Abstract
Fundo
Vários tratamentos no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) são dependentes da histologia, e a necessidade de marcadores relacionados com a histologia está aumentando. Os microRNAs (miRNAs) são marcadores moleculares promissores em vários tipos de câncer e mostrar diferenças na expressão dependendo subtipo histológico. A família miRNA miR-200 tem sido associada com a regulação do epitélio-mesenquimal (EMT) /mesenquimal-epitelial (MET). EMT envolve profundas alterações fenotípicas que incluem a perda de adesão célula-célula, a perda da polaridade celular, e a aquisição de propriedades migratórias e invasivos que facilita a metástase. Uma função dupla para a família de miR-200 no prognóstico de vários tumores tem sido relacionada com origem nas células de tumor. No entanto, o papel prognóstico e função de miR-200 família em início de carreira adenocarcinoma NSCLC e carcinoma de células escamosas (SCC) não foram bem estabelecidos.
Métodos
expressão miRNA foi determinada utilizando TaqMan ensaios em 155 tumores de doentes com NSCLC ressecado. Estudos funcionais foram realizados em três linhas de células NSCLC:. H23, A-549 e HCC-44
Resultados
High miR-200c expressão foi associada com menor sobrevida global (OS) em todo o coorte (p = 0,024). miR-200c alta (p = 0,0004) e expressão de miR-141 (p = 0,009) correlacionado com menor SO no adenocarcinoma – mas não em CEC. Na análise multivariada, um escore de risco com base em miR-141 e expressão de miR-200c emergiu como um fator prognóstico independente para OS em toda a coorte (OR, 2,787; p = 0,033) e em doentes de adenocarcinoma (OR, 10,649; p = 0,002). análises funcionais mostraram que miR-200c, foi relacionada com a transição mesenquimal-epitelial (MET) e níveis de migração celular e E-caderina afetadas, enquanto que a sobre-expressão de miR-141 reduzida
os níveis de proteína KLF6 Comprar e produziu um aumento da secreção de
VEGFA in vitro
(H23, p = 0,04; a-549, p = 0,03; HCC-44, p = 0,02) e foi associada a uma maior densidade do sangue de microvasos em amostras de tumor de pacientes (p 0,001) .
Conclusão
High miR-141 e expressão de miR-200c estão associados com menor OS em pacientes com NSCLC com adenocarcinoma através de MET e angiogênese
Citation:. Tejero R, Navarro Um, Campayo H, Viñolas N, Marrades RM, Cordeiro A, et al. (2014) miR-141 e miR-200c como marcadores de sobrevida global em início de carreira não-pequenas células do cancro do pulmão Adenocarcinoma. PLoS ONE 9 (7): e101899. doi: 10.1371 /journal.pone.0101899
editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 28 de fevereiro, 2014; Aceito: 12 de junho de 2014; Publicação: 08 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Tejero et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0900547), SDCSD da Universidade de Barcelona e AECC-Catalunya 2013. Rut Tejero, Anna Cordeiro, Marc Ruiz-Martinez são bolsistas APIF de Universidade de Barcelona. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer, com mais de 226.000 novos casos nos Estados Unidos em 2012 [1]. Oitenta por cento dos cancros do pulmão são o câncer de células não pequenas-pulmão (NSCLC) [2], que tem uma sobrevida de apenas 10% do total e 60-70% em 5 anos dos pacientes em estágio I, destacando a necessidade de novos diagnósticos e terapêuticos estratégias. A ressecção cirúrgica, quando possível, continua a ser o único tratamento curativo para início de carreira NSCLC. No entanto, quase 50% dos pacientes ressecados experimentar recorrência e tem um prognóstico sombrio [2]. Vários novos tratamentos em NSCLC são dependentes da histologia, e carcinoma de células escamosas (SCC) responde pouco diferente do que o adenocarcinoma de certos regimes de tratamento [3], [4] [5]. No entanto, alguns biomarcadores de prognóstico dependente de histologia estão disponíveis para uso rotineiro na prática clínica, especialmente em pacientes operados.
Nos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram marcadores moleculares como promissoras em vários cancros, incluindo NSCLC [6 ]. miARNs específicos têm sido descritos como marcadores de prognóstico específico para SCC-histologia (miR-146b e miR-155) [7] ou o adenocarcinoma (miR-21) [8].
A família de miR-200 é composto de cinco membros localizados em dois grupos distintos: o miR-200a, 200b de miR-429 e miR-compreendem um conjunto (cromossoma 1), e miR-200c e miR-141 compreendem o grupo 2 (cromossoma 12). Todos os cinco miRNAs têm sido associados com a regulação do epitélio-mesenquimal (EMT) /mesenquimal-epitelial (MET) [9]. EMT envolve profundas alterações fenotípicas que incluem a perda de adesão célula-célula, a perda da polaridade celular, e a aquisição de propriedades migratórias e invasivos [10]. Este processo é fundamental para o desenvolvimento embrionário e está também envolvida na invasão tumoral e metástase [11]. O ato família miR-200 por meio de sua metas ZEB1 e ZEB2 [9] e TGF-β2 [12]. Os miARNs são assim capazes de aplicar o fenótipo epitelial através da repressão pós-transcricional destes genes, permitindo a expressão de E-caderina e da polaridade factores necessários para a formação de junções de célula-célula. A família miR-200 parece ter um duplo papel no prognóstico do paciente. A sobre-expressão da família de miR-200 actua como um marcador de melhor resultado em cancros gástricos e do ovário [13], [14], [15]. No cancro da mama [16] e NSCLC [17] Em contraste, a expressão elevada da família de miR-200 está associada com a sobrevivência mais curto. No cancro da mama, a família de miR-200 promove a metástase através de um mecanismo de não-E-caderina-relacionada, a segmentação
SEC23A
, que medeia a secreção de proteínas metástases-supressora [16]. No entanto, o papel dos altos níveis de miR-200 em NSCLC ainda não foi elucidado.
No presente trabalho, analisamos o papel dos membros da família miR-200 em tumores de pacientes com NSCLC ressecados e correlacionados nossos achados com a sobrevida global (oS) após a cirurgia, tanto em toda a coorte e de acordo com os subtipos histológicos. Além disso, estudamos as implicações funcionais dos marcadores prognósticos em linhas celulares de NSCLC.
Resultados
Os pacientes
A tabela 1 mostra as principais características clínicas para todos os 155 pacientes. A idade média foi de 65 anos (variação, 35-85) e 87% eram do sexo masculino. Vinte e um (13,6%) pacientes tinham status de Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) desempenho (PS) 0, e 132 (85,2%) tinham PS 1. Noventa e quatro (60,6%) pacientes tinham doença em estágio I. Setenta e três (47,1%) pacientes apresentavam adenocarcinoma e 70 (45,1%) SCC. Cento e trinta e oito (89%) pacientes eram fumantes atuais ou antigos. Vinte (12,9%) pacientes receberam quimioterapia adjuvante (16 para a fase II ou III da doença e quatro para doença em estágio I com T 4 cm). Acompanhamento médio foi de 43 meses (variação, 2-160). Após um seguimento de 160 meses, 70 (45,2%) pacientes tiveram uma recaída.
miR-200 expressão família e características clínicas
amostras de tumores emparelhados e tecido normal foram obtidos a partir de 155 pacientes com NSCLC. Os cinco membros de miR-200 encontram-se em dois grupos: o miR-200a /b, e miR-429 (grupo 1) e miR-200c e miR-141 (grupo 2). Todos os membros da família de miR-200, com excepção de miR-141, foram regulados negativamente em tumores em comparação com o tecido normal (miR-200a, p = 0,043; miR-200b, p 0,001; miR-429, P = 0,003; miR-200c , p. 0,001) (Figura S1)
os pacientes com PS 1-2 apresentaram maiores níveis de miR-429 (p = 0,039) do que aqueles com PS 0. os fumantes tinham níveis mais baixos de miR-200a ( p = 0,027) e miR-429 (p = 0,032) do que nunca fumaram ou ex-fumantes.
miR-141 e miR-200c como marcadores de oS
Usando os pontos de corte definidos pela Maxstat pacote de R, nos pacientes classificados como tendo níveis elevados ou baixos de expressão dos cinco miARNs. Entre os 155 doentes em todo o grupo, aqueles com níveis elevados de miR-200c mostrou um sistema operacional mais curta (p = 0,024; Figura 1A). Entre os 94 pacientes com doença em estágio I, altos níveis de miR-200c (p = 0,019; Figura 1B) e miR-141 (p = 0,03; Figura 1C) foram ambos associados com menor OS. Não houve diferenças significativas na OS foram identificados de acordo com os níveis dos miRNAs restantes expressão
OS acordo com (a) os níveis de expressão de miR-200c em toda a coorte (N = 155).; (B) os níveis de expressão de miR-200 ° C na fase I dos pacientes (n = 94); e (C) miR-141 níveis de expressão em fase I pacientes (N = 94).
miR-141 e miR-200c no adenocarcinoma
Não houve diferença na OS foram observadas de acordo para os níveis de qualquer um de miR-141 ou miR-200c em pacientes com CEC (Figura 2A e 2B) de expressão. No entanto, entre os pacientes com adenocarcinoma, os miARNs identificados dois grupos bem diferenciados. A média de OS para pacientes de adenocarcinoma com alta expressão de miR-200c foi de 61,2 meses (IC95% = 42,9-79,5), enquanto ele foi de 145,5 meses (IC 95% = 134,4-156,6) para aqueles com níveis baixos (P 0,001; Figura 2C ). A média de OS para pacientes de adenocarcinoma com alta expressão de miR-141 foi de 71,7 meses (IC95% = 44,9-81,6), enquanto era 136,9 meses (IC 95% = 110,9-1.162,9) para aqueles com níveis baixos (p = 0,009; Figura 2D )
a sobrevida global de acordo com (a) os níveis de expressão de miR-200c em pacientes com CEC (n = 70).; (B) os níveis de expressão de miR-141 em pacientes com CEC (N = 70); (C) os níveis de expressão de miR-200c em pacientes com adenocarcinoma (n = 73); e os níveis de miR-141 expressão em pacientes com adenocarcinoma (n = 73) (D).
Em seguida, analisamos o efeito combinatório de miR-141 e miR-200c, gerando um escore de risco com base na expressão níveis de ambos os miARNs. Pacientes com níveis elevados de ambos os miRNAs foram classificados como de alto risco, aqueles com níveis baixos de ambos os miRNAs como de baixo risco, e aqueles com outras combinações como de risco intermediário. Cinco anos OS foi de 49,4% para pacientes de alto risco, 66,7% para os pacientes de risco intermediário, e 100% para pacientes de baixo risco (p = 0,002; Figura 3).
miR-200c tem um maior impacto na migração de células de miR-141
a migração celular foi medida por
in vitro
ensaio de zero após a transfecção com pré-miR-200c, pré-miR-141 ou pré-miRNA negativo ao controle. Altos níveis de miR-200c reduzida a migração celular em comparação com o controlo na linha celular H23 (p = 0,005), A-549 (p = 0,0085) e HCC-44 (p = 0,013) (Figura 4A). Não foram observadas diferenças significativas para miR-141, exceto em A-549 (p = 0,043). Após a transfecção, os níveis de E-caderina foram analisados por imuno-histoquímica (Figura 4B) e um aumento dos níveis foram observados em células transfectadas com pré-miR-200c.
(A) após 36 ou 48 horas de transfecção com pré-miARNs em as linhas de células NSCLC, migração celular foi medida por
in vitro
ensaio de zero. Altos níveis de miR-200c reduzida a migração celular em comparação com o controlo em todas as linhas celulares (H23, p = 0,005; A-549, p = 0,0085; HCC-44, p = 0,013), enquanto que altos níveis de miR-141 reduzida célula migração apenas em a-549 (p = 0,04). (B) os níveis de E-caderina foi avaliada por imuno-histoquímica e níveis aumentados foram observados em células transfectadas com pré-miR-200c, em comparação com as transfectadas com pré-miR-141 ou pré-miR-controlo em todas as três linhas celulares.
miR-141 regula negativamente KLF6, levando ao aumento dos níveis VEGFA
in vitro
, e está relacionado à maior densidade de microvasos em amostras de doentes
Uma vez que miR-141 superexpressão teve sido previamente relacionado à maior formação de vasos sanguíneos em tumores ovarianos de modelos de ratos [18], que examinou o impacto potencial deste mecanismo sobre o papel prognóstico de miR-141 em NSCLC. Usando TargetScan 6,2, identificamos KLF6 como um alvo putativo de miR-141, mas não de miR-200c. Imunotransferência de KLF6 em H23 células transfectadas com pré-miR-141or pré-miR-200 ° C mostraram que apenas o miR-141 reduziu significativamente os níveis de proteína KLF6 às 24 h (Figura 5A). Desde KLF6 regula a expressão e secreção de VEGFA, um factor angiogénico fundamental [19], examinámos o efeito de aumentar o miR-141 em níveis de expressão de níveis in
VEGFA
. Nós overexpressed linhas de células, tanto de miR-141 e miR-200C na H23, A-549 e HCC-44 e tratou-se com NSCLC as células com DFX para produzir hipóxia. Após 48 horas, analisou-se os níveis de proteína de VEGFA no sobrenadante destas células. A sobre-expressão de miR-141 produziu um aumento médio de 28% na liberação de VEGFA (H23, p = 0,04; A-549, p = 0,03, HCC-44, p = 0,02), enquanto não houve diferenças significativas foram observadas para miR- 200c, excepto na linha celular HCC-44 (p = 0,04) (Figura 5B).
(a) de imunotransferência de KLF6 em células transfectadas com Controlo de pré-miR-negativos ou pré-miR-141 /200c . miR-141 reduziu significativamente o nível de proteína KLF6 nas três linhas celulares. (B) Depois de 48 horas de transfecção com pré-miARNs em condições hipóxicas, concentração VEGFA no sobrenadante da cultura foi medida por ELISA. Todos os resultados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes. (C) Um total de secções de tecido de tumor de adenocarcinoma 29 foram analisados por imuno-histoquímica com CD34 como marcador de navio; dois casos representativos com altos níveis baixos /de miR-141 são mostrados. (D) foram observadas diferenças significativas na densidade de microvasos no sangue entre adenocarcinomas com altos níveis de miR-141 e aqueles com baixos níveis de miR-141 (p 0,001).
Em seguida, procurou determinar se existe uma relação entre os níveis de expressão de miR-141 e o número de vasos sanguíneos em amostras de doentes. Depois de determinar o número de vasos sanguíneos em amostras de tumor de 29 pacientes por imunohistoquímica usando um anticorpo contra CD34 +, que é um marcador do endotélio dos vasos sanguíneos (Figura 5C), classificou-se as amostras de tumor em dois grupos: altos ou baixos níveis de miR-141. O número médio de vasos sanguíneos em tumores com altos níveis foi de 22% maior que a média em tumores com níveis baixos (P 0,001; Figura 5D)
A análise multivariada
Na análise multivariada. em toda a coorte, incluímos todos os fatores clínicos e biológicos com P≤0.1 uni e o escore de risco com base em miR-141 e expressão de miR-200c. A /miR-200c escore de risco de miR-141 (de alto risco vs outros) surgiu como um marcador de prognóstico independente de menor OS (OR, 2,787; IC95% = 1,087-7,148; p = 0,033), juntamente com estágio I e idade . 65 (Tabela 2)
Na análise multivariada incluindo pacientes de adenocarcinoma apenas, o escore de risco de miR-141 /miR-200c também foi um fator prognóstico independente para OS (OR, 10,649; IC95% = 2,433-46,608; p = 0,002), juntamente com a idade . 65 (Tabela 2)
Discussão
no presente trabalho, nós encontramos que a alta miR- 141 e expressão de miR-200c estão associados a menor sobrevida em pacientes com NSCLC de adenocarcinoma ressecados, incluindo aqueles com doença em estágio inicial. Além disso, o efeito combinatório dos dois miRNAs foi um fator prognóstico independente para OS. Diferentes mecanismos estão envolvidos no efeito destes miARNs; enquanto miR-141 parece agir através de angiogênese através da inibição
KLF6
e aumentando
VEGFA
níveis, miR-200c desempenha um papel na regulação da MET.
Recentemente, um plasticidade fenotípica tem sido postulada para processos de EMT-Met transientes [20]. Indução de Met por sobre-expressão dos membros da família de miR-200 é importante num ponto mais tarde no processo de metástase. Enquanto EMT permite que a célula de migrar do tumor primário, TEM lhe permita produzir metástases e colonizar em órgãos distantes [10], [11]. Assim, tanto a regulação baixa e superexpressão de membros da família miR-200 têm sido relacionados a pior prognóstico. A fim de investigar se o regulamento de Met por miR-141 e miR-200c era dependente de histologia, examinamos seu valor prognóstico nos dois principais subtipos histológicos e achamos tanto miR-141 e miR-200c estavam relacionados com OS apenas em adenocarcinoma pacientes. Tem sido observado que NSCLC Adenocarcinoma é um tipo de tumor mais mesenquimais semelhante, uma vez que foi observado que a vimentina, um marcador de células mesenquimais, foi sobre-expressa em adenocarcinomas bem diferenciadas e na H23, A-549 e linhas de células CHC-44 , mas não foi detectado em tecidos do SCC [21], [22]. De acordo com os nossos resultados, miR-200c superexpressão como um marcador de mau prognóstico foi previamente relatados em uma coorte de 70 pacientes com NSCLC composta de ambos adenocarcinoma e histologia SCC [17], mas seu valor prognóstico não foi abordada no subgrupo de doentes com adenocarcinoma. Em outros modelos de tumor, tais como câncer de mama, a sobre-expressão dos membros da família miR-200 levou ao aumento da metástase [23] e está associada com mau prognóstico [16]. Além disso, altos níveis séricos de miR-141 têm sido associados com mau prognóstico no câncer de cólon [24] e altos níveis de miR-200c com mau prognóstico no câncer gástrico [25]. Em contraste, um trabalho utilizando os dados de um banco de dados TCGA linha relatado que baixos níveis de miR-200b *, miR-200a e miR-429 foram relacionados com menor SO numa coorte heterogéneo de doentes com NSCLC, que incluíram aqueles com doença metastática [26] .
Desde miARNs modular os níveis de múltiplas proteínas-alvo, dependendo da sua sequência, o seu efeito é dependente das proteínas expressas em cada tipo celular [27]. Tanto miR-141 e miR-200c estão localizados na região a mesma cromossômica (12p13.31) e compartilham o mesmo local de partida da transcrição [28], mas se agrupar os miRNAs da família miR-200 de acordo com a similaridade de suas sementes sequência, podemos identificar dois grupos diferentes – miR-200 aC /429 e miR-200a /141 – que são diferenciadas por uma mudança de nucleotídeo único [29]. Apesar de miR-141 e miR-200c são transcricionalmente regulada da mesma forma, eles diferem em seus alvos. Quando analisamos o papel de miR-141 e miR-200c em EMT /MET no H23, A-549 e HCC-44 linhas de células, apenas a miR-200c influenciado EMT em todas as três linhas celulares. A sobre-expressão de miR-200C aumentou os níveis de proteína de E-caderina e a reduzida capacidade de migração das células do tumor, como foi anteriormente mostrado por Ceppi
et ai
num painel de linhas celulares diferentes de NSCLC. Ceppi
et al
investigou a expressão de miR-200c
in vitro
e
in vivo
e uma forte correlação inversa com a invasão foi detectada. Restabelecimento do miR-200c em células NSCLC altamente invasivos agressivos /induziu uma perda do fenótipo mesenquimal, restaurando a E-caderina e reduzindo a expressão de N-caderina, e inibiu o
In vitro
invasão celular, bem como
In vivo
metástase formação [30]. Além disso, Pacurari et ai. descobriu que a regulação negativa miR-200c em amostras de tumor de pulmão SCC foi correlacionada com níveis aumentados de DCL1, ATRX e HFE -. biomarcadores relativos a EMT [31]
Embora o miR-141 é um membro da família de miR-200, ela não estava envolvido na EMT /MET. O
in vitro
superexpressão de miR-141 foi relacionada com a redução do
KLF6
níveis de proteína, produzindo um aumento na secreção de
VEGFA
. Além disso, os tumores com altos níveis de miR-141 teve um maior número de vasos sanguíneos. Demonstrou-se que os fibroblastos associados ao cancro (FAC) isoladas a partir de adenocarcinomas do pulmão de murino secretadas abundante VEGFA e reforçada a invasão de células de tumor em estudos de co-cultura [32]. Quando analisamos a expressão de miR-141 no tumor e tecido normal emparelhado, não observamos diferenças significativas nos níveis de expressão, o que nos leva a especular que o papel prognóstico de miR-141 pode estar relacionado a sua expressão em células da CAF, em vez de células tumorais. A sobre-expressão de miR-141 levaria a superprodução de VEGFA e aumento da neoangiogênese, que tenham sido previamente relacionado ao prognóstico em NSCLC [33].
Materiais e Métodos
População do estudo e da ética declaração
cento e cinquenta e cinco pacientes adultos diagnosticados com NSCLC submetidos à ressecção cirúrgica completa na Clínica Hospital em Barcelona, Espanha, entre Março de 1996 e Dezembro de 2009 foram incluídos no estudo. Aprovação para o estudo foi obtido a partir de placa de revisão institucional do centro, e consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante, de acordo com a Declaração de Helsinki.
extração de RNA e análise miRNA
O RNA total e miARN detecção foi realizada a partir de tecidos tumorais FFPE como previamente descrito [34]. miARN detecção foi realizada utilizando ensaios (ensaios comerciais MicroRNA TaqMan, appplied Biosystems)
análise de Western Blot
análise Western Blot foi realizada como previamente descrito [35] utilizando os seguintes anticorpos primários:. KLF6 SC -7158 (Santa Cruz Biotechonology) e α-tubulina (Sigma).
A imuno-histoquímica
O ensaio de imuno-histoquímica, foram realizados como previamente descrito [36] usando um CD34 Classe Flex monoclonal de ratinho anti-humano clone II QBEnd 10 Ready-to-Use (Dako) e e-caderina clone NCH-38 (Dako).
vaso sanguíneo quantificação
Quatro áreas independentes foram selecionados monoclonal anti-humano sob um campo de 40X e um campo de 200X (0,785 milímetros
2 por campo) e usado para contar vasos CD34 positivas em cada uma dessas áreas. Dois patologistas independentes examinaram os slides, e a média de quatro 200X contagens de campo de navios CD34 positivas foi registrado.
As linhas celulares, miRNA transfecção e VEGF quantificação
H23 (American Type Culture Collection) e células de HCC-44 (DSMZ) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen). (DSMZ), as células 549-A foram cultivadas em DMEM (Invitrogen) contendo 10% de soro fetal de vitelo.
Um dia antes da transfecção, 7 × 10
4 células foram semeadas em placas de 6 poços. No dia seguinte, as células foram transfectadas com 100 nM de pré-miR-141 /200c ou Control pré-miR-negativo # 2 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Às 24 h pós-transfecção, as células foram tratadas com 400 uM desferrioxamina para induzir condições de hipóxia. Após 24 horas de incubação, a concentração de VEGF no sobrenadante foi medida em triplicado usando o VEGF humano Elisa Kit (ab100662, Abcam).
análise de migração celular
A migração celular foi medida por
in vitro ensaio de zero
[37]. 5 * 10
5 células foram plaqueadas numa placa de 12 poços um dia antes da transfecção com pré-miARNs. Vinte e quatro horas após a transfecção, a monocamada de células foi raspado em uma linha reta para criar um “scratch” com uma ponta de pipeta p100. A distância de migração (mm) foi avaliada em 36 h (HCC-44) ou às 48 h (H23 e A-549) após transfecção utilizando cellSense Entry 1,7 software (Olympus).
Análise estatística
oS foi calculado a partir do momento da cirurgia até a data da morte ou do último acompanhamento. As curvas de Kaplan-Meier para OS, com seus intervalos de confiança de 95% (IC), foram traçadas e comparadas por meio de um teste de log-rank. Todos os fatores com um valor de p 0,1 na análise univariada foram incluídas na regressão multivariada Cox análises para OS
teste t-pareado foi utilizado para comparar os níveis de miRNAs entre tecido tumoral e tecido normal emparelhado expressão.. Não teste t pareado foi usado para comparar as diferenças entre dois grupos. pontos de corte ótimos de dados de expressão de miRNA para OS foram avaliados por meio de estatísticas de log-rank máximo selecionados usando o pacote Maxstat (pacote R). A aplicabilidade destes pontos de corte foi confirmada pelo teste de Kaplan-Meier. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o PASW Statistics v18 (SPSS) e R v2.8.1. O nível de significância foi estabelecido em ≤0.05.
Informações de Suporte
Figura S1.
Os níveis de expressão de membros da família de miR-200 obtida a partir de 155 tumores NSCLC e tecido normal emparelhado. (A) Cluster 1: miR-200a, miR-200b, e miR-429. (B) Cluster 2:. MiR-141 e miR-200c
doi: 10.1371 /journal.pone.0101899.s001
(TIF)