Abstract

Apesar de culturas em monocamada sendo amplamente utilizado para o desenvolvimento de medicamento contra o câncer e testes, culturas 2D tendem a ser hipersensíveis à quimioterapia e são preditores relativamente pobres de se uma droga irá fornecer benefício clínico. Embora geralmente mais complicado, três sistemas dimensional cultura (3D) muitas vezes melhor recapitular arquitetura câncer de verdade e fornecer uma resposta à droga mais precisa. Como um passo no sentido de tornar as culturas câncer 3D mais acessível, desenvolvemos uma plataforma de micropoços e protocolo de modificação da superfície para permitir a fabricação de alto rendimento dos agregados câncer 3D. Aqui usamos este novo sistema para caracterizar microagregados de células de câncer de próstata, incluindo cinética de crescimento e de sensibilidade às drogas. Os nossos resultados indicam que as células de cancro da próstata são viáveis ​​neste sistema, no entanto, algumas linhas de células de próstata não cancerosas não são. Este sistema permite controlar de forma consistente para a presença ou ausência de um núcleo apoptótico nas microagregados cancerosas 3D. Semelhante aos tecidos de tumor, os microagregados 3D exibir fraca polaridade. Criticamente a resposta de microagregados 3D para o medicamento quimioterápico, docetaxel, é mais consistente com

In vivo

resultados do que os controles 2D equivalentes. Cumulativamente, os nossos resultados demonstram que estes microagregados de câncer de próstata recapitular melhor a morfologia dos tumores de próstata em comparação com 2D e pode ser usado para testes de drogas de alto rendimento

Citation:. Chambers KF, Mosaad EMO, Russell PJ, Clements JA , Doran MR (2014) culturas em 3D de células cancerosas da próstata cultivadas em um-High throughput Plataforma Cultura Novel são mais resistentes a Quimioterapia em comparação com células cultivadas em monocamada. PLoS ONE 9 (11): e111029. doi: 10.1371 /journal.pone.0111029

editor: Wendy J. Huss, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de junho de 2014; Aceito: 26 de setembro de 2014; Publicação: 07 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chambers et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. MRD é financiado por uma Movember New Concept Grant (NCG 3212) concedidos através Foundation cancro da próstata do programa de pesquisa da Austrália (http: //www. prostate.org.au). JAC é apoiado por um Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho da Austrália principal Bolsa de Investigação (https://www.nhmrc.gov.au). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cultura celular tridimensional (3D) é motivada pela necessidade de realizar experimentos que recapitulam melhor o microambiente fisiológico. Convencionais duas culturas de células (2D) dimensionais frequentemente falham para imitar as funções celulares e vias de sinalização presentes no tecido. Consequentemente culturas de células em 2D pode levar a dados limitados enviesadas e [1], [2]. Microarray perfis de 2D 3D contra culturas demonstrou que 50% dos genes mudança na expressão na cultura 3D [3]. Algumas destas diferenças podem ser atribuídas a diferenças na tensão mecânica da matriz. Por exemplo, as células cultivadas em 2D na experiência de plástico de cultura de tecidos elevada tensão de tracção, um milhão de vezes maior do que a dos tecidos moles [4], e isto é conhecido para alterar a fisiologia de células [5]. Artificialmente elevadas tensões de tracção pode afectar profundamente a morfologia celular, o citoesqueleto arranjo, a adesão célula-célula e a migração. 3D-culturas imitar melhor tecido natural tensões mecânicas e, assim, proporcionar uma condição patofisiológica mais representativo do que utilizando placas de cultura de tecidos convencionais [6], [7]. Este efeito relativo é evidente durante

in vitro

testes de quimioterapia, onde as culturas 2D são tipicamente hipersensibilidade a drogas, enquanto 3D sensibilidade cultura das drogas mais frequentemente paralelo o equivalente

in vivo

cenário [8], [9 ].

Apesar do fato de que o 3D-culturas funcionar como

in vitro

cancro modelos de teste de drogas mais robustos, a maioria dos laboratórios ainda dependem de culturas 2D como a sua principal ferramenta. Isto é em parte devido ao aumento do trabalho e os custos associados à criação de modelos 3D e porque não há nenhum acordo sobre um único modelo padrão que pode ser usado em todo o campo. Vários tipos de sistemas de cultura 3D, com diferentes vantagens e armadilhas, está empregado atualmente. Natural matriz extra-celular (ECM) géis, tais como tipo I, colagénio e-laminina rico Matrigel pode fornecer os sinais mecânicos e químicos para a morfogénese do tecido, no entanto, eles contêm um número de factores de crescimento não definidos e proteínas da MEC que diferem entre lotes mudando o Propriedades mecânicas do gel. géis sintéticos constituídos por polímeros sintéticos peptídicos funcionalizados foram concebidos para imitar as propriedades de ECM específicos e, por conseguinte, oferecer uma alternativa [10]. No entanto, os sistemas baseados andaime e gel pode ser caro para ampliar em grandes estudos de alto rendimento e difícil de analisar. Técnicas como a sobreposição de líquido-ágar e polyHEMA oferecer uma alternativa mais barata, porém o tamanho e uniformidade dos agregados não pode ser estritamente regulamentado e isso se traduziria em taxas de penetração de drogas diferentes [11], [12]. Nós adaptamos um sistema de micropoços alto rendimento para cultura de células da próstata como microagregados de um tamanho controlado. Este sistema oferece uma vantagem sobre outros sistemas de cultura 3D em que as dimensões dos microagregados podem ser estritamente regulada e agregados de um tamanho definido são produzidos de uma natureza escalável para o teste de drogas de alto rendimento. Aqui nós mostramos que as células cancerosas da próstata auto-montar em agregados que respondem ao tratamento medicamentoso de uma maneira consistente com o

in vivo

sensibilidade esperado.

Materiais e Métodos

Fabrication e multi-camadas dos micropoços

A fabricação das matrizes de micropoços de polidimetilsiloxano (PDMS) foi realizada como descrito anteriormente [13]. Neste exemplo utilizou-litografia macia para formar matrizes de 360 ​​× 360 × 180 um micropoços ou 800 x 800 x 800 ^ M em discos de PDMS, que foram, então, montadas nas cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços. Resumidamente, uma bolacha de sílica foi usado para formar um molde de PDMS, a partir do qual um molde de poliestireno inversa foi criado. A superfície de micropoços PDMS foi criada em folhas, utilizando este último molde e a folha foi perfurado para fora em discos (Figura 1A). Socos de diferentes tamanhos podem ser usados ​​para criar inserções para qualquer navio de plástico de cultura de tecidos de tamanho. Usando esta técnica milhares de micropoços podem ser produzidos

en masse

(600 microagregados /cm

2 ou 150 microagregados /cm

2 para os micropoços menores e maiores, respectivamente). A superfície de PDMS foi revestido quer com solução salina tamponada com solução a 5% de Pluronic /fosfato (PBS) ou em camadas múltiplas com quitosano (CHI) e ácido hialurónico (HA), ambos os quais impedem a adesão de células à superfície de PDMS. Tal como descrito anteriormente [13] multi-camadas começa com uma camada de poli-lisina electropositivo para auxiliar ainda mais a adesão da camada e cinco camadas de CHI e HA são sequencialmente incubadas durante intervalos de 15 minutos. Nós mostramos anteriormente que a adesão superior blocos camada celular HA em micropoços PDMS e que este promove agregação de células [14]. Depois de se revestir as pastilhas foram esterilizados em etanol a 70% durante a noite e lavou-se com PBS pronto para ser utilizado.

(A) Um molde de poliestireno [13], foi usado para moldar folhas PDMS com uma superfície modelada-micro. Os discos foram perfurados fora da folha de PDMS para formar pastilhas para placas com múltiplas cavidades, e nestas superfícies foram revestidas com 5% de Pluronic ou várias camadas com CHI e HA. células LNCaP (50.000) foram semeadas em que quer (B) Pluronic revestido (3D Pluronic) ou (C) (multi 3D) micropoços com múltiplas camadas e o ensaio de azul de alamar foi utilizado para medir o metabolismo em 3D contra células 2D. Ambos os revestimentos produzidos agregados viáveis ​​que o aumento no metabolismo ao longo de 7 dias a uma taxa comparável às células crescidas em cultura 2D. Três repetições técnicas foram realizadas por ponto de tempo.

Células e cultura microagregados de próstata

As linhas de células de câncer de próstata, RWPE-2 [15] e LNCaP [16], e não-canceroso linha de células RWPE-1 [15], foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640, 5% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco) mais 1% de penicilina /estreptomicina (P /S) (Gibco) em 5% de CO

2 a 37 ° C. Para os estudos de optimização médias, de queratinócitos-SFM, 2% de pituitária de bovino Extracto (BPE), além do factor de crescimento epidérmico (EGF) suplemento (Gibco) foi também usado. De qualquer 50.000 ou 100.000 células foram semeadas por poço em 1 mL de meio de cultura. Microagregados foram formados através da agregação forçada; As placas foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos para facilitar a granulação das células para os micropoços. No processo de agregação forçada, as células suspensas em meio são sedimentadas uniformemente no interior da matriz de micropoços na base do poço. O meio foi trocado nos dias 3, 6, 8, 10 e 13. Durante a troca de meio, foi tomado cuidado para não aspirar os microagregados. O meio foi adicionado e subtraído a partir do mesmo ponto no poço durante cada troca. As placas foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2. imagens de contraste de fase foram feitas usando um microscópio Nikon Eclipse-Ti invertido e o diâmetro central de cada microagregados foi medida usando o programa Image-J (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Um mínimo de 50 microagregados foram medidas por ponto de tempo.

Seccionamento, imunofluorescência e imagem confocal

Os microagregados foram fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos e, ou incorporado em Tissue-Tek temperatura de corte (OCT) composto ideal (VWR International) para seccionamento ou imunocoradas diretamente. As amostras foram permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 durante 20 minutos e incubadas com anticorpos primários para E-caderina (Invitrogen, AB_86564), β-catenina (Santa Cruz-, AB_626807) (diluído 1:200), α6-integrina (Millipore , AB_10834933), laminina-5 (Abcam, AB_2133782), caspase-3 clivada (Cell Signaling Tecnologia, AB_331440) (diluído 1:100) e Ki67 (Abcam, AB_443209) (1:400) durante a noite a 4 ° C. O anticorpo secundário respectivo conjugado com Alexa-488 (Invitrogen) foi adicionada durante 1 h à temperatura ambiente; 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Sigma-Aldrich) foi usado para corar os núcleos e de rodamina faloidina (Invitrogen) foi utilizado para corar para F-actina. Os microagregados foram montadas utilizando Prolong ouro (Invitrogen) e fotografada usando uma Leica TCS SP5 microscópio confocal ou um microscópio Nikon Eclipse-Ti invertido.

Live /morto coloração

As células foram incubadas com 2 ug /ml de diacetato de fluoresceína (FDA) (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos e iodeto de 20 ug /mL de propídio (PI) (Sigma-Aldrich) durante 2 minutos a 37 ° C a mancha vivo e as células mortas, respectivamente. FDA é um substrato esterase célula-permeável que mede tanto a actividade enzimática e a integridade da membrana celular. O iodeto de propídio liga-se ao ADN, mas só é capaz de penetrar as membranas comprometidas de células mortas ou a morrer. As células foram fotografadas utilizando um microscópio Leica TCS SP5 confocal e a área de percentagem de células mortas por microagregados foi quantificada utilizando software de imagem-J (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Um mínimo de 10 microagregados foram analisados ​​por ponto de tempo.

Alamar Blue e WST-1 ensaios de viabilidade celular

Para estabelecer o metabolismo das células ao longo de 14 dias de crescimento microagregados, o azul Alamar (Invitrogen) ensaio foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Nos dias 1, 3, 7 e 14 foi adicionado um volume de 3% de Alamar Blue por cavidade. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 1 hora e 100 ul de meio transferido para uma placa de 96 poços preta. A fluorescência (excitação 544 nm, emissão a 590 nm) foi detectada utilizando um leitor de placas (BMG Omega, o BMG LABTECH). WST-1 (Roche), foi utilizada para quantificar a viabilidade de RWPE-1 e RWPE-2 células cultivadas em diferentes tipos de médias. As células foram cultivadas durante 3 dias, seguido pela adição de 10% de WST-1, durante 1 h antes de ler a absorvância a 450 nm num leitor de placa de referência Além disso, Bio-Rad.

ensaio PicoGreen.

o ensaio de PicoGreen (Invitrogen), utilizado como uma medida de células viáveis ​​através da detecção de ADN de cadeia dupla totais, foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o DNA foi extraído com 0,5 mg /ml de Proteinase K (Roche) tamponada com fosfato de EDTA (PBE). As amostras foram diluídas (1:10) em solução com ARNase A (Invitrogen) e incubou-se com o reagente de ensaio de PicoGreen antes de ser lida num leitor de placas de fluoresccia (BMG Omega, o BMG LABTECH; excitação 485 nm, emissão 520 nm).

Droga tratamentos

células LNCaP foram semeadas em placas de 48 poços com ou sem insertos de PDMS e cultivadas durante dois dias antes do tratamento com diluições de 0,01-1000 nM de docetaxel (Sigma-Aldrich) durante 72 h, que foram comparados com um controlo de veículo de DMSO. O protocolo de Alamar azul foi adaptado para ler dentro da placa através do PDMS Limpar Insert, utilizando 10% de Alamar azul e incubando durante 2 horas. Uma diluição em série de células demonstraram que a fluorescência foi em relação ao número de células (valor de R-quadrado de 0,99; dados não mostrados). O IC50 foi calculado usando o pacote CalcuSyn Estatística (Biosoft, UK) conforme relatado anteriormente [17].

cultura 3D de células RWPE-1 em Matrigel da membrana basal da matriz

RWPE-1 as células foram cultivadas em Matrigel (BD Biosciences) durante 7 dias para avaliar polaridade. Este método tem sido utilizado anteriormente [18], [19]; Resumidamente, RWPE-1 As células foram semeadas em 1% ou 8% de Matrigel na presença de meio de queratinócitos-SFM suplementado com 2% de BPE (Gibco). A polaridade de células cultivadas em Matrigel mais ou menos micropoços inserção foi comparado.

Resultados e Discussão

O sistema de micropoços PDMS produz microagregados de câncer de próstata de uniforme e tamanho controlado

A objetivo deste trabalho foi produzir um sistema PDMS microagregados de alto rendimento para o teste de drogas terapêuticas para o câncer de próstata. Inicialmente, procurou-se caracterizar o crescimento de células de cancro da próstata no sistema de micropoços e comparar a morfologia, e a taxa de crescimento homólogos celulares normais. PDMS é um polímero inerte que é cada vez mais utilizado em aplicações de cultura de tecido [20]. É apropriado porque é barato e compatível com a metodologia de fabrico rápido tais como litografia macia [21]. PDMS superfícies foram moldadas e utilizado em aplicações de cultura para controlar a forma e tamanho de células individuais [22], e especificamente micropoços formado a partir de PDMS foram utilizadas para o fabrico de células agregados para melhorar a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas em células neuronais [23 ], [24] e as células-tronco mesenquimais em osteoblastos ou condrócitos [13], [24], [25]. Este estudo é o primeiro a cultura de células da próstata em uma superfície de micropoço para PDMS tamanho agregado controlada. células de cancro da próstata foram cultivadas como agregados 3D de dimensões rigorosamente controladas utilizando um micro-PDMS superfície composta de 600 micro-poços /cm

2, sendo cada um deles 360 uM por 360 uM (Figura 1A). A superfície de micropoços foi modificado com 5% de Pluronic ou multi-camadas (Figuras 1B e C). Ambos os revestimentos de superfície bloqueada a adesão de células de superfície e promoveu a formação de microagregados. Agregados formados a partir de células LNCaP permaneceram viáveis ​​e aumento no metabolismo ao longo de 7 dias a taxas comparáveis ​​às células crescidas em cultura 2D (Figuras 1B e C). Em um dia, depois as células foram semeadas 50.000, células LNCaP formado microagregados uniformes de 70 um de diâmetro (Figura 2A). Mais de uma cultura sete dias os agregados cresceu uniformemente para ser de 120 um de diâmetro. Isto parecia ser um diâmetro limitante e o tamanho não aumentar substancialmente com mais de cultura (Figura 2A). células RWPE-2 formado agregados significativamente menores de 60 mm no dia um, e os microagregados não aumentar em diâmetro com mais de 14 dias (Figura 2A). O diâmetro das células RWPE-1 não foi medido como os agregados eram instáveis, dissociando em aglomerados soltos de células após três dias em cultura. células RWPE-1 e RWPE-2 foram cultivadas em RPMI + FBS a 5% PS em vez do seu meio de crescimento recomendado, de queratinócitos-SFM, a fim de optimizar a formação dos microagregados. Neste último meio as células RWPE-1 e RWPE-2 formado aglomerados dispersos de células com uma elevada percentagem de células mortas após 7 dias (Figura S1A). Alteração do meio de crescimento não teve efeitos adversos significativos sobre o metabolismo celular em comparação com a média recomendada (Figura S1B). Portanto, RPMI 1640, FBS a 5% + P /S foi utilizado em todas as outras experiências

(A) Os diâmetros de LNCaP e agregados celulares RWPE-2 foram medidos ao longo de 14 dias.; média +/- SD, n = 50 de * p 0,05, um teste t de Student pareado foi usado para mostrar diferenças significativas de diâmetro no dia 7 e 14. (B) FDA mancha /PI foi utilizado para corar células viáveis ​​verde e células mortas vermelhos nos dias mostrados e a área de percentagem de células mortas por microagregados foi quantificado para mostrar que as células da próstata não cancerosas (RWPE-1) têm morte maior celular (percentagem pixels vermelhos) nas inserções de microcavidades em comparação com o da próstata células cancerosas (LNCaP e RWPE-2); média +/- SD, n = 10. Um emparelhado teste t de Student foi utilizado para calcular significado * p 0,05. (C) As imagens confocais e imagens de contraste de fase (Fase Dia 14) mostram que as linhas celulares de cancro da próstata (RWPE-2 e LNCaP) crescem microagregados lisas como compactos até ao dia 14. Por outro lado, as células não cancerosas forma (RWPE-1) dispersos aglomerados soltos que são não-viável e sem diâmetro definível no dia 14. a barra de escala é de 100 mm.

células cancerosas da próstata são viáveis ​​no sistema micropoços PDMS e têm uma taxa de proliferação inferior em relação ao monocamada

a viabilidade dos microagregados de próstata foi avaliada durante 14 dias através do cálculo da percentagem de células mortas com respeito às células vivas (Figura 2B) a partir da FDA /PI coradas microagregado imagens confocais (Figura 2C). Os resultados de corante FDA mostram que os tipos de células de câncer de próstata, LNCaP e RWPE-2, têm uma membrana celular intacta ao longo de 14 dias. Em contraste, a linha celular não cancerosa, RWPE-1 mostra um aumento proporcional nas membranas celulares lisadas, ao longo de 14 dias e exibir organização solto (dia 14 fase). Correspondentemente, microagregados LNCaP demonstrar um aumento no metabolismo ao longo de 14 dias (Figura 3A) e um aumento no conteúdo de DNA (Figura 3B). No entanto, RWPE-2 microagregados evidenciam uma nítida diminuição no metabolismo (Figura 3C) e uma diminuição no conteúdo de DNA (Figura 3D), apesar de ter membranas celulares intactas de acordo com a coloração com FDA (Figura 2B). Portanto, as células RWPE-2 são susceptíveis de estar num estado dormente de células, sem a divisão celular ou a morte celular. Isto é apoiado pelos dados dos microagregados de colagem, o que mostra que RWPE-2 microagregados não aumentou significativamente de diâmetro (Figura 2A). Para os dados 2D celular RWPE-2, houve uma fraca correlação entre os ensaios, apesar da clara correlação entre os ensaios para os dados 3D; em 2D do metabolismo diminuiu após o dia 3 (Figura 3C), no entanto o teor de ADN continuaram a aumentar até ao dia 14 (Figura 3D). Isto indica que as células eram ainda capazes de se dividir e, por conseguinte, não foram nutriente fome, mas mostra uma correlação pobre entre estes ensaios, que foi previamente documentada [26]. No entanto, os dados de LNCaP Picogreen se correlacionam bem com os dados metabólicos de azul de alamar (Figura 3A e B). No geral, o metabolismo e a proliferação de todas as células foi inferior em comparação com 3D monocamada (Figura 3), o que é consistente com estudos anteriores [9]. A superfície 2D proporciona uma grande área de superfície para a fixação, o que é um pré-requisito para a divisão celular sucesso isto é, pontos focais adesão de ancoragem são fornecidos para as células em divisão, que são necessários para a proliferação [27]. No entanto, isto dá uma falsa representação de a taxa de divisão num tecido e a taxa de replicação 3D inferior é mais análogo às taxas de proliferação de tumores.

A viabilidade de células LNCaP (A e B) e RWPE-2 (C e D) microaggreagtes contra o mesmo número de células cultivadas em 2D foi avaliada por meio de azul de Alamar (a e C) e o ensaio de PicoGreen (B e D). microagregados LNCaP demonstrar um aumento no metabolismo ao longo de 14 dias (a) e um aumento no teor de DNA (B). No entanto, RWPE-2 microagregados mostram uma diminuição no metabolismo de (C) e uma diminuição no conteúdo de DNA (D). A média +/- SD; n = 4. Os dados representam três experiências. * P 0,05, um teste t de Student pareado foi utilizado para determinar a significância entre 2D e 3D

linhas de células da próstata cultivadas como microagregados exibir pobres polaridade semelhante aos tumores

Os microagregados eram. fixado no dia 7 e imunocoradas para a apical (e-caderina e β-catenina) e basal (α6-integrina e laminina-5) marcadores de polaridade 3D (Figura 4). Estes marcadores foram selecionados de acordo com seu uso anterior como marcadores apical e basal de superfície em sistemas de matriz 3D [18], [28] – [30]. A partir destes dados, é claro que todos os microagregados não têm um lúmen oco e não formar estruturas polares, com apenas laminina-5 sendo observada numa posição esperada para um agregado polar, que estava na superfície basal na borda externa de a microagregados (Figura 4 LM-5). A fim de verificar que os anticorpos estavam trabalhando linhas de células cultivadas em monocamada foram também imunomarcadas para os mesmos marcadores de polaridade e fotografada usando confocal-Z corte (figura S2). Como esperado, a laminina 5 e α6-integrina manchar a superfície basal de todos os tipos de células cultivadas em monocamada, com alguma coloração citoplasmática (Figura S2B setas pretas). e E-Cad e β-catenina são predominantemente expresso na célula para junções celulares (setas brancas Figura S2B). microagregados ou esferóides 3D polares são definidas por uma superfície apical que rodeia um lúmen oco e uma superfície basal, que se ligaria à matriz circundante [18]. O sistema de micropoços é desprovido de matriz, para além de quaisquer proteínas de matriz solúvel secretada de células e não há andaime para fixação e, por conseguinte, a falta de uma superfície basal claro. Por conseguinte, é previsível que os microagregados falta um lúmen oco e, portanto, uma superfície apical como tensão matriz contribui para a organização tecidual [31], no entanto, algum grau de organização celular exsists. Por exemplo, células LNCaP, células RWPE-1 e 2 expressar laminina-5 na superfície exterior agregado, mas não expressam α6-integrina. Além disso, E-caderina e β-catenina foram encontrados expressos entre as adesões celulares de LNCaP e RWPE-2 microagregados (Figura 4), mas não há nenhuma superfície luminal e, portanto, não há expressão destes marcadores a uma superfície apical. Assim, as células são capazes de expressar estes marcadores fenotípicos mas requer outros sinais, susceptíveis de uma matriz extracelular ou células vizinhas, tais como estariam presentes no microambiente tumoral, para formar ácinos tecido organizado [32]. Apesar de não existirem diferenças nítidas entre as linhas de células cancerosas e não cancerosas, o fenótipo observado é mais indicativo da célula cancerosa diferenciado-de observado no cancro da próstata de alto grau, indicando que o ensaio é ainda adequado para alta teste de drogas rendimento de cancro da próstata células. No entanto, este sistema não é viável para a cultura de linhas de células não neoplásicas, devido à ausência de matriz. Mas, com a adição de Matrigel para o sistema de micropoços PDMS, a linha de células de próstata normais, RWPE-1, formaram agregados que exibiam polaridade (Figura S3A e S3B). Com a adição de 8% de Matrigel os agregados RWPE-1 apresentada organização polar com a expressão basal de α6-integrina (Figura S3B) e esta polaridade foi mantida com 1% de Matrigel (Figura S3A). No entanto, os microagregados cultivadas em PDMS insere com Matrigel foram maiores em comparação com aquelas cultivadas em inserções isoladamente (Figura S3C) ou em 8% Matrigel sozinho (Figura S3D). Portanto, a adição de Matrigel proporciona uma matriz para induzir a polaridade α6-integrina, que foi perdido em células RWPE-1 cultivadas em PDMS modificados sozinhos. Alfa-6-integrina foi mostrado ser importante para a formação de ácino em células RWPE-1 [33], daí, a falta de α6-integrina pode contribuir para a má formação dos microagregados exibida por células normais RWPE-1.

Os microagregados foram fixados no dia 7 e histoquímica para marcadores de polaridade apical e basal (verde). E-caderina (E-Cad) e β-catenina foram usadas como marcadores apicais e basais eram os marcadores α6-integrina (α6-INT) e laminina 5 (LM5). Os núcleos foram coradas com DAPI (magenta) e a barra de escala é de 100 mm.

O sistema de micropoços PDMS pode ser usado para controlar núcleo apoptótica

células

LNCaP cultivados no sistema de micropoços ( 360 × 360 mm), que atingem um tamanho máximo de 120 uM não formam um núcleo apoptótico como identificado por caspase-3 clivada coloração no dia 7 (Figura 5A). No entanto, o núcleo apoptótico pode ser controlada pelo aumento do tamanho do micro-well a 800 ^ m e o aumento do número de células de semeadura para 2000 células por agregado. Isto criou agregados de -300 um de diâmetro ao longo de 7 dias com um núcleo central de caspase-3 clivada coloração (Figura 5B). Um núcleo apoptótico é normalmente observada em culturas em 3D de maior do que 500 a 600 um de diâmetro [34] – [36] no entanto núcleos apoptóticos foram observadas, mesmo nos agregados de células LNCaP de 200 um de diâmetro [37]. A variação em observações reflectir o facto de que a entrega eficaz de oxigénio é uma função de muitas variáveis, incluindo o número total de células de cultura, e a altura do meio, bem como diâmetro total [38]. Nos nossos estudos, inoculadas os agregados de maior diâmetro com 6 os números de células vezes maiores do que os agregados mais pequenos, e devido à relação cúbica na equação raio do volume (V = 4 /3πr

3) isto resultou em apenas menos do que uma duplicação do diâmetro total (Figura 5C). As células em proliferação foram anteriormente mostrado para ser concentrada na periferia dos agregados LNCaP de 200 um cultivadas utilizando a técnica de sobreposição de líquido de agar [36]. No nosso estudo foi utilizada a coloração de Ki67 para revelar que as células em proliferação podiam ser encontradas uniformemente ao longo do agregado e que estas células não foram concentradas em qualquer uma área específica (Figura 5D), talvez devido à ausência de uma superfície basal é fornecida por uma superfície de matriz . Portanto, temos demonstrado que podemos controlar para o núcleo por apoptose utilizando micropoços de tamanhos diferentes e que a proliferação é distribuído uniformemente ao longo dos microagregados

(A) caspase-3. (CASP3; verde), um marcador de apoptose, foi utilizado para corar secções de RWPE-1, 2-RWPE microagregados e LNCaP. (B) Devido à ausência de caspase-3 clivada nos pequenos agregados LNCaP, uma grande de micropoços (800 um x 800 um x 800 mm) foi utilizada para criar grandes microagregados LNCaP com um núcleo apoptótico (CASP3 LGE). (C) O diâmetro dos microagregados LNCaP (Sml) foi comparada com microagregados LNCaP crescidas nos grandes micropoços (Lge). Um mínimo de 50 agregados foram medidos por condição. (D) de Ki67 (verde) foi também utilizado para corar células que proliferam dentro do grande agregado de LNCaP. Os núcleos foram coradas com DAPI (magenta); barra de escala é de 100 mm.

Cultura de células de câncer de próstata como microagregados 3D aumenta a resistência aos medicamentos, que é atribuída a diferenças na proliferação

células LNCaP foram cultivadas em 2D ou os micropoços PDMS durante 2 dias antes do tratamento com drogas. Até 1000 nM de docetaxel foi adicionado e em comparação com um veículo de controlo DMSO. Docetaxel foi usado como uma droga contra o câncer representante neste estudo devido ao seu uso rotineiro no tratamento do câncer de próstata [39]. Ela impede a montagem do fuso mitótico e divisão mitótica da célula, o que leva à apoptose, por diminuição da quantidade de tubulina livre necessário para a formação de microtúbulos [39]. As células cultivadas em 3D foram mais resistentes a todas as doses de docetaxel do que os cultivados em 2D após 48 horas (Figura 6A). Às 72 horas só foram observadas diferenças nas doses elevadas de droga de 10 e 100 nM de docetaxel (Figura 6B). Com um tempo de incubação mais longo droga a IC50 aumentou de 2D e 3D. Por exemplo, em 2D em 48 horas a IC50 foi de 11 nM e este aumentou para 51,3 nM durante 72 horas. Em 3D, o IC50 foi excepcionalmente alta, indicando que os microagregados 3D são altamente resistentes ao docetaxel, o IC50 calculada às 48 horas foi de 4,3 × 10

8 e 426 nm, às 72 horas. Com doses crescentes de docetaxel as células em 3D mantido a sua agregação, mas tornou-se mais livremente associadas, mas em 2D as células isolada (Figura 6C). Tem sido relatado para vários tipos de cancro que culturas 3D mostram maior resistência a agentes quimioterapêuticos [9] [40], e que em 3D, as células LNCaP são mais resistentes ao docetaxel do que os seus homólogos em monocamada [9]. Além disso, mostrámos que as células LNCaP crescidas em 3D permite uma replicação mais baixo em comparação com os seus homólogos 2D (Figura 3B) e são, portanto, mais resistentes ao docetaxel, que tem como alvo células de proliferação [41]. Mostrámos que estes efeitos são temporários e que quando 7 dias de idade microagregados são devolvidos a um substrato de plástico 2D como uma suspensão de célula única que exibem o mesmo perfil de resposta à dose como células cultivadas em 2D (Figura S4). Esta penetração de drogas em 3D-sistemas é mais lenta em comparação com uma única monocamada de células, o que faz com que seja mais comparável à de tumores sólidos [42]. Com efeito de penetração de drogas em tumores sólidos é normalmente de 5 a 10 vezes mais lenta do que em culturas em monocamada [43].

células LNCaP (50000 células /poço) foram tratadas com docetaxel durante 48 horas (A) ou 72 horas (B) no dia 2 de crescimento, quer em 2D e 3D. Alamar Blue foi usada para avaliar a viabilidade celular. Significa +/- SE, n = 4 réplicas biológicas * P 0,05; Os dados mostrados são representativos de três experiências independentes. (C) imagens de contraste de fase mostram os efeitos de docetaxel após 72 horas sobre a morfologia dos microagregados (3D) em comparação com células cultivadas em monocamada (2D).

Resumo

Resumindo, o sistema de PDMS pode ser utilizado para regular as dimensões de microagregados de células de cancro para replicar diferentes fases de crescimento do tumor. O sistema de micropoços produz microagregados de câncer de próstata de dimensões rigorosamente controladas através de um micro-superfície PDMS, composto por 600 micro-poços /cm

2, sendo cada 360 mm por 360 mm. modificação da superfície com 5% plur�ico ou multi-camadas de blocos de adsorção de proteínas e fixação das células para os PDMS, e isso promove a formação dos microagregados. agregados LNCaP foram viáveis ​​e o número de células nos agregados aumentou ao longo do tempo. Apoptótica no núcleo de células LNCaP agregados pode ser controlada utilizando um pequeno (360 × 360 mm) ou grande (800 × 800 uM) micropoços de dimensão. Os microagregados de cancro, formados a partir de LNCaP e células RWPE-2 não têm polaridade tal como seria observado em um tumor, enquanto as células normais RWPE-1 formam uma superfície basal, como identificado por expressão α6-integrina após a adição da matriz Matrigel às placas de microcavidades. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.