PLOS ONE: estresse cirúrgico anula pré-existente celular T Protective imunidade mediada por Anti-Tumor Levando a pós-operatória recorrência do câncer

Abstract

Anti-tumorais células CD8

+ T são um factor determinante para a sobrevida global em pacientes após ressecção cirúrgica de tumores sólidos. Usando um modelo de ratinho de cancro da vacinação (antigénio associado a tumor de melanoma expressando adenovírus (TAA) -dopachrome tautomerase (AdDCT) e a ressecção, resultando em grandes estresse cirúrgico (nefrectomia abdominal), que demonstram que os resultados em estresse cirúrgico uma redução no número de CD8

+ célula T, que produzem citocinas (IFNy, TNFa, granzima B) em resposta a AT. Este efeito é secundário para tanto a proliferação reduzida e comprometimento da função das células T seguinte a ligação ao antigénio. Num modelo profiláctico, estresse cirúrgico anula completamente a protecção tumoral conferida pela vacinação no período pós-operatório imediato. em um modelo de ressecção cirúrgica clinicamente relevante, os ratos vacinados submetidos a uma ressecção margem positiva ao estresse cirúrgico, tinha diminuído a sobrevivência em comparação com camundongos com sozinho margem de ressecção positiva. imunoterapia pré-operatório com IFN estende significativamente a sobrevivência em ratos cirurgicamente estressados . É importante ressaltar que mielóide derivadas de células supressoras (MDSC) números populacionais e comprometimento funcional do específico do TAA CD8

celular + T foram alteradas em cirurgicamente salientou ratinhos. Nossas observações sugerem que a progressão do câncer pode resultar da supressão induzida por cirurgia de tumor específico CD8

+ células T. imunoterapias pré-operatórios destinadas a segmentação dos efeitos prometastatic de cirurgia de câncer vai reduzir a reincidência e melhorar a sobrevivência em pacientes de cirurgia de câncer

Citation:. Ananth AA, Tai LH, Lansdell C, Alkayyal AA, Baxter KE, Angka L, et al . (2016) estresse cirúrgico anula pré-existente celular T Protective imunidade mediada por Anti-Tumor Levando a pós-operatória recorrência do câncer. PLoS ONE 11 (5): e0155947. doi: 10.1371 /journal.pone.0155947

editor: Hiroyoshi Nishikawa, exploratória Oncology Research Ensaios Clínicos Center, Centro Nacional de Câncer, JAPÃO

Recebido: 09 de outubro de 2015; Aceito: 06 de maio de 2016; Publicado: 19 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Ananth et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Terry Fox Research Institute, New Investigator Award (RCA); Canadian Institutes of Health Research Fellowship (LHT); Canadian Institute Cancer Society Pesquisa, Inovação e Inovação para o Grant Impact (RCA)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A importância de vigilância imunitária em controlar crescimento de células malignas tem sido conhecido durante décadas. O princípio de que ocorrem naturalmente células T com potencial antitumoral existem no câncer humano levou ao campo emergente da imunoterapia do cancro. Tumores-se, no entanto, são capazes de sequestrar o sistema imune para suprimir o controlo imunológico, criando um ambiente favorável, não só para o primário, mas também para o crescimento metastático. O último processo foi denominado “instigação sistêmico” [1]. Entender esse ambiente tumoral imunossupressora e revertendo-a com agentes direcionados está provando ser uma estratégia de tratamento altamente bem sucedido [2].

A ressecção cirúrgica é o esteio da tratamento para a intenção curativa em tumores sólidos. Mesmo com a ressecção completa, muitos pacientes desenvolvem recorrência local ou metástases e, finalmente, morrer de sua doença [3-6]. as evidências acumuladas demonstram uma associação entre a presença de CD8

+ células T efetoras e melhorada e prognóstico de sobrevivência em um número de tumores sólidos, incluindo cancro da mama, do ovário, colo-rectal, carcinoma das células renais e melanoma maligno [7-9].

Esta associação sugere que a presença de um anti-tumoral robusta imune resposta, em particular anti-tumoral CD8

+ células T efectoras, pode evitar ou eliminar a doença residual mínima micrometástases ou após ressecção cirúrgica completa do tumor primário.

o nosso grupo e outros demonstraram que a pós-operatório imediato período é um tempo excepcionalmente susceptíveis para o desenvolvimento de metástases do cancro recorrência [3, 4, 10]. Há um número de mecanismos propostos para explicar o efeito, incluindo a disseminação de células tumorais em circulação [11], a libertação local e sistémica de mediadores pró-angiogénicos e mitogénicos (factor de crescimento epidérmico e factor de crescimento endotelial vascular) [3, 10, 12 ] e profunda inibição da imunidade mediada por células [3, 10]. Temos anteriormente implicado supressão induzida por cirurgia de células natural killer (NK) no desenvolvimento de metástases no pós-operatório [3, 4] em um modelo animal validado de estresse e metástases cirúrgico [13].

Embora estudos anteriores relataram uma redução na CD8

+ células T e secreção diminuída de citoquinas em resposta à estimulação não específica [14-17], nenhum exploraram a natureza dos efeitos de trauma cirúrgico na antigénio

+ respostas de células T CD8 específicas nem eles têm demonstrado a revogação de um anti-tumor de proteção pré-existente CD8 resposta das células

+ T. Neste artigo, vamos explorar os efeitos do estresse cirúrgico em um CD8 protector

+ células T efetoras mediadas imunidade anti-tumor. Para conseguir isso, usamos uma vacina tumor com base viral-vector chamado AdDCT. Esta é uma replicação incompetente-tipo humano E1 /E3 suprimida 5-adenovírus (Ad) que expressa o gene de comprimento completo humana dopacromo tautomerase (HDCT) [18] como um antigénio associado a um tumor (TAA). Foi previamente mostrado que a vacinação profilática AdDCT pode conferir protecção contra subcutaneamente (SC) implantado melanoma num CD8

forma dependente da célula T + [18-21]. Nós fornecemos pré-clínico

in vivo

resultados que indicam claramente que a grande cirurgia pode atenuar significativamente uma resposta imunitária protectora de células T pré-existente após a vacinação câncer e fornecer o novo uso da imunoterapia pré-operatório para reverter esse efeito.

Materiais e Métodos

ratos

C57BL /6, Balb /c, e CD1-nuas ratos foram adquiridos da The Jackson Laboratory (Bar Harbor). Os animais foram alojados em condições livres de patógenos e todos os estudos realizados foram de acordo com as orientações institucionais na instalação Animal Care Serviço de Veterinária da Universidade de Ottawa (Ontario). A Canadian Council on Animal Care e do Comitê de Cuidados Animal da Universidade de Ottawa aprovou este estudo.

Geração de estresse cirúrgico

Cuidados de rotina perioperatório (incluindo anestesia e gestão da dor) e estresse cirúrgico foram realizada como previamente descrito [3, 13]. Resumidamente, os ratinhos foram submetidos a 2,5% de isofluorano (Baxter Corp.) para a indução e manutenção da anestesia. estresse cirúrgico foi induzida em ratos por uma laparotomia abdominal (3 cm incisão mediana) e nefrectomia esquerda (Nx). Todos os animais submetidos a procedimentos cirúrgicos receberão injeções de buprenorfina pré e pós-operatório (0,05 mg /kg) administrada SC. No pré-operatório, os ratos são injectados SC 1 hora antes da cirurgia. No pós-operatório, os ratinhos são injectados cada 8 horas durante 2 dias. O peso corporal e outros aspectos do bem-estar dos animais são registrados diariamente após a cirurgia (S1 Tabela). Dados sangue não é coletado. Os ratinhos foram sacrificados por injecção intraperitoneal (ip), a injecção de pentobarbital sódico (65 mg /kg).

As linhas celulares

B16F10LacZ linha celular de melanoma foi obtida do Dr. K. Graham (Londres Ciências da Saúde, Ontário , originalmente a partir da American Type Culture Collection) e mantidas em DMEM completo. As células foram ressuspensas em DMEM sem soro para injecção intravenosa (iv) de injecção através da veia lateral da cauda. As células tumorais at % de viabilidade 95 foram injetados em um volume de 0,1 ml /rato

A vacinação de ratos

ratos anestesiados foram vacinados com 1×10

6 unidades formadoras de placa (UFP) de. AdDCT (reconstituído em 100 ul de PBS) ou PBS sozinho por via intramuscular (IM) injecção em cada coxa (50 l per coxa).

modelos de tumor de vacinação profilática

Os camundongos foram vacinados com AdDCT ou PBS no dia 0. No dia 7, os ratinhos foram injectados com células de tumor SC ou IV cirurgia anterior. tumores de melanoma sc foram estabelecidos através da injeção de 3×10

5 células B16F10lacZ em meios livres de soro no flanco posterior direito; o tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula 1/2 (L x W

2). Os ratos foram determinados a ter desfecho alcançado quando o volume do tumor atingiu 1.600 milímetros

3. modelos de disseminação sistêmica foram semeadas a 1×10 células

6 B16F10lacZ através da administração iv veia da cauda. Tumor-bearing pulmões foram coradas com X-gal para visualizar micrometástases de tumor tal como previamente descrito [3].

modelo de tumor A vacinação terapêutica

Os ratinhos foram injectados sc com 1×10

5 células em B16F10lacZ meios isentos de soro no flanco posterior direito no dia 0. no dia 7, os ratinhos foram tratados com PBS ou AdDCT na dose indicada (pfu). No dia 14, os tumores sc foram ressecados com uma margem positiva mm 2×2, com metade recebeu estresse cirúrgico adicional na forma de laparotomia abdominal e nefrectomia esquerda. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula 1/2 (L x W

2). Os ratos foram determinados a ter desfecho alcançado quando o volume do tumor atingiu 1.600 milímetros

3. Para o tratamento pré-operatório IFNa (R D Systems), os ratinhos receberam uma dose elevada (10000 UI) ao dia 10 e 3 doses baixas (1000 UI) nos dias 11 a 13.

Peptídeos

o péptido imunodominante da DCT que se liga a H-2K

b (DCT

180-188, SVYDFFVWL; compartilhada por DCT humana e murina). foi sintetizado por Biomer Tecnologia (Pleasanton, Califórnia)

a citometria de fluxo

para a coloração extracelular, os esplenócitos foram incubadas durante 30 minutos a 4 ° C no escuro com anticorpos conjugados fluorochrome- (diluído 1: 100) específica para antigénios da superfície celular e fixadas com 1% de PFA. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD3-PerCP (BioLegend), CD8α- FITC (BD Biosciences), CD4-PE (BD Pharmingen), Gr-1-FITC (eBioscience), CD25-FITC (BioLegend), FoxP3-APC (eBioscience ), CD11c-PeCy7 (eBioscience) e CD11b-PE (eBioscience). Para a coloração intracelular, 1-2×10

6 esplenócitos foram estimulados com péptidos de transformada de coseno discreta (2 ug /ml) na presença de brefeldina A (BD Pharmingen; GolgiPlug, 1 ug /ml adicionadas após 1,5 horas de incubação). Após 6 horas de incubação, as células foram tratadas com anti-CD16 /CD32 e antigénios da superfície celular foram marcadas com anticorpos fluorocromo-conjugados. As células foram então permeabilizadas e fixadas com Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen) e coradas para citocinas intracelulares: IFN-y-PE (BD Biosciences), TNF-PeCy7 (BioLegend) e granzima B-APC (eBioscience). Os dados foram adquiridos utilizando um fluxo Cyan-ADP 9 citômetro com 4,3 software Summit (Beckman Coulter) e analisados ​​com Kaluza 1,2 software (Beckman Coulter).

análise MHCI tetrâmero DCT-específico e ELISpot

Os esplenócitos foram tratados com anti-CD16 /CD32 e marcadas com conjugado com PE DCT

180-188 carregado com péptido de MHC-I tetrâmero (Baylor College), PerCP-CD3, e FITC-CD8a (eBioscience) durante 30 minutos em FACS tampão (PBS 1%, 5% de soro fetal de vitelo, 2,5% NAZ). Para as análises de ELISpot, o número exacto de DCT-MHC-I tetrâmero

+ /CD8

+ células T foram calculados a partir dos resultados de citometria de fluxo proporção e adicionado a uma IFNy ELISpot seguindo as instruções do fabricante (Mabtech).

T a apoptose de células de ensaio

Os esplenócitos foram tratados com anti-CD16 /CD32 e antigénios de superfície celular foram marcados com PE e FITC-CD3-CD8a (eBioscience). As células foram então marcadas com APC-AnnexinV e 7-AAD (BD Pharmingen) durante 15 minutos e os dados foram adquiridos no Ciano-ADP (Beckman Coulter) dentro de uma hora.

BrdU proliferação de células T Ensaio

os esplenócitos foram estimulados de novo in vitro com péptidos (2 ug /ml) a 37 ° C na presença de brefeldina a (GolgiPlug; BD Pharmingen, 1 ug /ml adicionadas após 1,5 horas de incubação). Após 3,5 horas de incubação, as células foram marcadas com BrdU (BD Pharmingen) e incubou-se durante uma hora adicional. Após 6 horas de incubação, as células foram tratadas com anti-CD16 /CD32 e antigénios da superfície celular foram marcadas com PerCP-CD3 e PE-CD8a. Seguindo as instruções do fabricante, as células foram tratadas através de uma série de permeabilizations e fixações e coradas para BrdU-FITC intracelular.

MDSC-T supressão de células de ensaio

células T foram isolados a partir dos baços de ratinhos que recebeu a vacinação AdDCT 7 dias antes da colheita. MDSCs foram isolados a partir dos baços de ratinhos de controlo e stressados ​​cirurgicamente (18 horas pós-cirurgia). As células T foram positivamente seleccionadas para a utilização MicroBeads CD90.2 (Miltenyi Biotec) e MDSC foram seleccionadas positivamente para utilizando o Kit de isolamento supressora de células mielóides derivadas (Miltenyi Biotec), ambos seguindo os protocolos do fabricante. As células foram ressuspensas a 1 x 10

6 células /50 uL de cRPMI e co-cultivados em vários MDSC: rácios T (0,25: 1, 0,5: 1, 1: 1). CD3 /CD28 Dynabeads (Life Technologies) foram adicionados à cultura numa relação de 1: 1 de células a- bead- além de 30 U /mL de interleucina-2 de rato recombinante de acordo com a recomendação do fabricante. As células foram então cultivadas durante 4 dias num CO

2 incubadora a 37 ° C. Após 4 dias, as células foram transferidas para uma placa de 96 cavidades de fundo em V para a estimulação com péptido re transformada discreta de cosseno utilizando o protocolo anteriormente listados para coloração intracelular.

A análise estatística

análise unidireccional de variância (ANOVA) eo teste Bonferonni post hoc foram realizadas para todos os dados. Um valor de P 0,05 foi considerado significativo. significância estatística de curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram determinadas usando testes de log-rank.

Resultados

estresse cirúrgico prejudica a imunidade antitumoral resultando em metástase pulmonar e desenvolvimento de tumor subcutâneo

Para determinar o impacto do estresse cirúrgico sobre células T TAA específicos de, desenvolvemos um modelo de cirurgia vacinação AdDCT. Usando nosso melanoma pulmão modelo estabelecido B16F10lacZ cirurgia metástases [3, 13], administrou AdDCT neoadjuvante seguidos de 7 dias mais tarde, com a inoculação do tumor por injecção intravenosa e cirurgia de grande porte com uma laparotomia e nefrectomia (Fig 1a). A vacinação com 1×10

6 pfu de AdDCT conferiu uma redução de 3 vezes na metástases em comparação com ratinhos de controlo tratados com PBS. No entanto, os ratinhos vacinados submetidos a uma grande cirurgia demonstrou um aumento de 5 vezes em comparação com a vacinação metástases sozinho (Fig 1b). Isto sugere que a cirurgia atenua a imunidade antitumoral conferida pela vacinação AdDCT.

(a) ratinhos B6 foram administrados com AdDCT neoadjuvante em 1 × 10

7 pfu. No dia 7, os ratinhos foram infectados com 3×10 IV

5 B16F10lacZ de células, a fim de estabelecer metástases de melanoma do pulmão singénicos, e, em seguida, foram submetidos a laparotomia abdominal e nefrectomia (Nx) ou não a cirurgia. (B) pulmões extraídos no dia 10 (3 dias após a inoculação das células tumorais) a partir de PBS, Nx, AdDCT, AdDCT + Nx e quantificadas por coloração com X-Gal. N = 5 /grupo. (C) Os ratinhos B6 foram vacinados com AdDCT, em seguida, expostos no dia 7 com sc 1×10

células 6 B16F10lacZ, em seguida, passou por uma cirurgia ou nenhuma cirurgia. (D) volume do tumor de ratos portadores de tumor tratados B16F10lacZ SC foi monitorizado diariamente. (E) Sobrevivência de ratos portadores de tumor tratados B16F10lacZ sc são mostrados em curvas de Kaplan-Meier. Percentagem de ratinhos vivos é indicado. N = 7-8 /grupo, (* P 0,05, *** P 0,001).

Foi previamente demonstrado que as células de melanoma injectado IV são mais susceptíveis a lise mediada pela célula NK em comparação com melanoma sc, em grande parte devido a diferenças no microambiente tumoral e proporções de células imunes [22, 23]. Para descartar um papel de mediador para as células NK, foi realizado o desafio tumor usando uma injecção subcutânea de células tumorais B16F10lacZ no flanco posterior (Fig 1c). Em camundongos AdDCT vacinados que não foram submetidas ao estresse cirúrgico, 100% rejeitou um desafio tumor subsequente ao passo que todos os ratos que foram submetidos a uma grande cirurgia no momento da tumorais desafio desenvolveram tumores flanco a uma taxa semelhante aos ratos vacinados-un controle (1d Fig e 1e). Além disso, observou-se a atenuação da imunidade anti-tumor pré-existente por estresse cirúrgico em um modelo de cancro colorectal CT26 (S1 Fig), sugerindo que a disfunção induzida por cirurgia de imunidade específica contra o tumor não é exclusivo para o nosso modelo de melanoma. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o estresse cirúrgico em ratos AdDCT vacinados anula uma resposta imune anti-tumoral de proteção.

Cirurgia induzida revogação da protecção conferida pela vacinação AdDCT é dependente de CD3

celular + T

para demonstrar um papel de mediador para o sistema imunitário adaptativo na insuficiência induzida por cirurgia de vacinação AdDCT protectora, repetiu-se o modelo de desafio de tumor SC em ratinhos CD-1 nu que são deficientes em células T e B, mas reter células NK função [24] (Fig 2a). Em ratinhos nus, AdDCT vacinação não protege ratos formar um desafio do tumor e estresse cirúrgico não resultou em uma diferença significativa na sobrevida em camundongos AdDCT vacinados (Fig 2b). Isto sugere que o sistema imunitário adaptativo é essencial para os efeitos protectores da vacinação AdDCT e os efeitos negativos do estresse cirúrgico no desenvolvimento de tumor no nosso modelo. Para estabelecer as células T como o mediador tanto para a proteção do tumor seguinte AdDCT da vacinação e para a susceptibilidade ao crescimento do tumor após cirurgia major, que adoptively transferidos 1,0×10

7 purificada baço CD3

+ células T de camundongos AdDCT vacinados e de salientou cirurgicamente ratos AdDCT vacinados em ratinhos receptores ingênuos. 1 dia após a transferência de células T, ratinhos receptores foram desafiados com tumores SC B16F10lacZ (Figura 2c). A sobrevivência foi monitorizada ao longo do tempo. Os ratos que receberam as células T de dadores vacinados foram de 90% protegido contra o desafio do tumor B16, enquanto que os que receberam o mesmo número de células T a partir de dadores cirurgicamente forçado vacinados todos os tumores do flanco progressivo desenvolvidas (FIG 2D). Transferindo salientou cirurgicamente células T e recriando o efeito da cirurgia na vacinação de protecção, foi estabelecido que o efeito negativo da cirurgia sobre a vacinação AdDCT é mediada por células T.

(a) CD-1 ratos nus foram vacinados com 1 × 10

7 pfu AdDCT. No dia 7, os ratinhos foram desafiados com tumores SC B16F10lacZ e, em seguida, foram submetidos a cirurgia ou cirurgia não. (B) Sobrevivência de ratinhos nus portadores de tumor B16F10lacZ CD-1 tratadas são mostrados em curvas de Kaplan-Meier. Percentagem de ratinhos vivos é indicado. N = 7-8 /grupo. (C) Os ratinhos B6 foram vacinados com 1×10

7 pfu AdDCT e no dia 7, os ratos foram submetidos a cirurgia ou nenhuma cirurgia. No dia 8, baço CD3

células + T foram isolados e transferidos para ratos destinatário B6 ingênuos. No dia 9, os ratos receptores foram desafiados com tumores sc B16F10lacZ. (D) a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor tratados B16F10lacZ são mostrados na cura de Kaplan-Meier. Percentagem de ratinhos vivos é indicado. N = 7-8 /grupo.

Resultados estresse cirúrgico em uma diminuição na CD8

+ T produção de citocinas de células em resposta a TAA

Uma vez que o estresse cirúrgico resultou em atenuação da depuração mediada por células T de células tumorais in

in vivo

, questionado se AdDCT induzida a produção de citocinas de células T em resposta a TAA (DCT) é afectada pela cirurgia. Utilizando o mesmo modelo de vacinação AdDCT neoadjuvante seguida de inoculação do tumor e maior trauma cirúrgico 7 dias mais tarde, avaliou-se a secreção de citocinas em específicos de transformada discreta de cosseno CD8

+ células T isoladas a partir do baço em 18 horas após a cirurgia. Observou-se um decréscimo significativo nas proporções de CD8

+ células T que segregam IFN-y (Fig 3a e 3b), TNFa (Figura 3c) e granzima B (figura 3d), em resposta à estimulação de péptidos DCT e uma redução no número de CD8

+ células T que segregam IFN-y em resposta a estimulação não específica com PMA e ionomicina (Fig S2). Além disso, foi realizado um ensaio ELISpot de IFN-y para corroborar a citometria de fluxo e os resultados encontrados uma atenuação semelhante no número de transformada discreta de cosseno específicos de CD8

+ células T produtoras de IFN-y após a cirurgia major (Fig 3e e 3f). Estes dados sugerem que cirúrgicos resultados de tensão em uma diminuição do número de TAA específicas CD8

celular + T secretoras de citocinas após estimulação peptídeo DCT.

B6 ratos receberam vacinação neoadjuvante com 1 × 10

7 pfu AdDCT. No dia 7, os ratinhos foram infectados com 3×10 IV

5 B16F10lacZ de células, a fim de estabelecer metástases de melanoma do pulmão singénicos, e, em seguida, foram submetidos a cirurgia ou cirurgia não. No dia 8, os ratos foram sacrificados e a avaliação das células imunes do baço foram submetidos. Percentagem de DCT específico do (a) IFN

+, (c) TNF

+, (d)

+

+ células T CD8 granzima B reagindo a DCT

exposição 180-188 peptídeo . (B) fluxo Representante citometria de gráficos de pontos de DCT-específico IFN-y

+ /CD8

+ células T reagindo a DCT

180-188 exposição peptídeo. (E) Quantificação do SFU em ensaio ELISpot de IFN-y. (F) Correspondente imagens representativas de ensaio IFN-y ELISpot de CD8

+ T reagindo-to DCT

180-188 exposição peptídeo. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001)

cirurgicamente sublinhou células T exibir secreção de citocinas reduzida, proliferação e infiltração tumoral em resposta a TAA

relatórios anteriores demonstraram uma redução global das CD8

+ T após a cirurgia [10, 14]. Usando o nosso modelo de vacinação AdDCT seguido por cirurgia de grande porte 7 dias mais tarde, nós também demonstrou uma redução em números globais de CD8 +

T isolados do baço 18 horas após a cirurgia (Fig 4a). Esta redução não era secundária ao aumento da morte celular, tal como medida por coloração com 7AAD e AnnexinV (figura 4b), mas foi associado com uma redução na proliferação das células T, tal como medido por incorporação de BrdU após a estimulação DCT-péptido (Figura 4c). A seguir, procuraram determinar se a diminuição do número de células CD8

células + T secretoras de citocinas em resposta a DCT foi secundária a uma diminuição na proporção de

+ células T CD8 específicas em DCT (isto é, as células T capazes de transformada discreta de cosseno de ligação ) ou um comprometimento funcional da secreção de citocina seguinte DCT-estimulação. Usando uma classe MHC I tetrâmero DCT-specific, demonstramos nenhuma redução na proporção de DCT específicas de CD8

+ células T após estresse cirúrgico em ratos vacinados (Fig 4d e 4e). A fim de confirmar que a DCT-specific CD8

+ células T foram auditivos funcionalmente após a cirurgia, banhado a números iguais de transformada discreta de cosseno de CD8 de ligação tetrâmero

+ células T num teste ELISPOT após estimulação péptido DCT e observou-se uma redução significativa secreção de IFN-y (Fig 4F). Além disso, avaliou-se a cinética de expressão de IFN-y em DCT-específica CD8

+ T células em vários pontos de tempo após a vacinação e cirurgia e observaram um período de recuperação da funcionalidade das células T entre o dia pós-operatório (POD) 7 e POD 28 ( S3A e Fig S3B). A recuperação observada da função das células T no POD 28 também se correlaciona com uma resposta imunológica antitumoral como ratos-recuperado de cirurgia foram capazes de rejeitar um desafio tumor B16lacZ sc com igual eficácia como nenhum controle de cirurgia (S3C FIG). Finalmente, nós avaliamos se CD8

+ migração de células T no tumor foi afetada pelo estresse cirúrgico. Para resolver isso, nós camundongos vacinados com AdDCT seguido 7 dias mais tarde por injecção subcutânea de células tumorais misturado com um plug matrigel e cirurgia de grande porte. tampões de Matrigel foram avaliados para linfócitos infiltrantes de 3 dias após a implantação. Os nossos dados demonstram que as células T CD8

+ T foram diminuiu para metade nos tumores dos ratinhos cirurgicamente estressadas, indicando que a cirurgia do tumor afecta a infiltração imunitário (Figura 4G). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que os grandes resultados da cirurgia em uma redução global em CD8

+ células T que não é secundária a um aumento da morte celular, mas é associada com a inibição de proliferação. A proporção de células T específicos de transformada discreta de cosseno não é reduzida em relação ao número global, mas as restantes células T específicas DCT-são disfuncionais na sua capacidade de secretar IFN-y em resposta ao antigénio de tumor. Finalmente, CD8

+ infiltração de células T de tumores também é prejudicada após estresse cirúrgico.

B6 ratos receberam vacinação neoadjuvante com 1 × 10

7 pfu AdDCT. No dia 7, os ratinhos foram infectados com 3×10 IV

5 B16F10lacZ de células, a fim de estabelecer metástases de melanoma do pulmão singénicos, e, em seguida, foram submetidos a cirurgia ou cirurgia não. No dia 8, os ratos foram sacrificados e a avaliação das células imunes do baço foram submetidos. (A) Número total de células CD8 +

T, (b) número total de anexina V

– /7-AAD

– /CD8

+ T (live), anexina V

+ /7-AAD

– /CD8

+ T (início de apoptose), anexina V

+ /7-AAD

+ /CD8

+ T (final de apoptose) das células, (c ) porcentagem de BrdU

+ /CD8

+ T células, (d) porcentagem e (e) gráfico de pontos representante da DCT-tetrâmero

+ /CD8

+ células T reagindo a DCT

180-188 exposição peptídeo, (f) quantificação da SFU de DCT-tetrâmero

+ /CD8

+ células T reagindo a DCT

180-188 exposição peptídeo no ensaio de IFN-y ELISpot. (G) o número total de células T CD8

+ /CD3

+ T células por mg de tumor a partir de ratinhos B6 desafiados com tumores SC B16F10lacZ misturadas com matrigel no dia 7. No dia 10, tampões de Matrigel foram removidos e avaliados para imune infiltração de células por citometria de fluxo. N = 4-6 /grupo. (* P 0,05, *** P 0,001).

Cirurgia prejudica a função de vacina num modelo de B16 terapêutico de doença residual mínima (DRM) e pode ser parcialmente resgatados com IFNa perioperatória

Tendo em conta as limitações de um modelo profilático de vacinação do cancro, nós desenvolvemos um modelo terapêutico melanoma B16 clinicamente relevante da doença residual mínima (MRD) (Fig 5a). Neste modelo, todos os ratinhos tinham tumores do flanco implantadas no dia 0 seguido de vacinação AdDCT no dia 7, a ressecção do tumor primário com uma margem positivo 2 mm no dia 14 para simular DRM em pacientes de cirurgia de cancro humano, seguido de estresse cirúrgico adicional. Semelhante ao modelo profilática, observou-se que os ratos AdDCT vacinados que receberam ressecção sozinho sobreviveram significativamente mais longa do que os ratos AdDCT vacinados com estresse cirúrgico adicional (Fig 5b). Devido aos efeitos supressivos de cirurgia em DCT-specific CD8

+ imunidade de células T pré-existente, administrou-se a imunoterapia citocina pré-operatório, na forma de tratamento de IFNa para resgatar a função das células T e melhorar a sobrevivência (Figura 5c). Observou-se que a sobrevivência mediana de AdDCT vacinados ratos que foram submetidos à ressecção e nefrectomia foi de 17 dias, enquanto que a sobrevida mediana foi estendida para 27 dias em ratinhos tratados IFNa perioperatórios (Fig 5d). A seguir, directamente examinado se o tratamento de IFNa no contexto de funções de vacinação AdDCT para melhorar as respostas de células T específicas de transformada discreta de cosseno. Curiosamente, a terapia de IFN pré-operatória não impactou significativamente a secreção de citocinas (IFN-y e TNF) a partir específicas do DCT

+ células T CD8 (S4 Fig). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que é possível combinar a imunoterapia com grande cirurgia para prolongar a sobrevivência no pós-operatório. No entanto, outras células efectoras (tais como células NK) podem desempenhar um papel na adição de

+ células específicas DCT-T CD8 na mediação dos efeitos benéficos do IFNa.

SC (a) Os ratinhos B6 foram injectados com 1×10

6 células B16F10lacZ. No dia 7, os ratinhos foram vacinados com AdDCT. No dia 14, os tumores foram ressecados (Res), com uma margem de 2 milímetros +/- estresse cirúrgico (Res + Nx). (B) a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor tratados B16F10lacZ são mostrados em curvas de Kaplan-Meier. N = 7-8 /grupo. c) tratamento pré-operatório no dia 10 com uma dose elevada (10.000 IU /rato) e nos dias 11 a 13 com 3 doses baixas (1000 UI /ratinho) de mIFNα recombinante em modelo vacinação MRD. A sobrevivência de ratinhos portadores de tumor tratados B16F10lacZ são mostrados em curvas de Kaplan-Meier. N = 5-6 /grupo.

expansão induzida por cirurgia de MDSC granulocytic prejudica T citocina celular secreção

Finalmente, nós investigamos os mecanismos de supressão de células T em ratinhos portadores de tumor receber vacinação e submetidos a estresse cirúrgico. Mielóides células supressoras derivadas (MDSC) representam uma população de células mielóides imaturas que expandir dramaticamente durante a progressão do tumor e prejudicar a imunidade adaptativa [25]. Em ratinhos, há duas populações de MDSC definidas pela sua expressão relativa de Gr1 e estado funcional [26, 27]. Especificamente, observou-se um aumento significativo na proporção de baço granulocítica MDSC (gMDSC) em cirurgicamente forçado e ratinhos vacinados (Fig 6a), mas não monocítica MDSC (mMDSC) (Fig 6b) em comparação com controlos vacinados sem cirurgia. Em contraste, não foram observadas quaisquer diferenças em populações de baço T reguladoras (Treg) após a vacina e cirurgia (Fig 6c). Para analisar a capacidade dos gMDSC derivado de cirurgia para suprimir a função das células T ativadas por vacina, baço gMDSC foram isoladas de controle e cirurgicamente salientou ratos e co-cultivadas com células T de camundongos Ad-DCT-vacinados. Na presença de derivados de cirurgia gMDSC, a produção de IFNy (Figura 6d) e TNFa (Figura 6e) por CD8

+ células T específicas de transformada discreta de cosseno foram significativamente inibidos em resposta ao péptido de transformada discreta de cosseno. Além disso, avaliou-se o tratamento pré-operatório IFN pode reverter o acúmulo de gMDSCs no baço de ratinhos após a vacinação e cirurgia (S5 Fig). Após um exame mais, verificou-se que a terapia pré-operatória IFNa não diminuir a expansão de gMDSC em ratinhos quando comparados com ratinhos vacinados submetidos a cirurgia. Mostramos ainda que a expressão de superfície celular gMDSC da activação /marcadores de maturação CD80 /CD86 não são alterados após a pré-operatória IFNa sugere que o tratamento com o IFNa não têm um impacto directo composição e função gMDSC no baço.

B6 ratinhos foram desafiados com B16F10lacZ tumores, recebido vacinação AdDCT (dia 7) e, em seguida, submetido a uma cirurgia tal como descrito acima. No dia 8, os ratos foram sacrificados e submetidos a esplénica MDSC foram isolados para a enumeração e ensaios funcionais. Percentagem de (a) granulocítica MDSC, (b) MDSC monocíticas e células (C) T reguladoras. Percentagem de específico-DCT (d) IFN

+ e (e) TNF

+ CD8

+ T células de controle ou camundongos vacinados reagindo a DCT

180-188 exposição peptídeo seguintes 4 dias em cultura com o controle ou cirurgicamente salientou MDSC. N = 4-6 /grupo. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

Discussão

A ressecção cirúrgica é o esteio da terapia para doenças malignas mais sólidas, mas, apesar ressecção completa, muitos pacientes abrigar MRD e, finalmente, morrer de uma recorrência [28]. vacinas contra o câncer são os mais adequados para erradicar MRD [22, 23, 29], proporcionando uma forte razão para combinar cirurgia e imunoterapia em ensaios clínicos de câncer. No entanto, um ensaio clínico logicamente projetado da vacinação câncer deve levar em consideração o efeito do estresse cirúrgico sobre as respostas das células T específicas do TAA e os mecanismos responsáveis ​​ele.

No presente estudo, demonstramos que o transitório, mas

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