibras de actina stree e verde foram observadas manchas de fluorescência. As células tratadas com 130 ug /ml Gyp demonstrado um dano absoluto de rede de actina e desaparecimento completo dos filamentos de actina.
As células foram coradas com faloidina (verde) para a F-actina. Barras de escala, 10 ^ m.
SEM Observação
As alterações morfológicas foram observadas em SEM (Figura 10). No grupo de controlo, as células epiteliais apareceu na forma com numerosas microvilosidades sobre a superfície da célula. Enquanto em 70 ug /ml, as células mostraram uma diminuição significativa no número de microvilosidades, a superfície de muitas células tornando-se relativamente lisa sem microvilosidades óbvia. Quando a dose Gyp estava acima de 100 mg /ml, células SW-480 foram seriamente danificada com a deformação aparente, encolhido ao tipo de rodada anormal, e o número de células diminuiu significativamente. Enquanto em 130 ug /mL, algumas protuberâncias papiloso foram observadas na superfície das células, onde o citoplasma parecia ter extrudida através da membrana limite.
ampliação das imagens foi de 1500 e 5000 ×, respectivamente. Barras de escala:. 30, 10 m
ROS envolvidos na induzida Gyp SW-480 citotoxicidade
A produção ROS intracelular foi analisada por citometria de fluxo com coloração DCFH-DA. Os dados mostrados na Figura 11, sugerem a intracelular níveis de ROS foi aumentada após o tratamento cigano, a 4 h após o tratamento, havia cerca de 13,97%, 21% e 13,07% de células em 70, 100 e 130 ug /grupos tratados Gyp ml mostrou brilhante DCF fluorescência, enquanto que apenas 5,43% das células no grupo controle apresentou brilhante fluorescência DCF. Quando o tempo de incubação aumentou de 4 a 8 h, a percentagem de células com fluorescência brilhante DCF aumentada para 29,77%, 35,97% e 33,43%, quando cigano foi de 70, 100 e 130 ug /ml, respectivamente. Encontramos a geração de ROS foi aumentado pela primeira vez com o aumento da concentração Gyp e, em seguida, diminuiu ligeiramente na dose Gyp muito maior, o que pode ser devido a mais lise celular causada pelo tratamento Gyp na concentração de fármaco mais elevada.
As células foram tratadas com Gyp para 4, a intensidade de fluorescência do produto oxidado DCF em células individuais de 8-dA e foi detectada por citometria de fluxo. A percentagem de células fluorescentes em cada grupo foi mostrado.
Para examinar ainda mais se a elevação ROS intracelular foi envolvido na morte celular induzida Gyp, foram realizados ensaios subsequentes. O resultado na Figura 12A mostra que a viabilidade celular diminuiu causada por cigano foi grandemente resgatado por NAC (
P
0,05). Além disso, a produção de ROS provocou cigano intracelular, condensação da cromatina e de inibição da migração de células foram todas visivelmente impedido por NAC (Figura 12B-D). No entanto, a diminuição da
Δψ
m causada por Gyp não foi impedido pelo NAC (Figura 12E). Estes resultados indicam que ROS estava envolvido em dano induzido Gyp no SW-480 células e
Δψ
perda de m pode ser um importante activador a montante da geração de ROS, eo aumento da ROS pode ser estimulada pela mitocôndrias danificadas.
migração de células
(A) A viabilidade celular, (B) intracelular geração de ROS, alterações morfológicas (C) nucleares, (D), (E)
Δψ
perda de m foram especialmente analisados conforme descrito em “Materiais e métodos”.
Discussão
o cancro é uma doença complexa e as terapias de câncer tradicionais não têm progredido significativamente nos últimos anos. As principais limitações da cirurgia, quimioterapia e radioterapia são que causam efeitos colaterais graves e prognóstico pobre devido à toxicidade do tecido não canceroso e quimiorresistência [19]. No entanto, a medicina natural tem suscitado grande preocupação na área da quimioterapia do câncer por causa da segurança, eficácia e resistência anti-multidroga.
Gyp tem sido usado como medicina tradicional chinesa para centenas de anos por causa de sua variedade de saúde benefícios [20] – [22]. No presente estudo, Gyp induzida apoptose em SW-480 células humanas de cancro colorectal foi investigada.
Os resultados mostraram que Gyp diminuiu a percentagem de células viáveis em células SW-480. Enquanto isso, estudos anteriores demonstraram que o efeito citotóxico do cigano em células PBMC normais era muito menos [23]. Os resultados sugerem que cigano é capaz de exercer citotoxicidade alternativa diferente em células cancerosas e células normais, o que pode ser potencialmente útil como um agente de prevenção ou tratamento do cancro.
A linha de células SW-480, estabelecida a partir do adenocarcinoma primário produzidos no cólon, foi de Duck estágio B (Dukes B significa que o câncer tem crescido através da camada muscular do cólon ou do recto, invadiu através da parede tigela, mas os linfonodos claras) [24]. Spread é através invasão local através da parede do recipiente e via linfáticos locais, sangue (veia porta para o fígado) e transcoelomic. Portanto, a metástase é um dos principais desafios para um tratamento bem sucedido do cancro [25] e a prevenção de metástases de cancro alvo é tão importante para melhorar o prognóstico do paciente. Neste estudo, investigou-se cigano poderia inibir a migração de células SW-480. Os resultados na Figura 8 sugerido cigano inibiu a migração do tipo celular de uma forma dependente da dose cigano. O citoesqueleto de actina é uma rede estrutural de proteínas que são essenciais para várias funções biológicas, incluindo a contracção celular, a mobilidade celular e o tráfico de vesículas et al [26], [27]. As mudanças em compartimentos celulares podem afectar as dinâmicas da adesão celular [18]. Figura 9 expostas as mudanças de microfilamentos, arranjo desordenado de desaparecimento F-actina e completa da rede de filamentos foi observada em 100, 130 ug /ml de cigano. Além disso, como se mostra na figura 10, o número de microvilosidades foi significativamente reduzida quando a dose cigano foi de 70 ug /mL ou acima. Os resultados sugerem Gyp induzir o colapso da rede microfilament, e, eventualmente, ferir a forma celular e capacidade de migração.
A apoptose desempenha um papel importante na homeostase e pode ser induzida e regulada por muitas vias de estímulo do sinal [28], [29 ]. A desregulação da apoptose é considerada como um importante característica do cancro, de modo a que a indução de apoptose é sem dúvida o mais potente defesa contra o cancro [30], [31]. Muitos estudos têm revelado que vários compostos extraídos de plantas pode induzir a apoptose em muitas células de cancro [29], [32], [33]. fragmentação do DNA e algumas características morfológicas, incluindo formação de bolhas de membrana, encolhimento celular, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos são característica bioquímica típica da apoptose [34], [35]. No presente estudo, Gyp foi capaz de causar fragmentação do DNA óbvio em SW-480 células de uma maneira dose e tempo-dependente. Além disso, Hoechst 33342 ensaio de coloração exibidas algumas características morfológicas após o tratamento Gyp tais como encolhimento celular, condensação da cromatina com marginação da cromatina à membrana nuclear e pontuada fragmentada fluorescência nuclear azul em células SW-480. Finalmente, a figura 7 sugerem a cigano poderia aumentar significativamente as células apoptóticas e diminuir as células viáveis, indicando a resposta apoptótica foi acentuadamente potenciada após cigano em células SW-480. Portanto, os resultados indicam Gyp poderia induzir a apoptose em células SW480.
O dano do sistema de membrana da célula fará com que a despolarização da membrana, disturbe assimetria de lípidos da membrana, induzir a inibição de enzimas de membrana, causar a perda da integridade da membrana plasmática [36 ], e estas funções celulares pode eventualmente induzir a apoptose das células por o acoplamento de receptores de morte [37]. A coloração com PI e analisadas por citometria de fluxo demonstrou que cigano causado dano da membrana celular foi um evento precoce. Especula-se que o mecanismo de Gypenosides em dano da membrana plasmática, talvez devido às agliconas das Gypenosides [38] tem o seu local de acção sobre a membrana celular, membrana celular desse modo danificar ou células que entram para prevenir o crescimento do tumor.
A mitocôndrias desempenham um papel importante na progressão da apoptose [39]. Portanto, as mitocôndrias membrana mudanças potenciais após a concentração diferente de tratamento Gyp em células SW-480 foi medida. No estudo, a redução de
Δψ
m foi no início de 4 h após o tratamento cigano e aumentada por aumento da concentração de cigano, sugerindo cigano apoptose celular induzida em células SW-480 pode ser mitocôndrias dependentes.
Além disso, o aumento da produção de ROS tem sido associada com a resposta apoptótica induzida por vários compostos de pró-apoptóticos [40]. Nossos resultados mostraram tratamento Gyp estimulou significativamente a produção de ROS em células SW-480. NAC, um sequestrante de ROS, foi utilizada para confirmar o efeito de ROS cigano após o tratamento. NAC resgatado significativamente induzida Gyp citotoxicidade SW-480, a geração de ROS intracelular, alterações morfológicas nucleares e de inibição da migração celular, mas não o
Δψ
m diminuição, o que implica ROS desempenhou um papel importante na Gyp induzida SW-480 toxicidade celular e apoptose celular, e a geração de ROS foi jusante de dano mitocôndrias tratamento pós Gyp, eo aumento da produção de ROS pode ser estimular pelas mitocôndrias danificadas em nosso sistema experimental.
em conclusão, o presente estudo avaliou a citotoxicidade de Gyp no SW-480 células, demonstraram que Gyp pode causar danos a integridade da membrana celular, diminuir o
Δψ
nível m, induzir a fragmentação do DNA e iniciar a resposta apoptótica em células SW-480. ROS gerado em SW-480 células desempenham um papel importante na morte celular induzida cigano. E, especula-se que a apoptose induzida cigano celular em células SW-480 pode ser a morte receptores nas vias e nas mitocôndrias dependentes. Além disso, o nosso estudo mostrou também que cigano poderia exercer um efeito inibidor sobre a migração de células
In vitro
e grave colapso rede de filamentos, bem como a redução significativa do número de microvilosidades. Estes resultados sugerem Gyp induzir o colapso da rede microfilament e ferir a forma celular e capacidade de migração. Estes estudos sugerem Gyp pode ter grande valor em tratamentos contra o cancro colorectal humanos. Investigações adicionais são necessárias para explicar os mecanismos moleculares de Gyp na terapia do cancro.