Abstract
O aumento da expressão do receptor de angiotensina II tipo 2 (AT2R) induz a apoptose em numerosas linhas de células tumorais, com qualquer regra II-dependente ou Angiotensina II independente da angiotensina, mas seu mecanismo molecular permanece mal compreendido. Aqui, utilizamos a análise de matriz PCR para determinar os perfis de expressão gênica e microRNA em linhas de células de câncer de próstata humanas transduzidas com AT2R adenovírus recombinante. Nossos resultados demonstraram que AT2R sobre a expressão leva a aumento da regulação de 6 genes relacionados com a apoptose (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2), 2 genes de citocinas (IL6 e IL8) e 1 microRNA, e para baixo-regulação de um TNFSF10 gene relacionado com a apoptose e 2 genes de citoquinas (BMP6, BMP7) em células DU145 transduzidas. HRK foi identificado como um gene sobre-regulada em células PC-3-transduzidas AT2R por em tempo real de RT-PCR. Em seguida, utilizamos siRNAs para silenciar os genes regulados positivamente para continuar a determinar os seus papéis no AT2R superexpressão apoptose mediada. Os resultados mostraram regulação negativa de Gadd45a reduziu o efeito apoptótico de ~ 30% em células DU145, a regulação negativa de HRK reduziu a apoptose mediada por AT2R por mais de 50% em células PC-3, enquanto que a regulação negativa de TRAIL-R2 aumentada mediada por apoptose mais de AT2R 4 vezes em células DU145. Descobrimos também que os efeitos sobre a apoptose mediada por AT2R causados pela regulação negativa da Gadd45a, TRAIL-R2 e HRK eram independentes na ativação de MAPK p38, p44 /42 MAPK e p53. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstraram que o TRAIL-R2, e Gadd45a HRK podem ser novos genes alvo para um estudo mais aprofundado do mecanismo de apoptose mediada por AT2R em células de cancro da próstata
citação:. Pei N, Jie F, Luo J, Wan R, Zhang Y, Chen X, et al. (2014) Gene Expression Profiling Associated com angiotensina II Tipo 2 Receptor-Induced apoptose em células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 9 (3): e92253. doi: 10.1371 /journal.pone.0092253
editor: Gangjian Qin, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América
Recebido: 06 de dezembro de 2013; Aceito: 19 de fevereiro de 2014; Publicação: 21 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Pei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Natural Science Foundation da China Grant 81072113 (HL), Nacional 863 alta técnica Projetos de Desenvolvimento da China Grant 2012AA02A403 (HL), Estado-chave do Laboratório Pathogen e Biossegurança Programa SKLPBS1103 (HL), bem como pelos prémios 2011A091000022, 2010B060500001 , 2011B060300028 e 2011B060300014 para WG do governo chinês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer
próstata é a forma mais comum de câncer em homens norte-americanos e é a segunda principal causa de morbidade e mortalidade por cancro em os EUA [1], embora o seu prognóstico melhorou por causa dos avanços em técnicas de diagnóstico e cirúrgicos . Até à data, vários tipos de terapias para pacientes com cancro refractário a hormonas tenham sido estudadas, mas nenhuma terapia eficaz tem sido relatada. Assim, são urgentemente necessárias novas estratégias de tratamento para o cancro da próstata.
A angiotensina II (Ang II) é o efectora chave no sistema renina-angiotensina. Ang II tem dois receptores: Ang II tipo 1 e tipo 2 receptores (AT2R) [2]. AT2R, a segunda isoforma do receptor principal, é expresso principalmente no mesênquima do feto e de uma forma limitada em tecidos adultos [3]. está bem estabelecido que a expressão aumentada de AT2R induz a apoptose em diversas linhagens de células, tais como feocromocitoma, fibroblastos, células do músculo liso e células endoteliais, quer através de regra II-dependente ou Ang II independente Ang [4] – [11]. Os nossos estudos anteriores revelaram que AT2R sobre a expressão induzida de forma significativa a apoptose em células de cancro da próstata [12]. Um estudo recente indica que a administração intratraqueal de uma terapia baseada em nanopartículas com o gene AT2R atenua o crescimento do cancro do pulmão, e o efeito é melhor do que TRAIL [13]. Apesar do sucesso no delinear o papel fisiológico, as acções moleculares e celulares da apoptose AT2R-mediata permanecem indefinidos. Aqui, usamos análise em tempo real PCR array para o perfil de um grande número de genes e microRNAs envolvidos na apoptose induzida AT2R em linhas celulares de cancro da próstata.
Neste relatório, entre genes que podem estar relacionados na via apoptose, há 7 gene relacionado com a apoptose, 4 citocinas e 1 expressões de microRNA que foram mudados em AT2R sobre as células de câncer de próstata expressa em comparação com o controle. apoptose induzida por AT2R em células DU145 foi reforçada quando TRAIL-R2 foi derrubado. No entanto, os efeitos apoptóticos mediadas por AT2R foram reduzidas em células DU145 quando Gadd45a foi silenciada. Curiosamente, quando HRK foi silenciada, a apoptose induzida por AT2R foi reduzida em células PC-3. O nosso estudo indicou também que os efeitos sobre a apoptose mediada por AT2R causadas por sub-regulação de TRAIL-R2 e HRK eram independentes na activação da MAPK p38, p44 /42 MAPK e p53. Nosso estudo deve contribuir para a identificação de fatores de AT2R-sensing implicados na via apoptótica em células de câncer de próstata, e nos ajudar a entender a apoptose-driven AT2R melhor, fornecendo genes alvo putativos para estudos posteriores.
Materiais e Métodos
Cultura de células
linhas de células cancerosas humanas da próstata (PC-3 e células DU145) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). As células de PC-3 foram cultivadas em meio F-12 e células DU145 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% sob 5,0% de CO
2. Sera e meios de comunicação foram adquiridos da Invitrogen e American Type Culture Collection
recombinante adenoviral Construção e Preparação
vectores adenovirais recombinantes foram construídos, preparado, e titulado como descrito anteriormente [14]:. Um vector adenoviral contendo o gene da proteína fluorescente verde melhorada controlada por um promotor de citomegalovírus (Ad-CMV-EGFP) e de ADN de um vector adenoviral contendo AT2R genómico (L-AT2R) com intrões 1 e 2 e a região de codificação e o gene da proteína fluorescente verde melhorada controlada por citomegalovírus promotores (Ad-G-AT2R-EGFP).
celular Tratamento
Para a transdução viral, células cancerosas da próstata (4 × 10
5) foram semeadas em seis bem-cultura de tecidos Corning pratos. No dia seguinte, as células foram transduzidas com Ad-L-AT2R-EGFP ou o controlo do vector Ad-CMV-EGFP e alterações na morfologia celular foram observadas utilizando um microscópio de fluorescência Olympus BX41. As células transduzidas foram usadas 24 a 48 horas mais tarde, dependendo do protocolo específico
.
Para estudos do pequeno ARN interferente (siRNA), DU145 e PC-3 foram transfectadas quer com TRAIL-R2, GADD45A, TP53BP2, HRK ou ARNsi de controlo utilizando Lipofectamina Reagent (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. Todos os ARNsi foram adquiridos de Qiagen. Estes tratamentos foram seguidos 24 horas depois por transdução com Ad-L-AT2R-EGFP (200 IFU /célula) e depois, 48 horas mais tarde, o número de células apoptóticas ou de genes relacionados com apoptose /proteínas foram examinados.
Isolamento de ARN e em tempo real de RT-PCR
o ARN total foi isolado a partir de células DU145 e PC3 tratadas utilizando RNeasy Mini-kit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. ARN isolado foi submetido a tratamento com DNase I (OMEGA Biotek, Norcross, EUA) para remover ADN genómico. A concentração de ARN foi determinada por um Espectrofotómetro ND-1000 (Nanodrop, Rockland, DE, EUA), e a pureza do RNA foi confirmada por 260/280 valor de densidade óptica de 1,8-2,0. As amostras de RNA foram avaliadas para o estado de degradação por electroforese em gel de agarose. O RNA isolado foi então convertido em cDNA com Oligo dT e PrimeScript transcriptase reversa (TAKARA, Dalian, China) regentes. Fluorescente PCR quantitativo foi realizado com a condição de termo-ciclagem: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C e 34s a 60 ° C. As amostras foram analisadas com o tempo real do sistema de PCR ABI 7500 (Applied Biosystems) e submetido a △△ método comparativo C
T usando a GAPDH humana como padrão interno. Em tempo real produtos de PCR (8 ul) foram carregadas em gel de agarose 2,5% contendo brometo de etídio.
análise de expressão gênica apoptose Usando Real-Time PCR array
A síntese da primeira cadeia de ADNc foi realizada com RT
2 kit First Strand (C-03), em conformidade com o protocolo fornecido pelo fabricante (SABiosciences, Frederick, MD, EUA) as amostras de cDNA foram .A então pesquisados quanto à expressão de 84 genes-chave envolvidos na apoptose pela meios de apoptose humano RT
2 Profiler PCR array (HAP-012A; Superarray, Frederick, MD, EUA) num 7500 em tempo real do sistema de PCR da ABI (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com o fabricante de protocolos. Para obter dados estatisticamente, analisou-se o controlo e amostras experimentais em cada um dos dois intervalos de tempo, em triplicado. As expressões de genes alvo foram medidos em relação ao ciclo limiar significativo (C
T) de valores de calibrador cinco genes diferentes (B2M, GAPDH, HPRT1, RPL13A e ACTB). Os resultados foram expressos como a variação relativa de vezes a expressão do gene no grupo conduzida AT2R em comparação com o grupo de controlo. Genes com vezes relativamente muda superior a ± 2 foram consideradas como o aumento ou regulada para baixo em expressão. Genes que renderam um valor de p 0,05 foram consideradas para apresentar significância estatística para o estudo
Análise citocinas humanas Usando Real-Time Matriz e PCR em tempo real RT-PCR
A. amostras de cDNA foram também pesquisados quanto à expressão de 84 citocinas focada no percurso e por meio de RT
2 matriz Profiler PCR citocinas humanas comum (HAP-021A; Superarray, Frederick, MD, EUA) num ABI 7500-PCR em tempo real sistema (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com os protocolos do fabricante. As experiências foram realizadas uma vez entre as células DA-L-AT2R-EGFP-transduzidas e células-EGFP-induzidas CMV anúncio para pesquisar citocinas em geral.
em tempo real de RT-PCR foi utilizado para validar o perfil de expressão. Os genes foram escolhidos com base nas suas possíveis funções fisiológicas e na medida em que eles foram regulados pela sobreexpressão de AT2R. Iniciadores oligonucleotídicos e sondas Taqman específicos para a proteína Bcl-2, IL-6 e IL8 foram obtidos de Applied Biosystems. Isolamento de ARN total foi realizado tal como descrito acima. RNA purificado (25 ng) foi utilizado para fazer de RT-PCR em uma Prism 7000 Sequence Detection System Applied Biosystems, com a utilização de um passo de RT-PCR master mix-reagentes. Expressão do gene GAPDH de limpeza foi utilizada para normalizar a expressão do mRNA. A quantificação e análise da expressão do gene foi determinada usando o método comparativo ciclo limiar (C
T), conforme descrito no boletim do utilizador Applied Biosystems 2 #. Os iniciadores utilizados para detectar os níveis de outras citoquinas são mostrados na Tabela 1 e PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara) regentes tal como descrito acima.
Análise MicroRNAs humano utilizando Real-Time matriz de PCR e em tempo real de RT-PCR
Para quantificar a expressão de miARN, o RNA total foi extraído a partir de células dA-L-AT2R-EGFP-transduzidas e induzidas por Ad-CMV-EGFP com RNeasy Mini-kit (Invitrogen ). O RNA total isolado foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de OneStep PrimeScript miARN de síntese de ADNc (Takara, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de ADNc foram pesquisados quanto à expressão de 88 centrada no percurso miARNs miScript miARN PCR matriz PathwayFinder cancro humano (MIHS-102Z; Frederick, MD, EUA). Em uma 7500-PCR em tempo real do sistema ABI
microARNs foram analisados ainda mais com base em seus possíveis papéis no cancro e a expressão que foram significativamente regulada no sistema array miRNA PCR. Este limite foi escolhido para reduzir o número de genes a um número mais trabalhável e a concentrar-se nos genes cuja expressão foi alterada substancialmente. Usando esses critérios, fomos capazes de estreitar nosso foco para 14 seguintes miRNAs: hsa-miR-let7c; HSA-miR-let7e; HSA-miR-21; HSA-miR-125; HSA-miR-126; HSA-miR-146; HSA-miR-150; HSA-miR-182; HSA-miR-183; HSA-miR-193; HSA-miR-767; HSA-miR-149; HSA-miR-100; HSA-miR-32. A expressão relativa foi calculada através do método de ciclo limiar comparativa (C
t) usando a expressão de ARN nuclear pequeno U6 como referência. A Uni-miR qPCR iniciador foi incluída no kit. A quantidade de miARN foi monitorizada com ‘SYBR Premix Ex Taq II (perfeito Tempo Real) (Takara, Japão). As condições de PCR foram 30 s a 95 ° C, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30s.
A apoptose Avaliação
O número de células fluorescentes verdes que exibem -apoptótica induzida por morfologia como AT2R apoptose mediada após transfecção de siRNAs foi avaliada pela contagem das células a partir de 10 campos aleatórios por poço. As contagens foram feitas por um indivíduo que foi cegado quanto ao tratamento.
Western Blot Analysis
imunotransfer�cias ocidentais foram executados como descrito anteriormente [15]. Os anticorpos primários e as suas fontes, foram as seguintes. MAPK p38 anti-total, o p53 anti-total, o p44 anti-Total /42 MAPK, p44 anti-fosforilada /42 (pp44 /42) MAPK, p53 e anti-fosforilado (pp53) foram de Cell Signaling Technology. p38 anti-fosforilado (pp38) MAPK era da Millipore. -Anti-β actina e a anticorpos secundários de rábano anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase e anti-IgG de coelho eram da Sigma-Aldrich. IgG anti-cabra foi de Santa Cruz Biotechnology.
Análise Estatística
Para todas as experiências, a transdução viral foi feito em poços em triplicado e repetidos pelo menos três vezes. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) de 3 a 5 experiências independentes. A análise estatística foi realizada com SPSS 13.0. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste T quando apenas dois grupos foram comparados, e por ANOVA quando 3 ou mais grupos foram comparados. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
adenoviral-mediada expressão de AT2R em células cancerosas da próstata
No nosso estudo, as células DU145 infectadas com Ad-G-. AT2R-EGFP (100 IFU /celular, 2 dias) exibiu um grande número de células apoptóticas em comparação com o vector de controlo (Fig. 1A, B, C, D), consistente com o nosso relatório anterior [12]. Em seguida, PCR em tempo real foi utilizada para determinar a expressão relativa da AT2R. Os nossos resultados mostraram que AT2R foi significativamente sobre-expresso em DU145 Ad-L-AT2R-EGFP-transduzidas ou
células DU145 células de uma forma dependente da dose (Tabela 2 e Fig. 1E, F). PC-3 foram transduzidas com Ad-L-AT2R-EGFP (B e D) e o Ad-CMV-EGFP (a e C) (100 IFU /célula) durante 2 dias, e a morfologia das células foi examinada sob um microscópio de fluorescência. Barras de escala, 50 um. O ARN total foi extraído a partir de células transduzidas e DU145 foram detectados por AT2Rs tempo real de RT-PCR. Etídio géis corados com brometo de mostrar AT2R (E) e transcrições GAPDH (F) em células transduzidas. H, 2000 DL ADN Maker (Takara); 1, 3, 5, 7, 9: transduzidas com 10, 20, 50, 100, 200 IFU /célula separadamente de Ad-L-AT2R-EGFP; 2, 4, 6, 8, 10:. Transduzidas com 10, 20, 50, 100, 200 IFU /célula separadamente de Ad-CMV-EGFP
TRAIL-R2 e Gadd45a Contribuir a apoptose em células DU145
análise array
a PCR foi realizada para determinar os efeitos moleculares de expressão em células DU145 AT2R Induzido por AT2R. Dos 84 genes representados na apoptose humano RT
2 perfis de matriz Profiler PCR, os níveis de 6 genes (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2) de expressão foram sobre-regulada e um gene (TNFSF10) foi regulada para baixo em células DU145 transduzidas com Ad-L-AT2R-EGFP (Tabela 3, Fig. 2). Estes genes expressos diferencialmente podem ser atribuídos aos genes que codificam o factor de necrose tumoral (TNF) ligando (TNFSF10), a família de receptores de TNF (TNFRSF10B), da família Bcl-2 (BAG3, BNIP1, HRK), bem como a proteína p53 tumor obrigatório proteína 2 (TP53BP2) e a paragem do crescimento e dano-ADN-induzível, alfa (Gadd45a). Curiosamente, a Bcl-2 não foi significativamente regulada em função matriz de análise de PCR. PCR em tempo real foi ainda utilizado para validade sua expressão. Os nossos resultados mostraram que não houve nenhuma alteração significativa na expressão de Bcl-2 em células DU145 Ad-L-AT2R-EGFP-transduzidas em comparação com células de Ad-CMV-EGFP-transduzidas (Fig. 3).
células tratadas com Ad-CMV-EGFP (200ifu /célula) foi utilizada como um controlo.
células DU145 foram transduzidas ou com Ad-L-AT2R-EGFP (AT2R) ou Ad-CMV-EGFP (EGFP ) para 2d em 200 IFU /célula. Estes tratamentos foram seguidas de isolamento de ARN total e, em seguida, em tempo real A análise de RT-PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos e sondas Taqman. Todos os dados foram normalizados em relação aos níveis de expressão de ARNm de GAPDH dentro da mesma amostra. Colunas, média de três experiências separadas.
tecnologia de interferência siRNA foi usado para determinar o papel dos quatro genes up-regulamentados, incluindo TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 e HRK, em AT2R apoptose induzida em células DU145 transduzidas. A transfecção destes ARNic em células DU145 diminuíram a expressão de ARNm (Fig. 4A). O tratamento de células DU145 com o siARN Gadd45a reduziu o efeito apoptótico em cerca de 30%, enquanto TP53BP2 siRNA e HRK siRNA não provocou diferença significativa na apoptose mediada por AT2R em comparação com os controlos. Curiosamente, o tratamento de células DU145 com o siRNA TRAIL-2 aumentou significativamente a apoptose induzida por AT2R mais do que 4 vezes em comparação com o ARNsi de controlo células transfectadas (Fig. 4B). Além disso, o aumento da apoptose não foi devida ao efeito directo de TRAIL-R2 ARNsi, uma vez que só TRAIL-R2 siRNA não causou resultados apoptóticas (dados não foram apresentados).
células DU145 foram transfectadas com TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 ou HRK siRNA (20 nmol /L) ou ARNsi de controlo (20 nmol /L), seguida de transdução com o Ad-L-AT2R-EGFP (100 IFU /célula) durante 2 d. (A) siRNAs mediada por diminuição da expressão de ARNm em células DU145 transduzidas; (B) células fluorescentes verdes com morfologia apoptótica, que foram contados a partir de 10 campos por bem .. Colunas, com média de três experiências; bares, SE. *, P . 0,05
Colectivamente, estes dados indicam que a apoptose induzida pela sobre-expressão AT2R é parcialmente dependente Gadd45a em células DU145. TRAIL-R2 pode ser um regulador negativo da apoptose induzida por AT2R em células DU145.
HRK contribui para Apoptose Induzida em-AT2R células PC-3
Considerando os genes regulados positivamente produzidos por sobre-expressão de AT2R em células DU145, que próxima explorado os efeitos da sobre-expressão em AT2R os genes em células PC-3 de tempo real de RT-PCR. Nós mostramos que os níveis de HRK (um gene pró-apoptótico) foram expressão aumentada nas células PC-3 de um modo dependente da dose e atingiu um nível muito elevado em 100ifu /célula (Fig. 5A).
a, expressão de ARNm HRK em células PC3 transduzidas com as doses indicadas. B e C, as células PC3 foram tratados com 20 nmol /L HRK ou ARNsi de controlo e Ad-L-AT2R-EGFP (200 IFU /célula), tal como descrito em Materiais e Métodos, seguido 48 h mais tarde por análise em tempo real de RT-PCR (B) de qualquer ARNm HRK ou avaliação de células com morfologia apoptótica semelhante a (C). Colunas, média de três experiências separadas em cada caso; bares, SE. *, P 0,05 contra as células de controlo
Para explorar o papel do HRK na apoptose induzida por AT2R em células PC3, HRK siARN foi transduzida em células PC-3 a diminuição na expressão de HRK (Fig. . 5B). O resultado mostrou downregulation de HRK em células PC-3 reduziu significativamente a apoptose induzida por AT2R por -45% (Fig. 5C).
O envolvimento de Gadd45a, TRAIL-R2 e HRK em Induzido por AT2R apoptose independente de MAPK p38, p44 /42 MAPK e p53
Além disso, investigamos a via de sinalização a jusante causada por AT2R sobre-expressão na apoptose celular. O nosso estudo anterior demonstrou que a expressão aumentada de AT2R induzir a apoptose através da activação da via de MAPK p38 [14]. Mas no presente estudo, a ativação da MAPK p38, p53 e p44 /42MAPK não foram observados em infra-regulação da Gadd45a e TRAIL-R2 apoptose induzida por AT2R mediada em células DU145 (Fig. 6A, 6B, 6C). Resultados semelhantes foram também observados em células PC3 (Fig. 7A, 7B, 7C). Estes indicam que o envolvimento de Gadd45a, TRAIL-R2 e HRK na apoptose mediada por AT2R foi independente da ativação de MAPK p38, p53 e p44 /42 MAPK.
células DU145 foram transfectadas com TRAIL-R2 siRNA
(pista 1),
Gadd45a
siRNA (pista 2)
, TP53BP2 siRNA
(pista 3)
, HRK siRNA
(pista 4)
, controle
siRNA (pista 5)
ou simulada
(pista 6)
seguido 24 h mais tarde por transdução com Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /célula). Após 2 d de incubação, as células foram recolhidas e submetidas a análises Western blot (representativos de três experiências diferentes). níveis (A) Expressão do total p44 /42, pp44 /42 e bandas de proteína p-actina. os níveis de (B) a expressão de p38 total, a pp38 e bandas de proteína p-actina. níveis de p53 total bandas de proteínas pp53 e p-actina de expressão (C).
células PC-3 foram transfectadas com HRK siRNA
(Lane1)
, controle
siRNA (Lane2)
ou simulada
(pista 3)
seguido 24 h mais tarde por transdução com Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /célula). Após 2 d de incubação, as células foram recolhidas e submetidas a análises Western blot (representativos de três experiências diferentes). (A) os níveis do total p44 /42, pp44 de expressão /42 andβ-actina bandas de proteínas. os níveis de (B) a expressão de p38 total, a bandas de proteínas pp38 andβ-actina. (C) os níveis de p53 total bandas de proteínas pp53 e p-actina de expressão.
As citocinas e expressão de microRNAs Validação
Up and down-regulada citocinas e microRNAs foram rastreados por Real- matriz time PCR em células DU145 transduzidas (Fig.8A, 9A). Em tempo real de RT-PCR foi utilizado para validar a expressão de citoquinas e microARN Profiling produzido por AT2R sobreexpressão em células DU145. Os genes e microARNs foram escolhidos com base nas suas mudanças de expressão, os quais foram obtidos a partir da análise de PCR de matriz, e os possíveis papéis fisiológicos sobre a apoptose e a proliferação. Os níveis de ARNm de IL8 e IL6 foram aumentados mais do que 2 vezes e 40%, respectivamente, em células DU145 transduzidas com Ad-L-AT2R-EGFP em comparação com células de Ad-CMV-EGFP-transduzidas (Figura 8B . C), enquanto BMP6 ( Fig. 8D), BMP7 (Fig. 8E) foram reduzidos em 50% e 45%, respectivamente, e a expressão de BMP1, BMP4, BMP8B, TGFB1, TGFB2 e TGFB3 (Fig.8F, 8G, 8H, 8J) não foram alterados significativamente . No que diz respeito ao microARNs, o resultado indicou que microARN 150 foi aumentado mais do que 5 vezes em células DU145 transduzidas com Ad-L-AT2R-EGFP em comparação com células de Ad-CMV-EGFP-transduzidas, enquanto outros microARNs não foi significativamente alterada (Fig. 9B). Estes resultados foram consistentes com os nossos dados de matriz miScript miRNA PCR.
células DU145 foram transduzidas com qualquer Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) ou Ad-CMV-EGFP (EGFP) por 2 d em 200 IFU /célula. Outros grupos de células foram falsamente transduzidas. A. Para cima e para baixo citocinas regulamentados foram rastreados por Real-time PCR matriz em células DU145. Análise em tempo real de RT-PCR de qualquer IL8 (B), IL-6 (C), BMP6 (D), BMP7 (E), BMP1 (F), BMP4 (L), BMP8B (H), TGFB1 (J), TGFB2 (J) e TGFB3 (J). Todos os dados foram normalizados em relação aos níveis de expressão de ARNm de GAPDH dentro da mesma amostra. Colunas, média de três experiências separadas; bares, SE. *, P 0,05.
células DU145 foram transduzidas com qualquer Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) ou Ad-CMV-EGFP (EGFP) por 2 d em 200 IFU /célula. Estes tratamentos foram seguidos por isolamento de ARNm e, em seguida, em tempo real A análise de RT-PCR de microARN seleccionado. Todos os dados foram normalizados contra a expressão de níveis U6 dentro da mesma amostra. Colunas, média de três experiências separadas; bares, SE. *, P 0,05 contra o Ad-CMV-EGFP-transduzidas. A. Para cima e para baixo microRNAs-regulados foram rastreados por Real-time PCR matriz em células DU145. B. Validação da expressão microRNA usando PCR em tempo real.
Discussão
Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que avalia claramente gene relacionado com a apoptose, citocinas perfis de expressão gênica e microRNA associados à apoptose induzida por AT2R em células de câncer de próstata. É também o primeiro estudo a relatar os efeitos seletivos diretos de Gadd45a, TRAIL-R2 e HRK na apoptose induzida por sobre-expressão de AT2R em DU145 ou células PC-3. Estes resultados fornecem informações importantes para uma melhor compreensão do mecanismo molecular na apoptose mediada por AT2R em células de câncer de próstata.
Neste estudo, observou-se que forçou a sobre-expressão de AT2R resultou em mudanças significativas em um grande número de expressões de genes e de microRNA por meio de análise de matriz PCR. Em seguida, nós demonstramos que TRAIL-R2 e Gadd45a estão envolvidos na apoptose induzida por AT2R em células DU145 e HRK desempenhou um papel importante na apoptose mediada por AT2R em células PC-3. Finalmente, TRAIL-R2, Gadd45a e HRK envolvimentos na apoptose induzida por AT2R eram independentes na ativação de MAPK p38, p44 /42 MAPK e p53 em linhas celulares de cancro da próstata.
Gadd45a foi regulado para cima em AT2R-overexpressed células DU145 em nosso presente estudo. Gadd45a, um gene danos indutível regulado por p53 e ADN, é um membro da família GADD45 de genes que são conhecidos sensores de tensão, que modula a resposta celular a uma variedade de condições de stress, incluindo o stress genotóxico e oncogénica [16] – [ ,,,0],19]. Outros estudos têm mostrado que Gadd45a inibe a angiogénese de tumores através de bloqueio da via mTOR /STAT3 [20]. Gadd45a é um alvo transcricional de tumor p53 supressor e BRCA1, cuja perda dos papéis fundamentais do jogo função no desenvolvimento do câncer [21]. Além disso, Zerbini L, et al [22] indicaram que JunD, Gadd45a e Gadd45g como alvos terapêuticos em caner próstata. Consistente com este estudo, os nossos dados mostraram que a apoptose mediada por AT2R foi parcialmente dependente Gadd45a em células DU145.
Os dados aqui apresentados indicam que o TRAIL-R2 está envolvido na apoptose mediada por AT2R de células DU145. Um grande número de evidências mostraram que TRAIL, um ligando indutor de apoptose, desencadeia a apoptose em várias linhas celulares de cancro sem toxicidade para as células normais [23]. TRAIL tem pelo menos quatro receptores de superfície celular, e que induz a apoptose através de dois receptores estreitamente relacionados, TRAIL-R1 e TRAIL-R2 [24]. TRAIL-R1 e TRAIL-R2 induzir FADD-dependente apoptose e ativam a via NF-kappaB [25]. /TRAIL seus receptores ligados à membrana são constitutivamente expressas em níveis elevados em carcinomas primários e metastáticos em quase todos os pacientes [26]. Nosso estudo apresentado mostrou que TNFSF10 (TRAIL) foi regulada para baixo, enquanto TRAIL-R2 foi regulado para cima em células DU145 overexpressed-AT2R. Curiosamente, a regulação negativa de TRAIL-R2 reforçado significativamente o efeito apoptótico induzido pela sobreexpressão AT2R. Nossos dados também mostraram que a apoptose foi indetectável quando TRAIL-R2 foi derrubado única. Assim, nossos experimentos sugerem que TRAIL e TRAIL-R2 podem ser reguladores negativos em apoptose mediada por AT2R em células DU145, eo tratamento combinado com superexpressão AT2R e TRAIL-R2 downregulation pode ser promissora como uma nova terapia genética contra câncer de próstata humano.
Algumas células de tumor são resistentes à citotoxicidade induzida por TRAIL, embora TRAIL tem sido relatado para induzir a apoptose de uma variedade de tipos de células de tumor [27], [28]. A não sofrem apoptose tem sido implicado na resistência das células cancerosas a vigilância da fuga e, por conseguinte, no desenvolvimento de tumores. Os determinantes moleculares da apoptose induzida por TRAIL não tenham sido exaustivamente examinada em células cancerosas humanas da próstata. células LNCaP e câncer de próstata DU145 são resistentes à apoptose induzida por TRAIL, e TRAIL foi menos ativo contra eles compara com PC-3 células de câncer de próstata [29], [30]. A sensibilidade a apoptose induzida por TRAIL podem ser correlacionados com as expressões relativas de TRAIL-R1 e TRAIL-R2 em comparação com DcR1 e DcR2 ou os níveis intracelulares de Chama-1 [31], [32]. No entanto, em comparação com células LNCaP, que têm a menor sensibilidade a apoptose induzida por TRAIL, células altamente sensíveis PC-3 apresentaram níveis de proteína semelhantes ou inferiores de TRAIL-R1 e TRAIL-R2 e níveis mais elevados de DcR2 [30]. É também verificado que a expressão de TRAIL-R1 e TRAIL-R2 na linha celular MCF10A sensíveis-TRAIL não era diferente a partir de linhas de células resistentes, por exemplo, 184B5 [33]. Isto faz com que seja improvável que a sensibilidade à apoptose induzida por TRAIL é completamente controlada pelas quantidades relativas de TRAIL-R1 e TRAIL-R2. Isto sugere que outros factores ou outros mecanismos podem ser reguladores importantes da sensibilidade a apoptose induzida por TRAIL em essas células cancerosas. Provavelmente, neste estudo TRAIL-R2 regular negativamente a apoptose mediada por AT2R em células DU145 vai nos ajudar a explorar os mecanismos de sensibilidade a apoptose induzida por TRAIL em células diferentes.
Uma observação muito recente que TRAIL-R2, pensamento para apenas agir quando estimulados por TRAIL na superfície celular, cumpre uma função distinta no núcleo onde se promove a proliferação celular de uma forma independente de TRAIL sugere uma função específica, associada à proliferação de armas nucleares TRAIL-R2 [34]. Nuclear TRAIL-R2 inibe a maturação do microRNA let-7 em linhas celulares de cancro do pâncreas e aumenta a sua proliferação. amostras de tumores pancreáticos têm níveis aumentados de nuclear TRAIL-R2, que se correlacionam com pior prognóstico dos pacientes [34]. Estes resultados indicam que no núcleo, receptores de morte podem funcionar como promotores de tumores e podem ser alvos terapêuticos, e homem ajuda-nos estudar ainda mais a relação entre AT2R e TRAIL-R2.
Vários estudos têm mostrado que HRK (pró -apoptotic BH3-único membro da família Bcl-2, Harakiri) é um gene pró-apoptótico em várias células [35] – [41]. HRK inactivação é associado com um baixo índice apoptótico em glioblastomas secundários [42]. No presente estudo, mostramos que HRK foi regulado para cima em DU145 overexpressed-AT2R e células PC-3, e quando HRK foi silenciada, a apoptose mediada por AT2R foram significativamente reduzidos em PC-3, mas não células DU145. Estes dados indicam que a apoptose induzida por AT2R sobre-expressão é pelo menos parcialmente dependente HRK em células PC-3. É também demonstrado que os níveis de expressão foram HRK aumentada em células PC-3, respectivamente, de uma forma dependente da dose. Colectivamente, as nossas descobertas indicaram que a apoptose induzida pela sobre-expressão de AT2R pode ser dependente da via HRK pró-apoptótico em células PC-3. No entanto, existem algumas questões a serem respondidas, tais como, o mecanismo da via apoptótica de AT2R para HRK não foi ilustrado e se ou não o HRK poderia desencadeia a apoptose em outras células cancerosas da próstata.
As nossas experiências anteriores indicam AT2R que a apoptose induzida pelo ligando é (Ang II) independente, mediada por p38 MAPK e a caspase-3, e ocorre através de uma via de sinalização da morte celular extrínseca [12].