Sumário

CD47 é uma proteína de superfície celular amplamente expresso que funciona como um regulador da fagocitose mediada por células do sistema imune inato, tais como macrófagos e células dendríticas. CD47 serve como ligando para um receptor na estas células imunitárias inatas, SIRP-alfa, que por sua vez proporciona um sinal inibidor para a fagocitose. Nós anteriormente encontrado um aumento da expressão de CD47 em leucemia mielóide aguda humana primária (LMA) células estaminais, e demonstraram que o bloqueio de anticorpos monoclonais dirigidos contra CD47 habilitado a fagocitose e a eliminação da LMA, linfoma de não-Hodgkin (NHL), e muitos tumores sólidos em xenoenxerto modelos. Aqui, nós relatamos o desenvolvimento de um anticorpo anti-CD47 humanizado com potente eficácia e propriedades toxicocinéticos favoráveis ​​como terapêutico candidato. Um novo anticorpo CD47 anti-humano monoclonal, 5F9, foi gerado, e a humanização de anticorpos foi levada a cabo por meio do enxerto sua regiões determinantes de complementaridade (CDR) para um formato de IgG4 humana. O anticorpo humanizado resultante 5F9 (Hu5F9-G4) ligado CD47 monomérica humana com uma afinidade de 8 nM. Hu5F9-G4 induzida potente fagocitose mediada por macrófagos de células AML humanas primárias in vitro e completamente erradicada LMA humano in vivo, levando a sobrevivência livre de doença a longo prazo de xenoenxertos de derivados de paciente. Além disso, Hu5F9-G4 sinergia com rituximab para eliminar NHL enxerto e curar ratinhos xenoenxertados. Finalmente, estudos toxicocinicos em primatas não-humanos mostraram que Hu5F9-G4 pode ser administrada de forma segura por via intravenosa em doses capazes de alcançar níveis séricos potencialmente terapêuticos. Assim, Hu5F9-G4 está ativamente sendo desenvolvido para e tem sido submetidos a ensaios clínicos em doentes com LMA e tumores sólidos (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT02216409).

Citation: Liu J, Wang L, Zhao F, Tseng S, Narayanan C, Shura L, et ai. Desenvolvimento (2015) pré-clínica de um anticorpo humanizado anti-CD47 anticorpo com potencial anti-Cancer Terapêutica. PLoS ONE 10 (9): e0137345. doi: 10.1371 /journal.pone.0137345

editor: Kevin D. Bunting, da Universidade Emory, Estados Unidos

Recebido: 02 de junho de 2015; Aceito: 14 de agosto de 2015; Publicação: 21 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. Este trabalho foi apoiado por um subsídio do Instituto da Califórnia de Medicina regenerativa e financiamento do Fundo de Virgínia e DK Ludwig para Pesquisa do Câncer

Conflito de interesses: JL, RM, e ILW entraram com pedido de patente internacional WO 2011/143624 A2 intitulado «Os anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos para CD47 ‘. JL, RM, ILW, SW, JV, MH, e SP apresentaram número EUA pedido de patente PCT /US2014 /018.743 intitulado «Métodos para alcançar doses terapeuticamente eficazes de agentes anti-CD47 ‘. Isto não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O desenvolvimento do câncer requer células normais para adquirir métodos para desregular a proliferação, evitar a morte celular programada, e adquirem muitas das outras características de cancro [1]. Além disso, as células cancerosas devem escapar remoção celular programada, que é a eliminação de células fagocíticas aberrantes por células do sistema imune inato, incluindo macrófagos, células dendríticas, e neutrófilos [2]. A estimulação da remoção celular programada utiliza um número de sinais pró-fagocíticas, muitos dos quais não são caracterizadas molecularmente, mas podem incluir os sinais de proteínas tais como calreticulina [3], os fosfolípidos, tais como fosfatidilserina, e a glicosilação anormal. No entanto, a inibição da remoção celular programada é inibida principalmente por uma única molécula dominante, CD47. Todos os cânceres humanos estudados até à data, incluindo os tumores sólidos e leucemia, CD47 expresso, fazendo CD47 um alvo universal no câncer humano.

Human leucemia mielóide aguda (AML) é um tumor maligno agressivo de células progenitoras da medula óssea, caracterizada por um aumento nos glóbulos brancos imaturos e insuficiência de medula óssea. AML é o tipo mais comum de leucemia que afeta adultos agudas, com um prognóstico pobre e poucas opções terapêuticas. padrão atual de tratamento para pacientes com LMA medicamente aptos consiste de quimioterapia em doses elevadas, muitas vezes incluindo transplante de células hematopoiéticas alogênico. Mesmo com esses tratamentos agressivos, que causam significativa morbidade e mortalidade, a recidiva é comum e sobrevida global em cinco anos é apenas 30-40%. Além disso, a maioria dos pacientes é superior a 65 anos de idade e não são candidatos para a quimioterapia de dose elevada, levando a um período de cinco anos de sobrevivência global de 5-10% neste grupo [4,5].

recentes estudos têm demonstrado que a AML é organizado como uma hierarquia celular iniciado e mantido por células-tronco da leucemia (LSC) que possuem as propriedades de células-tronco canônicas de auto-renovação e a capacidade de gerar um grande número de progenitores de leucemia e explosões [6,7]. Uma implicação-chave deste modelo de células-tronco do câncer é que LSC deve ser eliminada para a cura; no entanto, LSC têm demonstrado resistência à quimioterapia padrão e tratamento com radiação [8,9]. Identificação de moléculas da superfície celular expressos preferencialmente em células estaminais AML clinicamente relevantes oferece uma estratégia atractiva para o desenvolvimento de novas terapias de LMA, uma vez que estas moléculas da superfície celular pode servir como potenciais alvos para terapia de anticorpo monoclonal. Um número de moléculas da superfície celular expressos preferencialmente em LMA LSC em comparação com as células estaminais e progenitoras hematopoiéticas humanas normais foram identificados, incluindo CD47 [10].

CD47 possui uma região variável de imunoglobulina único (IgV) -like domínio extracelular e regula vários processos celulares implicados em respostas imunes [11]. É amplamente expresso em células hematopoiéticas e não hematopoiéticas; no entanto, que anteriormente descobriu que CD47 foi mais altamente expresso na AML LSC do que suas contrapartes normais, e que o aumento da expressão CD47 na AML está associado a resultados clínicos pobres [6,7,12]. CD47 faz uma série de interações proteína-proteína incluindo

em

cis com as integrinas e

em

trans com dois ligantes, trombospondina-1 (TSP-1) e sinalizar alfa proteína reguladora (SIRPα). SIRPα codifica um receptor da superfamília Ig cuja região citoplasmática contém imunor motivos de inibição baseado em tirosina (ITIMs) e é expressa em macrófagos, células dendríticas, e neurónios [13-18]. Após a ligação de CD47, SIRPα inicia uma cascata de transdução de sinal inibitório através do recrutamento do domínio de homologia src-2 contendo proteína tirosina fosfatases SHP-1 e SHP-2, que por sua vez enviam sinais inibitórios para a fagocitose [19-22]. Na fisiologia normal, CD47 foi descoberto ser um marcador de idade em eritrócitos do rato, que exibem progressivamente decrescentes de expressão de CD47 provavelmente levando à sua eventual remoção fagocítico por macrófagos sinusoidais do baço, o que sugere que os GVs mais envelhecido são susceptíveis de ser de maior risco para a fagocitose extravascular por CD47 anticorpos bloqueadores [17,18,23].

o complexo processo de fagocitose depende do equilíbrio relativo dos insumos pró-fagocíticas e anti-fagocíticas [2]. Com base nestas observações, foi proposto um modelo no qual as células de leucemia acumulam sinais pró-fagocíticas, muitos dos quais não são caracterizadas molecularmente. Como consequência, as células de leucemia que expressam níveis elevados de CD47 são seleccionados provável para combater sinais pró-fagocíticas. Deste modo, as células de leucemia são dependente da expressão de CD47 para evitar a eliminação fagocítico por células imunitárias inatas [24].

A partir deste modelo, previmos que o bloqueio da interacção CD47-SIRPα resultaria na dominância de pro- fagocíticas sinais resultantes na fagocitose das células de leucemia. Nós validado esta hipótese, demonstrando que um anticorpo CD47 anti-humano disponível rato bloqueio, B6H12, estimulado fagocitose e reduziu o peso da AML enxerto em modelos de xenotransplante humanos primários [6]. Nós também a hipótese de que um anticorpo anti-CD47 de bloqueio criaria uma sinergia com um segundo anticorpo capaz de se ligar Fc-receptores e entregar um sinal de pró-fagocítica potente. Consistente com esta ideia, descobrimos que B6H12 e rituximab potente sinergia na erradicação da NHL em modelos de xenotransplante [25]. Finalmente, a expressão CD47 foi detectada em células cancerosas de muitos hematológicas e tumores sólidos, e verificou-se que B6H12 habilitado a fagocitose de células de cancro humano primárias in vitro, inibiram o crescimento de tumores humanos ortotopicamente xenotransplantadas, e impediu a metástase de células tumorais humanas [ ,,,0],26-30].

em conjunto, estes estudos sugerem que um anticorpo anti-CD47 bloqueando humanizado pode ser um anti-câncer terapêutica eficaz tanto como monoterapia e em combinações. No presente estudo, relata-se o desenvolvimento de um anticorpo CD47 romance humanizado anti-humana, designado Hu5F9-G4, gerado pela região determinante de complementaridade (CDR) enxertadas sobre um andaime de IgG4 humana para minimizar o recrutamento das funções efectoras dependentes de Fe de anticorpo. Hu5F9-G4 induzida potente fagocitose mediada por macrófagos de células AML humanas primárias in vitro e completamente erradicada LMA humano in vivo, levando a sobrevivência livre de doença a longo prazo de xenoenxertos de derivados de paciente. Além disso, Hu5F9-G4 sinergia com rituximab para eliminar NHL enxerto e curar ratinhos xenoenxertados. Finalmente, estudos toxicocinicos em primatas não-humanos mostraram que Hu5F9-G4 pode ser administrada de forma segura por via intravenosa em doses capazes de alcançar níveis séricos potencialmente terapêuticos. Assim, Hu5F9-G4 está sendo ativamente desenvolvido para ensaios clínicos em AML humana e tumores sólidos.

Materiais e Métodos

geração de anticorpos

Um fragmento de cDNA de CD47 humano que codifica o domínio extracelular foi clonado a partir de um comprimento completo de ADNc de CD47 humano (Open Biosystems) e foi fundido com FC de ratinho para gerar uma proteína de fusão CD47 /MFC, o qual foi utilizado para imunizar ratinhos para produzir anticorpos CD47 anti-humano monoclonal de ratinho. Os hibridomas foram gerados utilizando protocolos padrão. Resumidamente, ratinhos Balb /c de 4-6 semanas de idade foram imunizados com a proteína de fusão purificada recombinante huCD47 /MFC duas vezes por semana para um total de 4 semanas. Os títulos foram avaliadas depois e as células do baço foram fundidas com células SP2 /0. Os hibridomas foram seleccionados e os sobrenadantes dos clones resultantes foram rastreados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e de células activadas fluorescentes (FACS).

V de anticorpo clonagem e sequenciação

A estratégia de clonagem aqui usado envolveu um isolamento de ARN a partir de células de hibridoma inicial (Qiagen). As sequências de ADNc que codificam as regiões variáveis ​​das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal 5F9 foram obtidos utilizando 5 ‘RACE-PCR técnicas (Clontech) e foram sequenciados utilizando técnicas de sequenciação de ADN padrão.

A modelagem molecular e humanização de anticorpos

a humanização do anticorpo anti-CD47 5F9 de ratinho foi realizado através da instalação de resíduos de CDR de anticorpos de ratinho para uma estrutura humana da linha germinal (FR) [31]. Resumidamente, rato 5F9 foi humanizado por recrutamento judiciosa de resíduos de CDR correspondente. As diferenças entre o ratinho e 5F9 os resíduos FR humanos foram modeladas individualmente para investigar a sua possível influência na conformação de CDR. genes de VH e VL humanizadas foram sintetizados por McLab (South San Francisco, CA).

transfecção celular

293F células foram cultivadas sob FreeStyle ™ 293 Expressão Médio (Invitrogen). transfecção transiente foi realizada por co-transfecção de vectores de expressão que codificam para o anticorpo da cadeia pesada e da cadeia leve utilizando o reagente de transfecção 293fectin (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Quatro a cinco dias mais tarde, os sobrenadantes de células transfectadas foram colhidas e testadas quanto à secreção de anticorpo por ELISA. Resumidamente, placas de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com anticorpo de gama de 1 ug /ml de anticorpo de cabra anti-Fc humano em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 16 h a 4 ° C. Após o bloqueio durante 1 hora com 0,4% de BSA em PBS, à temperatura ambiente, os sobrenadantes foram adicionados isolados em diluições sequenciais de 1/3, e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas com anticorpos específicos de kapa de cabra anti-humano conjugado com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com TPO. A reacção foi parada com 2 M H

2SO

4, e OD foi medida a 490 nm.

purificação e caracterização de anticorpos

O sobrenadante da cultura foi aplicado a colunas de proteína A Sepharose (GE Healthcare). A coluna foi lavada com PBS, e a proteína foi então eluída com tampão de eluição (tampão de citrato de sódio 0,1 M, pH 3,0). As fracções recolhidas foram neutralizadas com Tris 1 M pH 9,0. Finalmente, as amostras purificadas foram dialisadas contra PBS. Pureza da fracção de anticorpo eluído foi analisado por electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) em géis de 10% sob condições redutoras ou não redutoras. As bandas foram visualizadas por coloração com azul de Coomassie brilhante.

superfície celular de ligação ao antigénio de ensaio

YB2 /0 células que tinham sido transfectadas de forma estável com CD47 humano foram incubadas com 10 ug /ml de Hu5F9-G4 ou HuIgG4 a 4 ° C durante 1 h. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS, seguido por incabation com 10 ug /ml de anticorpo marcado com PE específico gama anti-Fc humano (eBiosciences, San Diego, CA, EUA) a 4 ° C durante 1 h. A ligação foi medida utilizando um FACSCanto (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA). YB2 Un-transfectadas /0 foram utilizadas como um controlo negativo.

ELISA de competição

Um ensaio de ligação competitiva foi utilizado para avaliar a especificidade de ligação ao antigénio do anticorpo anti-CD47 mAb. Resumidamente, placas de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com /ml de proteína de fusão de 1 ug huCD47 /MFC em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 16 h a 4 ° C. Após o bloqueio durante 1 hora com 0,4% de BSA em PBS, à temperatura ambiente, 10 ug /ml de rato 5F9 foi adicionado em placas na presença de várias concentrações de moléculas Hu5F9-G4 à temperatura ambiente durante 1 h marcado com biotina. As placas foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas com estreptavidina conjugada com HRP (Pierce Thermo Scientific) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com TPO. A reacção foi parada com 2 M H

2SO

4, e OD foi medida a 490 nm.

Anticorpo afinidade medição

Um cinomolgo cDNA CD47 foi clonado a partir biblioteca de cDNA de cynomolgus baço (Biochain, China). O domínio extracelular de CD47 cinomolgo foi clonado e fundido com FC de ratinho para gerar uma proteína de fusão cynoCD47 /MFC, o qual foi utilizado na medição de afinidade. CD47 humana /MFC foi feita por meio da fusão do domínio extracelular do ADNc de CD47 humano (Open Biosystems) com FC de ratinho, tal como descrito acima e utilizados para medir a afinidade de ligação dimérica Hu5F9-G4. Além disso, CD47 humana /a proteína de fusão foi feita por meio da fusão do domínio extracelular da CD47 humana de His-tag e usadas para medir a afinidade de ligação para monomérica Hu5F9-G4. os estudos de ligação foram realizados utilizando um Biacore 2000 (GE). O tampão de corrida foi de 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,005% Tween-20. Os dados foram coletados a 25 ° C. Cada amostra foi amina mAb acoplado a um chip sensor CM4 usando activação de NHS /EDC padrão (7 minutos). Cada anticorpo foi diluída para 10 ug /ml em acetato de Na 10 mM, pH 5,0 e injectada até se obter o nível desejado de imobilização. Cada superfície foi então bloqueado com 1 M de etanolamina durante 7 minutos. Cada amostra foi testada em duplicado.

CD47-SIRPα ensaio de bloqueamento de interacção

placas de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 1 ug /ml de SIRPα /proteína de fusão de Fc humana em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 16 h a 4 ° C. Após o bloqueio durante 1 hora com 0,4% de BSA em PBS, à temperatura ambiente, 1 ug /ml de proteína CD47 /FC de ratinho foi adicionado, quer na ausência ou na presença de concentrações crescentes de Hu5F9-G4 à temperatura ambiente durante 1 h. As placas foram subsequentemente lavadas três vezes e incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP anti-rato Fc durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com TPO. A reacção foi parada com 2 M H

2SO

4, e OD foi medida a 490 nm. Cada amostra foi testada em triplicado.

In vitro

fagocitose ensaio

in vitro ensaios de fagocitose foram realizadas como descrito anteriormente. Resumidamente, HL-60 ou células AML humanas primárias de diferentes doentes foram CFSE-rotulado e incubado com macrófagos derivados do sangue periférico humano na presença de diferentes concentrações de 5F9 rato, Hu5F9-G4 ou um anticorpo de controlo de isotipo durante 2 horas a 37 ° C. As células foram lavadas com meio livre de soro IMDM e ressuspensas em 200 ul meios. Em seguida, as células foram analisadas por microscopia de fluorescência para determinar o índice de fagocitose (número de células ingeridos por 100 macrófagos). A análise estatística por meio do teste t de Student foi realizado com GraphPad Prism.

dependente de anticorpos citotoxicidade mediada por células (ADCC) ensaio

ADCC foi realizada de acordo com as instruções do kit Acella-Tox ™ Bioluminescência citotoxicidade (Cell Technology). Em resumo, as PBMC humanas foram incubadas durante a noite a 10

6 células /ml em meio IMDM completo humano com 400 unidades /ml de IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA). No dia seguinte, as PBMC activadas foram utilizadas como células efectoras. 5 x10

3 HL60 células em 25 mL IMDM meio completo humano foram adicionados por poço numa placa de L-bottom 96. Em seguida, 25 ul de meio completo IMDM humano contendo diferentes anticorpos nas concentrações desejadas foi adicionado a cada poço. Após 5 minutos de incubação a 37 ° C, 2,5 x10

5 PBMC em 25 mL de IMDM meio completo humano foi adicionado a cada poço para dar uma proporção de células efectoras para células alvo de 50: 1. As misturas foram incubadas a 37 ° C durante 4 horas, seguido por detecção utilizando reagentes fornecidos pelos kits. Os ensaios foram repetidos três vezes e figuras representativas são mostrados aqui.

citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ensaio

5 x 10

4 células-alvo em 50 ul IMDM + 10% FBS + Pen /Strep foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços com fundo em U. 50 uL de anticorpos foi adicionado a várias concentrações (diluídas com meio), a partir de 10 ug /mL a 10

-5 ug /ml, com intervalos de 100 x diluição. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, e, em seguida, 50 ul de soro de complemento humano foi adicionado a cada poço, misturado e a placa foi incubada a 37 ° C. Após 2 horas de incubação, 50 uL de Alamar azul (ABD Serotec) foi adicionado em cada poço, misturado e a placa foi incubada a 37 ° C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi arrefecida até à temperatura ambiente durante 15 minutos e lidas por leitor de placas SpectraMax M3 para sinais de fluorescência no comprimento de onda de excitação de 530 nm comprimento de onda e de emissão de 590 nm. unidade de fluorescência relativa (RFU) foi usado para indicar o valor relativo de células vivas após ensaio. Os ensaios foram repetidos três vezes e figuras representativas são mostrados aqui.

receptor CD47 ensaio ocupação

CD47 ligação curva padrão em células de LMA foi feito usando AF488 conjugado Hu5F9-G4 em várias concentrações. Ocupação do receptor foi medida por incubação das células alvo não marcada com Hu5F9-G4 sob diferentes concentrações e depois as células foram ensaiadas tanto no

In vitro

fagocitose ou incubadas com uma concentração saturante de AF488-Hu5F9-G4 com base no curva padrão e analisadas quanto à ligação por citometria de fluxo. ocupação do receptor foi calculada como se segue:

Ensaio de Apoptose

células AML humanas primárias foram descongeladas e as células mononucleares viáveis ​​foram isolados por centrifugação em gradiente de Ficoll sobre utilizando protocolos padrão. As células viáveis ​​foram ressuspensas a 1×10

6 por 50 ul em IMDM + FBS a 5%. Foi adicionado anticorpo de 10 ug /ml Hu5F9-G4 ou controlo de isotipo e as células foram incubadas a 37 ° C durante 3 h. Estaurosporina foi usada como um controlo positivo. As células apoptóticas foram identificados através de coloração com anexina V (BD Biosciences, Cat. # 556547) de acordo com as instruções do fabricante e analisadas por citometria de fluxo.

In vivo

tratamento com anticorpo humano enxertado de LMA murganhos

Todos os experimentos de rato foram realizadas de acordo com um protocolo de Cuidado e Uso Institucional animal Comitê-aprovado (Stanford APLAC # 22264) e na adesão aos Institutos Nacionais de Saúde

Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório

. Todos os ratos neste estudo foram adquiridos da The Jackson Laboratory ou criados em casa. Qualquer animal que exibiu perda de peso, letargia, postura arqueada, com ou sem pêlo arrepiou que não melhorou no prazo de 1 semana de tratamento com Nutrical e fluidos foi eutanasiado. Nós sacrificados animais quando mórbida por protocolos institucionais

Havia dois grupos de ratos nos estudos:. O grupo de controlo tratado com IgG de rato e o grupo experimental tratado com anticorpo Hu5F9-G4. Mortes eram esperados no grupo de controle, devido à falência da medula óssea de leucemia fulminante. O grupo experimental sobreviveram bem e foi sacrificados no final do estudo.

As células criopreservadas de SU028 humano amostra, SU048, SU266 e foram descongelados em 10 mL de meio IMDM (+ 10% de FBS + Glutamax estreptomicina penicilina +) e 100? g de ADNase I (StemCell) para efectuar a depleção de células T. Resumidamente, as células foram lavadas e ressuspensas em tampão de Robosep. CD3 humano selecção positiva 18051 programa de alta recuperação foi seleccionado e após conclusão do programa, a fracção CD3- foi recolhido, contadas, e preparada para injecção intravenosa em HBSS (Life Technology) + 2% de FBS tampão (Omega Science). Modelo humano xenoenxerto AML primário foi criada em NOD /SCID /IL-2Rgnull (NSG) camundongos fêmeas 8-10 semanas de idade. Os ratos foram condicionados com 200 rads utilizando um irradiador gama Faxitron CP-160 até 24 horas antes da injecção intravenosa. 100 mL de 5 x 10

6 células AML primários foram então injectadas em ratinhos NSG pela veia da cauda com uma agulha G 29, Terumo. Ao fim de 5 semanas pós-transplante, células da medula óssea foram aspiradas a partir do fémur usando agulhas de calibre 27G BD e coradas com anti-ratinho de rato CD45.1 PECy7 (eBiosciences, San Diego, CA, EUA), de rato anti-ratinho Ter119 PECy5 (eBiosciences , San Diego, CA, EUA), rato CD45 PB anti-humano (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA), de ratinho anti-CD3 humano de APC-Cy7 (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA), anti-rato humana CD33 PE (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA), e do rato anti-humano CD19 APC (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). A percentagem de células CD33 + AML CD45 + humanas foi determinada por citometria de fluxo. Com base no nível de enxerto de células AML humano, cinco murganhos transplantados com cada amostra ou SU028 SU048 foram divididos em um de dois grupos de tratamento: controlo de IgG de ratinho ou Hu5F9-G4 a 100 ug por dia por injecção intraperitoneal. O tratamento começou no dia 1 e durou 14 dias consecutivos. O soro foi recolhido no pré-tratamento e 2 horas pós-tratamento após a 1ª, 5ª, 8ª, 12ª e 14ª doses para análise PK. Células da medula óssea foram aspirados em diferentes pontos de tempo para analisar o enxerto LMA. Um hemograma completo foi analisada uma vez por mês usando HemaTrue Hematology Analyzer. No dia 159, os ratinhos sobreviventes foram retirados para análise histológica dos ossos da tíbia. Para o tratamento de ratinhos transplantados com SU266, quatro ou cinco foram divididos em três grupos de tratamento: controlo de IgG de rato, Hu5F9-G4 a 100 ug por dia, e Hu5F9-G4 a 500 ug duas vezes por semana. O tratamento começou no dia 1 e durou 14 dias. O soro foi recolhido antes do tratamento e 2 horas após o tratamento para análise PK. Células da medula óssea foram aspirados em diferentes pontos de tempo para analisar o enxerto LMA. Todos os ratinhos foram seguidos para a sobrevivência global, e o valor de p de sobrevivência nos grupos tratados Hu5F9-G4 foi comparado com os grupos de controlo IgG de ratinho. No final do estudo, os ratinhos foram sujeitos a eutanásia através da utilização de CO2 para a eutanásia roedor.

A sinergia de Hu5F9-G4 e rituximab em Raji Luc-EGFP ratos enxertados NSG

Os murganhos foram enxertados com Raji Luc-EGFP a uma concentração de 1 milhão de células /ratinho através de injecção na veia da cauda. Eles foram fotografadas

in vivo

para determinar o nível de enxerto sete dias após o enxerto. O tratamento começou no mesmo dia durante 21 dias consecutivos. Todos os ratinhos foram injectados via intraperitoneal. Os ratos foram fotografadas

in vivo

via IVIS Spectrum Imaging System nos seguintes momentos: pré-tratamento no Dia 7 do enxerto, após os sete doses no dia 14 do enxerto, Pós catorze doses no dia 21 do enxerto, Correios vinte e uma dose no dia 28 e pós-tratamento de uma semana no dia 35. Sobrevivência avaliação foi realizada no dia 217. no final do estudo, os ratinhos foram sujeitos a eutanásia através da utilização de CO2 para a eutanásia roedor.

estudo de toxicidade em primatas não-humanos

Todas as experiências com primatas não-humanos foram conduzidos de acordo com um protocolo de Cuidado e Uso Institucional animal Comitê-aprovado (Stanford APLAC # 26070) e na adesão aos Institutos Nacionais de Saúde

Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório

. Os macacos foram alojados socialmente (actualização de 3 animais do mesmo sexo e grupo de dosagem em conjunto) em gaiolas em aço inoxidável equipado com um piso de malha de aço inoxidável e uma válvula automática de rega. Todos os recintos primários estavam de acordo com que, tal como especificado na Lei USDA Animal Welfare (9 CFR, partes 1, 2 e 3) e, tal como descrito no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Conselho Nacional de Pesquisa. Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório Washington, DC:.. National Academy Press edição atual). Cada gaiola foi claramente marcada com um marcador que indica gaiola estudo, grupo, número de animais, sexo e. Temperatura: 64 ° F a 84 ° F (18 ° C a 29 ° C); Humidade: 30% a 70%; Ciclo de luz: 12 horas de luz e 12 horas de escuridão (exceto durante os procedimentos designados); Ventilação: Dez ou mais renovações de ar por hora com 100% de ar fresco (sem recirculação)

Para o estudo de escalonamento de dose, duas fêmeas foram inscritos e dosado em intervalos de uma semana:. Um NHP foi administrada uma única dose de EPO (17000 U /kg) 5 dias antes da primeira dose de Hu5F9-G4 (3, 10, 30, 100, e 300 mg /kg), e um PNS foi administrado Hu5F9-G4 (1, 3, 10 , 30, e 100 mg /kg) sem pré-tratamento de EPO. Amostras de sangue foram coletadas para a medição de hemogramas completos, incluindo hemoglobina e níveis séricos Hu5F9-G4.

Em estudos NHP separados, macacos cinomolgos fêmeas foram administrados uma única IV perfusão de 1 hora de 0,1, 0,3, 1, 3, 10 ou 30 mg /kg de Hu5F9-G4 ou veículo PBS como um grupo de controlo (um animal por grupo) no dia 1, ou uma dose de escorvamento (DP) no Dia 1 em doses de 1 ou 3 mg /kg, seguido de doses semanais de manutenção (MD) de 10 ou 30 mg /kg Hu5F9-G4 até ao dia 43. Amostras coletadas em diferentes estudos foram os seguintes:

Hematologia. Dose única: sangue foi retirado duas vezes antes das injecções e em 3, 6, 10 e 14 dias após a administração. PD /MD de dose: o sangue foi retirado duas vezes antes de as injeções e aos 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27, 29, 36 e 43 dias após a administração

Química Clínica.. Dose única: sangue foi retirado duas vezes antes das injecções e aos 6 e 14 dias após a administração. PD /MD de dose: o sangue foi retirado duas vezes antes de as injeções e em 6, 13, 20, 29, 36 e 43 dias após a administração

O exame de urina.. Dose única: até 14 ml de urina, foi recolhido duas vezes antes da injecção aos 3 e aos 10 dias após a injecção. Dose de DP /MD:-se a 14 ml de urina foi recolhida duas vezes antes da injecção e aos 3, 10, 17, e 24 dias após a injecção

A análise farmacocinética.. O sangue foi recolhido por venipunctura para tubos sem anticoagulante em diferentes pontos de tempo, como indicado na Figura 4B e 4D. O nível sérico de Hu5F9-G4 foi medido por ELISA, como descrito acima utilizando a proteína de fusão CD47 /FC de ratinho como o reagente de revestimento, seguido por detecção com um anticorpo secundário conjugado com HRP Kappa anti-humano.

Todos os animais foram monitorados duas vezes por dia para verificações de mortalidade e estado moribundo. Os pesos corporais foram medidos pelo menos uma vez pré-estudo e, semanalmente, começando no dia 7.

Resultados

Geração de anticorpos monoclonais contra CD47 humana

Um fragmento de cDNA de CD47 humano que codifica o domínio extracelular foi fundida com FC de ratinho para gerar uma proteína de fusão hCD47 /MFC, o qual foi utilizado para imunizar ratinhos para produzir anticorpos CD47 anti-humano monoclonal de ratinho. A especificidade dos clones de hibridoma seleccionados foram examinados por FACS que se ligam a células de rato YB2 /0 transfectadas com CD47 ou qualquer parentais humanas. Um dos clones positivos foi obtido e designado como 5F9. Utilizando iniciadores universais de anticorpos, regiões variáveis ​​das cadeias pesada e leve do 5F9 foram clonados com sucesso. Vários clones de cada produto de gene V foram sequenciados para monitorar erros induzidos por PCR, e as sequências de aminoácidos de VH e VL de 5F9 foram determinados (Figura 1A e 1B). A análise da sequência de DNA demonstrou que a cadeia pesada do 5F9 utiliza um segmento V do IGHV1 família, e que a cadeia leve pertence ao subgrupo IGKV1.

(AB) Comparação de ratinho e humanizado 5F9 variável pesada (A) e luz (B) regiões. As CDR estão marcados como indicado. (C) de rato YB2 /0 transfectadas de forma estável com células CD47 humano e YB2 parental /0 as células foram coradas com o controlo do isotipo IgG4 humana ou Hu5F9-G4 e analisadas quanto à ligação de superfície por citometria de fluxo. (D) biotinilado de rato 5F9 de ligação a CD47 humana /MFC foi detectada por ELISA na ausência ou na presença de concentrações crescentes de moléculas Hu5F9-G4 ou controlo de isotipo. Cada amostra foi ensaiada em duplicado e são apresentados os valores de SEM. p-valores indicados foram determinados por ANOVA de duas vias em comparação. (E) Ligação de Hu5F9-G4 para monomérica ou dimérica CD47 foi analisada por ressonância de plasma de superfície proporcionando os vestígios indicados e as constantes de ligação. Os dados foram processados ​​por subtracção a partir de respostas a superfície de referência, assim como uma média de injecções de tampão. As respostas foram globalmente apto para um 1: modelo de interação 1, incluindo um termo para transporte de massa. O número entre parênteses representa o erro padrão no último relatou dígitos.

A modelagem molecular e humanização de anticorpos 5F9

A fim de humanizar 5F9, vários modelos 3D do Fv da anticorpo-alvo foram construídas utilizando combinações de estruturas conhecidas. 2PCP e 2JEL exibindo 93% de identidade e 95% de 5F9, respectivamente, foram utilizados para a modelação de VL. 2PCP e 1CIC exibindo 70% de identidade e 78% de 5F9, respectivamente, foram utilizados para a modelação de VH. Para seleccionar as regiões de estrutura de anticorpo humano (FR) para serem usados ​​como modelos para enxerto de CDR, as regiões VL e VH 5F9 de ratinho foram comparadas com as sequências da linha germinativa humana. A experiência foi repetida 3 vezes. A experiência foi repetida 3 vezes.