Abstract

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma neoplasia agressiva com opções limitadas de tratamento. Nós já descobriram que PARP é sobre-expresso em SCLC e que a segmentação PARP reduz linha celular e crescimento tumoral em modelos pré-clínicos. No entanto, linhas de células SCLC com a activação da via PI3K /mTOR foram relativamente menos sensíveis à inibição de PARP. Neste estudo, nós investigamos as alterações proteômicas em PI3K /mTOR e outros percursos que ocorrem seguintes inibição PAPR e /ou knockdown

in vitro

e

in vivo

. Usando array de proteínas de fase inversa, encontramos as proteínas mais significativamente regulada positivamente após o tratamento com o olaparib inibidores de PARP e rucaparib estavam na via PI3K /mTOR (p-mTOR, p-AKT, e PS6) (p≤0.02). Além disso, entre as proteínas mais significativamente para baixo-regulados foram LKB1 e sua alvos AMPK e TSC, que regulam negativamente a via PI3K (p≤0.042). Seguindo PARP knockdown em linhas celulares, mTOR fosforilado, AKT e S6 foram elevados e sinalização LKB1 foi diminuída. as concentrações globais de ATP aumentada após a inibição PARP (p≤0.02) que nos leva a supor que o aumento da ativação da via PI3K /mTOR observado após resultados de inibição de PARP da diminuição da utilização da ATP e uma subsequente diminuição resposta ao estresse sinalização através LKB1. Com base nestes resultados, em seguida, investigaram se a co-alveja com um PARP e PI3K inibidor (BKM-120) iria funcionar melhor do que qualquer um único agente sozinho. A maioria das linhas de células SCLC foram sensíveis a BKM-120 em doses clinicamente praticáveis, e expressão cMyc foi o biomarcador da resposta mais forte. Em doses clinicamente praticáveis ​​de talazoparib (o inibidor de PARP mais potente SCLC testes clínicos) e BKM-120, foi observado um efeito aditivo

in vitro

. Quando testado em dois modelos animais SCLC, um maior do que aditivo interação foi observada (p≤0.008). Os dados aqui apresentados sugerem que a combinação de inibidores de PARP e PI3K aumenta o efeito de um ou outro agente sozinho em modelos pré-clínicos de SCLC, garantindo uma investigação mais aprofundada de tais combinações em doentes com CPPC

Citation:. Cardnell RJ, Feng Y, Mukherjee S , G Diao, Tong P, CA Stewart, et ai. (2016) activação da via PI3K /mTOR seguinte PARP Inibição em Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 11 (4): e0152584. doi: 10.1371 /journal.pone.0152584

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 09 de novembro de 2015; Aceito: 15 de março de 2016; Publicação: 07 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Cardnell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo MD Cancer Support Center Grant Anderson (NIH P30 CA016672); University of Texas-Southwestern e SPORE MD Anderson Cancer Center Lung (5 P50 CA070907); através de generosas contribuições filantrópicas para a Universidade do Texas MD Anderson Cancer Lung lua Tiro Programa; NIH 1R01 CA168484-01 (JVH); David Bruton, Jr., Presidente Dotado (JVH); Fundação do Rexanna para combater o câncer de pulmão (http://www.rexannasfoundation.org/) (JVH); Scientist Award MD Anderson Cancer Center Médico (LAB); Lee Clark Fellowship da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, apoiado pelo Fundo de Bolsas Jeane F. Shelby (LAB); um Investigador Clinical Cancer NCI Equipa de Liderança (P30 CA016672) (LAB); O Instituto Zayed Al Nahyan Sheikh Khalifa Bin para de Terapia do Câncer personalizado Center (do IPCT) de Educação Profissional e Formação (LAB); o National Lung Cancer Research Partnership, tornada possível pela Carolina do Norte Lung Cancer Partnership (http://www.freetobreathe.org/) (LAB); a Fundação Lung Cancer Research (http://www.lungcancerresearchfoundation.org/) (LAB); Fundação LUNGevity (http://www.lungevity.org/) (LAB); e A Fundação Sidney Kimmel para Pesquisa do Câncer (http://kimmel.org/) (LAB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. YF e YS são funcionários da BioMarin Pharmaceutical Inc. JVH atua nos conselhos consultivos da AstraZenica, Abbvie, Novartis e Genentech. Isto não altera a nossa adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é a forma mais agressiva de câncer de pulmão, com um de 5 anos taxa de sobrevivência de apenas 6% [1]. Há aproximadamente 30.000 mortes por SCLC anualmente nos Estados Unidos (que compõe 13% dos cancros do pulmão), tornando SCLC sozinho a 8

th causa de morte por câncer levando em os EUA em 2011 [2, 3]. A maioria dos casos de CPPC responde à quimioterapia e radioterapia inicialmente. No entanto, a reincidência é quase universal, e na maioria dos pacientes ainda terapia sistêmica não produz nenhuma resposta. Ao contrário de cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC), SCLC tem atualmente há terapias específicas aprovadas com benefício demonstrado para os pacientes. Por conseguinte, o desenvolvimento de novas drogas, activas, e, potencialmente, orientadas para o tratamento de SCLC representa uma grande necessidade médica não satisfeita.

relatado anteriormente que poli-ADP ribose polimerase 1 (PARP1) é sobre-expresso em CPPC, identificando PARP como um alvo terapêutico potencial no presente cancro [4]. O trabalho futuro por nosso grupo demonstrou que PARP1 /2 inibidores talazoparib (BMN 673), olaparib (AZD2281) e rucaparib (CO-338, AG 014699) têm atividade de agente único em modelos pré-clínicos [4, 5]. Embora os inibidores de PARP estão em desenvolvimento fase tardia para o tratamento de cancros do ovário (olaparib aprovados, rucaparib Fase 3), com base nesses dados pré-clínicos, vários estudos clínicos de inibidores de PARP estão sendo realizados em SCLC para investigar o efeito destas drogas como agentes únicos ou em combinação com quimioterapia (Fase I-talazoparib, Fase II e olaparibe veliparib) [6]. No estudo de Fase I de agente único talazoparib, observamos respostas parciais em um subgrupo de pacientes com recidiva Quimioterapia [7]. No entanto, como acontece com outros medicamentos específicos, identificando mecanismos associados à resistência aos medicamentos inata e adquirida e combinações racionais para aumentar as taxas de resposta e /ou duração é fundamental para otimizar a aplicação clínica destas drogas [7, 8].

em trabalho pré-clínico anterior, utilizando um painel de 8 linhas de células SCLC que correlacionada a sensibilidade da linha celular para a inibição de PARP com perfil proteomic de cada linha de células [5]. As linhas de células com a maior activação da via PI3K /mTOR foram as menos sensíveis ao talazoparib; com -Akt fosforilada (p) (T308) e p-AKT (S473) como os melhores marcadores de resistência [5]. alterações genéticas na via PI3K /mTOR não são incomuns em SCLC [9, 10], com alterações tipicamente mutuamente exclusivos em

PIK3CA

,

PTEN

,

AKT2

,

AKT3

,

rictor

, ou

MTOR

encontrado em 36% dos pacientes [10]. relatórios pré-clínicos mostraram inibidores de PI3K como PIK75 e PF-4989216 para ter actividade em modelos SCLC com

PIK3CA

mutações, mas não

PTEN

deficiência, indicando um possível papel para PI3K /mTOR-alvo terapia em CPPC [11, 12]. Relacionado com esta constatação, os relatórios anteriores em cancro da mama têm mostrado que o tratamento com um crescimento de tumor retardado inibidor de PI3K, mas aumentou indicadores de dano de ADN, tais como poli-ADP ribose (PAR) [13, 14]. Enquanto que a inibição PARP sozinho nestes modelos de cancro da mama apenas o crescimento moderadamente atenuados, a combinação de PARP e inibição de PI3K foi particularmente potente na supressão do crescimento [13, 14].

Como a análise proteômica revelou uma correlação inversa entre a atividade do PI3K via /mTOR e resposta a talazoparib

in vitro

[5], a hipótese de que a adição de inibição /mTOR PI3K pode sensibilizar ainda mais SCLC a inibidores de PARP. Nós primeiro investigada em linhas de células SCLC a resposta intracelular à inibição PARP, observando-se um aumento de sinalização PI3K /mTOR seguinte inibição PARP

.

Neste estudo nós mostramos pela primeira vez que PI3K /mTOR sinalização aumenta a inibição de PARP em SCLC e que isso pode ser conduzido através de uma redução da quinase hepática B1 (LKB1) na sinalização alterações serão validadas pelo knockdown PARP1. Por conseguinte, foram investigados os efeitos anti-tumor da combinação de um inibidor de PARP com um inibidor específico da via PI3K em modelos pré-clínicos de SCLC. estudos de associação visando PARP e PI3K

in vitro

revelou uma interação aditiva entre estes dois inibidores em ensaios de proliferação. Os estudos em animais revelaram que esta combinação tem um efeito maior do que qualquer um dos fármacos isoladamente na redução do volume do tumor, proporcionando uma forte razão para o avanço desta combinação em estudos clínicos em doentes com CPPC.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

linhas de células SCLC Humano COR-L88, DMS1114, DMS 153, DMS 53, DMS 79, H1048, H1092, H1105, H128, H1341, H1417, H1436, H146, H1672, H1836, H187, H1876 , H1930, H196, H1963, H2081, H209, H211, H2141, H2171, H2195, H2227, H2330, H250, H345, H378, H446, H510, H524, H526, H69, H719, H748, H774, H82, H841, H847 , H865, H889, e SHP-77 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) ou Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); linhas de células derivadas de GEMM KP1, KP3, Kp11, e Kp12 [15] e xenoenxerto derivado de paciente (PDX) A linha celular derivada humana NJH29 foram todos generosamente fornecida pelo Dr. Julien Sage (Stanford University, Stanford, CA). Todas as células foram cultivadas em meio sugerido suplementado com soro bovino fetal e penicilina /estreptomicina. As células foram passadas por menos de 6 meses após a sua recepção.

análise Proteína

Para RPPA e análise western blot, as células foram tratadas em duplicado com 1 � olaparib (Selleck Chemicals, Houston TX), rucaparib ( Selleck Chemicals, Houston TX), ou talazoparib (BioMarin Pharmaceutical Inc, Novato CA). Western blots foram sondados para PARP1 (cs9542), mTOR pS2448 (cs2971), mTOR (cs2983), AKT pT308 (cs9271), AKT (cs9272) S6 pS240,244 (cs2215), S6 (cs2217), LKB1 (cs3050), AMPKα PT172 (cs2532), AMPKα (cs2532) (Cell Signaling Technlogy, Danvers MA), e actina (sc1616, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX).

matriz inversa proteína de fase

lisados ​​de proteína foram recolhido num tampão contendo 1% de Triton X-100, 50 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 1,5 mmol /L de MgCl

2, 1 mmol /L de EGTA, 100 mmol /L, NaF, 10 mmol /L NAPPI, 10% de glicerol, 1 mmol /l de PMSF, 1 mmol /L de Na

3VO

4, e 10 mg /ml de aprotinina. As amostras foram quantificadas e arrays de proteínas foram impressos a partir de lisados ​​e corados como descrito anteriormente [4, 16]. Resumidamente, as imagens de diapositivos foram quantificados usando MicroVigene 4,0 (VigeneTech, Carlisle, MA). Os dados brutos foram processados ​​nível local, utilizando o pacote de R SuperCurve [17-19], que retorna a concentração estimada de proteína (concentração cru) e uma contagem de controlo de qualidade (CQ) para cada lâmina. Apenas desliza com uma pontuação QC 0,8 foram utilizados para análise a jusante. Os dados de concentração brutos foram normalizados pela mediana-centragem cada amostra através de todas as proteínas para corrigir polarização de carregamento.

Os ensaios de proliferação

As células foram semeadas em placas de 96 poços a 2000 células por poço em triplicado para cada linha celular. Após 24 horas, as células em cada poço foram tratadas durante 24 horas com um inibidor de PARP (talazoparib) e /ou inibidor de PI3K (BKM-120, Selleck Chemicals, Houston TX) ou com o controlo de veículo. Quatro dias mais tarde, a proliferação celular foi ensaiada por Titer Glo (Promega, Fitchburg, WI). Para tratamentos de fármaco único, a concentração média inibitória valores (IC

50) foram estimados pelo software drexplorer [20]. Especificamente, para cada combinação de drogas (em cada nível de dose), o efeito observado (ou experimental) da combinação foi comparado com o efeito aditivo previsto. Os dados foram subsequentemente apresentados como uma percentagem do efeito experimental em relação ao efeito aditivo previsto (1.1 = + 10%; 1 = 0%; 0,9 = 10%). Por exemplo, se a droga A reduz a proliferação em relação a 0,8 e a droga B a 0,7, então o efeito aditivo previsto seria de 1 – ((1-0,8) + (1-0,7)) = 0,5. Se o efeito observado (experimental) da combinação sobre a proliferação relativa é, em seguida, 0,3, então o efeito observado é superior ao efeito previsto da combinação [(1-0,3) /(1-0,5) = 1,4]. Usando 10% acima ou abaixo do efeito aditivo previsto como um ponto de corte, que, em seguida atribuídos os seguintes grupos: Observado /previu 1,1 = maior que aditivo; Observado /previu 0,9 = menos de aditivo; Observado /previsto ≤1.1 e ≥0.9 = aditivo. Para combinações de drogas, a abordagem MacSynergy II [21] com base no modelo Bliss Independência [22] foi implementada para calcular várias métricas, incluindo o volume sinérgica, o volume de antagonista, volume global, e da quota de abate adicional [23].

Gene knockdown

Para knockdown proteína estável, partículas lentivirais que codificam dois RNAs curtos-hairpin diferentes (shRNA) visando PARP1 e controle disputa shRNA (pGIPZ lentiviral vector, Open Biosystems uma divisão da Dharmacon /GE Healthcare, Lafayette CO) foram seleccionada e designada como PARP1-shRNA-1, PARP1-shRNA2, e SCR-shRNA, respectivamente. As sequências de PARP1 shRNA foram como se segue:

PARP1

-shRNA1: 5′-TAGTTGAACACACTTTCTT-3 ‘; PARP1-shRNA2: 5’-TGATGTTCCAGATCAGGTC-3 ‘.

STK11

sequências (LKB1) shRNA foram como se segue LKB1-shRNA1: 5′-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ‘; LKB1-shRNA2: 5 ‘ATTTATTGCCAAATTTGGG-3’. As partículas de lentivírus shRNA foram incubadas com células alvo durante 24 horas, e, em seguida, as células foram seleccionadas em meio de cultura apropriado que contém puromicina (2 pg /mL) durante 3 semanas. As colónias resistentes foram expandidas e eficiência knockdown foi validado por qRT-PCR e western blot.

ATP quantificação

Para avaliar a disponibilidade de ATP, as concentrações globais de ATP foram medidos em células tratadas ou não tratado com um inibidor de PARP. A concentração de ATP foram ensaiadas pelo Sistema ATPLite luminescência acordo com as instruções do fabricante (Perkin Elmer, Inc., Waltham MA).

poli ADP-ribose (PAR) ensaio

Para avaliar o efeito da PARP /inibição de PI3K na actividade PARP1

in vivo

, os lisados ​​foram preparados a partir de xenoenxertos de 2 horas após a administração de fármaco no dia 3 do tratamento. Os xenoenxertos foram produzidas pelo método descrito na subsecção seguinte. níveis PAR foram ensaiadas por ELISA segundo as instruções do fabricante (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD).

Modelos animais

fêmea Balb /c ratinhos nus foram obtidos a partir de Xangai Lingchang Biotechnology Co. LTD (Xangai, China) ou Harlan Laboratories (Houston, TX). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os procedimentos relacionados ao manejo dos animais, cuidados e tratamento neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Shanghai Chempartner (número de protocolo A998HL0001) ou pela Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center IACUC (número de protocolo RM00001191-RN01). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal. as células NCI-H209 SCLC humanas (5 x 10

6 células) ou NCI-H1048 de células tumorais (3 × 10

6 células) em 0,2 ml de uma mistura 1: 1 de meio e Matrigel foram injectadas subcutaneamente no flanco direito de cada rato (36 animais por linha celular). Quando os tumores atingiram cerca de 150 mm

3 volume médio, animais (6 por grupo) foram tratados por via oral com veículo, talazoparib (0,25 mg /kg), ou BKM-120 (25 mg /kg) por dia, durante 28 dias. O volume do tumor e peso do animal foram medidos cada 2 a 3 dias. A mais 3 animais de cada grupo foram tratados durante 3 dias; tumores de xenoenxerto foram colhidas a partir de e congeladas rapidamente 2-3 horas após o tratamento no dia 3 para análise posterior. A eficácia do tratamento foi determinada por comparação do volume do tumor a partir de ratinhos tratados com a droga (AT) com que a partir de ratinhos tratados com veículo (Sc) utilizando a razão (AT /Sc) no dia 19 de NCI-H1048 e dia 25 para NCI-H209 [ ,,,0],24] (última medição dos tumores tratados de veículos).

resultados

PARP inibição

in vitro

aumenta a sinalização PI3K em SCLC

Para identificar vias moduladas por inibição de PARP, foi realizada array de proteínas de fase inversa (RPPA) que mediu as alterações em 137 proteínas totais e fosforilados em vias oncogénicos chave, incluindo PI3K, MEK e reparação do ADN de um painel de linhas de células SCLC tratados com veículo ou um a olaparibe inibidores de PARP ( AZD2281), rucaparib (CO-338, AG 014699), ou talazoparib (BMN 673) durante 24 horas. Análise de lisados ​​de células recolhidos-tratamento pré- e pós mostraram que a fosforilação (activação) das proteínas da via PI3K /mTOR foi aumentada em linhas de células tratadas. RPPA análise revelou que, de 137 proteínas totais e fosforilados medido, seis dos oito proteínas que foram significativamente mais regulados positivamente em resposta à inibição de PARP (FDR) foram ≤0.1 na via PI3K /mTOR (incluindo p-mTOR, p-AKT, e p-S6 [p≤0.02] (Fig 1A e 1B) níveis de proteínas totais mantiveram-se inalterados por RPPA (p≥0.27)). Talazoparib, que tem um aproximadamente 10 vezes mais baixa IC

50 em que SCLC olaparibe ou rucaparib, induziu uma resposta similar nas células H69, tal como exibido por um aumento da p-AKT T673 e p-S6 S240,244 a seguir ao tratamento (Fig S1 ).

(a) de agrupamento hierárquico de proteínas identificadas em lisados ​​de linhas celulares de SCLC (H69, H82, H841) tratados com veículo ou olaparib por 24 horas revelou aumento da atividade da via PI3K /mTOR seguintes inibição PARP ( FDR≤0.1, equivalente p-value≤0.037). (B) as proteínas fosforiladas individuais da via PI3K /mTOR (p-mTOR, p-AKT e p-quinase S6) são aumentados depois do tratamento com qualquer um ou olaparibe rucaparib (p≤0.02). (C) Os lisados ​​de linhas celulares tratadas com olaparib ou rucaparib contra o veículo por 24 horas mostram inativação da via LKB1 (LKB1, pAMPKα e pTSC2; p≤0.042).

inibição PARP conduz PI3K /mTOR activação através de ATP /LKB1

Os nossos estudos anteriores mostraram que, para além de PARP, linhas de células SCLC também sobre-expressam cinase de fígado B1 (LKB1) [4]. A via LBK1 é um mecanismo de resposta ao estresse, que é activado em resposta a tensões metabólicas, tais como depleção de ATP para proteger a célula [25]. Uma consequência da actividade LKB1 é a supressão da via mTOR [25]. RPPA análise de células SCLC tratados com olaparibe revelou uma diminuição na actividade da via LKB1 (Fig 1A). Uma análise posterior (Fig 1C) mostrou que o tratamento com qualquer um ou olaparibe rucaparib reduziu significativamente a expressão LKB1 (p 0,001). Fosforilação de alvos a jusante do LKB1, pAMPKα e pTSC2, também foi reduzida significativamente após o tratamento com inibidores de PARP (p = 0,022 e p = 0,042, com olaparib; p = 0,013 e p = 0,034, com rucaparib para pAMPKα e pTSC2, respectivamente; AMPK total e TSC os níveis de proteína ficaram inalterados medida pelo RPPA, p≥0.81).

inibidores de PARP trabalhar tanto através da inibição catalítica de PARP e um fenômeno chamado de trapping-DNA PARP onde PARP está preso no local de uma quebra de cadeia dupla (DSB) impedindo que a DSB de ser reparado e causando citotoxicidade direta [26]. Portanto, para olhar para o efeito de inibição de PARP catalítica especificamente, derrubou o

gene PARP1

por transdução shRNA lentiviral em um painel de linhas celulares SCLC incluindo uma linha celular representante da análise farmacocinética in vitro e linhas celulares utilizados nos estudos em animais (descrito abaixo). PARP knockdown nos permitiu não só olhar diretamente para a inibição catalítica de PARP1, mas também para evitar potenciais efeitos fora do alvo de inibidores farmacológicos. Como mostrado na Fig 2A, esta knockdown reduzida significativamente em comparação com a expressão PARP1 shRNA precipitação (controlo). Uma análise mais aprofundada western blot de

PARP1

linhas de células knockdown shRNA mostraram aumento da mTOR, AKT e atividade S6 em relação ao embaralhar shRNA controle em todas as linhas celulares testadas, apesar de H69 e H1048 com mutações ativadoras no

PIK3CA

. Nós confirmamos nossas observações em H69 células knockdown usando um proteínas limitada análise painel RPPA selecionados (S2 FIG). Nesta análise, os segundo e terceiro diferenças mais significativas entre scramble- e

PARP1

células shRNA-transduzidas foram diminuídos PARP1 e aumento da p-S6 (de 35 acertos em

PARP1

KD1 e 52 em KD2 em FDR≤0.05). O aumento na PI3K /mTOR sinalização observadas com farmacológico de curto prazo e perda genética a longo prazo da função PARP1 reforça a noção de que a activação de PI3K /mTOR é um efeito que está relacionada com a inibição da PARP catalítica em vez de aprisionamento-ADN PARP. A novela observação de que a inibição PARP ou knockdown ativa a via PI3K /mTOR em SCLC (Fig 1) é consistente com o nosso relatório publicado anteriormente que esta via é o marcador mais forte de resistência de base à inibição PARP [5].

(a) os lisados ​​de PARP1 knockdown por shRNA em linhas de células SCLC (H69, H1048, H209) resulta num aumento da actividade da via PI3K /mTOR relativa para embaralhar (SCR) shRNA como determinado por transferência de western. (B)

PARP1

células shRNA knockdown (KD1 e KD2) tiveram menor LKB1 e expressão pAMPKα do que as células shRNA mexidos. células (C) H69 e H1048 tratados com olaparib mostraram aumento [ATP], medido pelo ensaio ATPLite. Os dados são apresentados como média ± SEM; ** P 0,02, *** p 0,01. Uma proposta de modelo de ativação da via PI3K (D) com a inibição PARP.

Uma análise mais aprofundada da atividade PARP1 no caminho LKB1 em linhas de células SCLC mostraram que a expressão LKB1 e fosforilação de AMPKα foram inferiores em

PARP1

knockdown células do que nas células tratadas com precipitação shRNA (Fig 2B).

PARP catalisa a polimerização de ADP-ribose de NAD + para anexar poli ADP-ribose (PAR) para proteínas de dadores em um processo de chamado PARylation [27]. Como PARylation por PARP é um evento ATP-intensiva, a hipótese de que os resultados de inibição de PARP no aumento de disponíveis ATP, que por sua vez resulta em diminuição da atividade da via LKB1 e, portanto, uma perda de supressão /mTOR PI3K. Utilizando um ensaio à base de luminescência, medimos níveis globais de ATP em células SCLC antes e após o tratamento com um inibidor de PARP. Como mostrado na Fig 2C, as concentrações de ATP foram aumentadas após o tratamento com olaparibe (1