Abstract
estudos de associação
Genome-larga (GWAS) identificaram uma série de variantes genéticas associadas ao risco de câncer de pulmão. No entanto, estes loci explicam apenas uma pequena fração de herdabilidade câncer de pulmão e outras variantes com fraco efeito pode ser perdido na abordagem GWAS devido ao nível de significância rigorosas após a correção de comparação múltipla. Neste estudo, a fim de identificar as vias importantes que envolvem a carcinogênese de pulmão, foi realizada uma análise de caminho de dois estágios em GWAS de câncer de pulmão em chinês Han usando o método gene definido análise de enriquecimento (GSEA). percursos predefinidos por bancos de dados BioCarta e KEGG foram sistematicamente avaliados em estudo Nanjing (fase Discovery: 1.473 casos e 1.962 controles) e os caminhos sugestivos foram ainda mais para ser validado em estudo Beijing (fase de replicação: 858 casos e 1.115 controles). Descobrimos que quatro vias (achPathway, metPathway, At1rPathway e rac1Pathway) foram consistentemente significativa em ambos os estudos e as
P valores Compra de conjunto de dados combinados foram 0,012, 0,010, 0,022 e 0,005, respectivamente. Estes resultados foram estáveis após análise de sensibilidade com base na definição do gene e gene sobreposições entre as vias. Esses achados podem oferecer novos insights sobre a etiologia do câncer de pulmão
Citation:. Zhang R, Zhao Y, Chu M, Wu C, Jin G, Dai J, et al. (2013) Análise Caminho para Genome-Wide Study Associação de câncer de pulmão em Han Chinese População. PLoS ONE 8 (3): e57763. doi: 10.1371 /journal.pone.0057763
editor: Ge Zhang, do Cincinnati Children Hospital Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de novembro de 2012; Aceito: 24 de janeiro de 2013; Publicação: 01 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é fundado pelo Programa de High-tech Investigação e Desenvolvimento Grant China National (2009AA022705) e parcialmente financiado pela National Key Básico Research Program Grant (2011CB503805) e da National Natural Science Foundation da China (81072389, 30901232, 30730080, 30972541 e 30901233) , a pesquisa constatou para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (20113234110002), Jiangsu Natural Science Foundation (BK2011028), Natural Science Foundation das instituições Jiangsu Ensino Superior da China (11KJA330001 e 10KJA33034), os EU National Institutes of Health subvenção ( U19 CA148127), o Projeto de Pesquisa e Inovação para graduados universitários da província de Jiangsu (CXZZ11_0733), ea prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (PAPD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pulmão é um dos cânceres mais frequentemente diagnosticada e as principais causas de morte por cancro em todo o mundo [1]. Na China, as taxas de incidência e mortalidade do cancro do pulmão têm aumentado rapidamente nos últimos três décadas, principalmente por causa do consumo de tabaco [2]. No entanto, fatores genéticos também desempenham um papel importante na carcinogênese de pulmão. Ao longo dos últimos anos, os estudos de associação do genoma (GWAS) identificaram mais de 10 loci associados com o risco de câncer de pulmão com um efeito modesto para cada polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7], [8]. Contudo, estas variantes foram responsáveis por apenas uma pequena fracção da hereditabilidade de cancro do pulmão [9], [10], [11].
Dado que as interacções do gene para o gene podem contribuir para doenças complexas, tem sido sugerido que combinar as múltiplas variantes com pequeno efeito em conjunto com base em vias biológicas utilizando os dados podem GWAS tendem a detectar os efeitos conjuntos de múltiplos genes e para realçar a via específica agregados em uma determinada doença [12]. Uma grande parte dos genes de susceptibilidade a doenças podem estar relacionadas funcionalmente e /ou interagir uns com os outros em vias biológicas e apenas um pequeno número de vias biológicas podem contribuir essencialmente para a etiologia da doença complexa [13]. Assim, as abordagens baseadas em via têm sido aplicados ao GWAS de várias doenças complexas, e alguns novos caminhos doença-susceptibilidade foram revelados [14], [15], [16], [17], [18], [19] , [20], [21], [22], [23]. Recentemente, Chung et ai. (2012) [24] vias avaliadas associadas ao risco de câncer de pulmão em indivíduos coletados pela American Cancer Society em todos os estados dos EUA usando um método de análise em duas fases aleatória de base florestal caminho baseado em banco de dados KEGG (URL: http: //www.genome .jp /KEGG /pathway.html /), e identificou 4 vias associadas com câncer de pulmão incluindo via de sinalização p53. Enquanto isso, Fehringer et ai. (2012) [25] análise de caminho realizada no risco de câncer de pulmão em indivíduos coletados da Europa Central, Toronto, Alemanha e Texas usando quatro métodos diferentes com base na Gene Ontology (GO) banco de dados (URL: https://www.geneontology.org/), e descobriu que a via de atividade do receptor de acetilcolina foi significativamente associada com o risco de câncer de pulmão utilizando duas abordagens diferentes. No entanto, nenhuma via de análises de câncer de pulmão GWAS são relatados em populações de ascendência não-europeu até à data.
Vários métodos têm sido propostos para a análise de caminho [26], e um do método utilizado é o conjunto de genes análise de enriquecimento (GSEA) [16]. Resumidamente, três passos são usados para análise de caminho no GSEA. Primeiro, a análise de associação individuais-SNP é realizado para determinar o efeito para cada SNP. Em segundo lugar, o SNP representativo com o menor
valor de P
é mapeado para cada gene, e todos os genes são designados para vias biológicas predefinidos. Por fim, todos os genes são classificados por seu significado, e, em seguida, devem ser avaliadas se um grupo específico de genes é enriquecido no topo da lista ordenada por acaso. Como resultado, um conjunto de SNPs relacionados biológicos que apareceu no topo da lista pode ser potencialmente associada à doença como a integração.
Em uma grande escala GWAS de câncer de pulmão na população chinesa Han, nós já validado sugestiva SNPs com um
valor P
≤1.0 × 10
-4 em populações independentes e encontraram cinco novos loci relacionados com o risco de câncer de pulmão com tamanho de efeito (odds ratio) variando 0,84-1,35 em um genome-wide nível de significância de [3], [4]. Para além disso compreender profundamente o mecanismo da genética de câncer de pulmão e identificar a via crucial para substâncias cancerígenas pulmonares, atualmente realizada uma análise via de duas fases utilizando o método de GSEA base nos nossos dados GWAS existentes na população Han chinês. Na fase 1, nós analisamos todas as vias disponíveis em estudo Nanjing usando 1.473 casos e 1.962 controles. Na fase 2, as vias com
P
valoriza ≤0.05 e
FDR
≤0.50 foram validados no estudo de Pequim usando 858 casos e 1.115 controles.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo colaborativo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais da China University Medical, Tongji Medical College, Universidade de Fudan, Nanjing University Medical e Guangzhou Medical College com consentimento informado por escrito de todos os participantes [27 ], [28], [29], [30].
Os participantes do estudo
O estudo indivíduos eram de um dois-center em curso GWAS de câncer de pulmão na China, incluindo o estudo Nanjing e Pequim estude. Os detalhes da população foram descritos em outro [3]. Resumidamente, havia 1.473 casos e 1.962 controles em estudo Nanjing, 858 casos e 1.115 controles em estudo Pequim após controle de qualidade. Todos os casos de câncer de pulmão foram histologicamente ou citologicamente confirmada por pelo menos dois patologistas locais. Todos os controles foram selecionados entre aqueles que receberam exames físicos de rotina em hospitais locais ou aqueles que participam no rastreio comunidade de doenças não transmissíveis e para a idade, sexo e regiões geográficas para cada conjunto de casos de câncer de pulmão correspondeu frequência.
Genotipagem e Controle de Qualidade
a genotipagem foi realizada utilizando uma matriz Affymetrix Genome-Wide SNP Humano 6.0. Um procedimento de controle de qualidade sistemática foi aplicada para ambos os SNPs e indivíduos antes de análise de caminho [3]. Resumidamente, SNPs foram excluídos se não mapear nos cromossomos autossômicos, teve uma taxa de chamada de 95%, menor freqüência do alelo (MAF) 0,05,
P Art 1 × 10
-5 de Hardy-Weinberg (HWE) em amostras combinados de dois estudos ou
P Art 1 × 10
-4 de HWE em qualquer uma das amostras de estudo Nanjing ou Pequim. Nós removemos amostras com taxa de chamada de 95%, de gênero ambíguo, relações familiares, taxa de heterozigosidade extrema e discrepantes. Finalmente, um total de 2.331 casos e 3.077 controles (estudo Nanjing: 1.473 casos e 1.962 controles; estudo de Pequim: 858 casos e 1.115 controles) com 570,373 SNPs foram permaneceu na análise de caminho posterior
Caminho de Dados Construção
Foram coletadas percursos de dois recursos públicos: KEGG e BioCarta banco de dados (URL: https://www.biocarta.com/). Vias contendo genes de 10 a 200 foram incluídos neste estudo. Este intervalo de números gene foi considerada adequada para reduzir a emissão de comparações múltiplas e evitar testando categorias de genes funcionais demasiado estreitas ou largas [22]. sobreposição via foi definida como a percentagem de genes compartilhados para os totais de dois caminhos [14].
Análise Estatística
modelo de regressão logística com ajuste para idade, sexo, ano-maço de tabagismo e os primeiros quatro componentes principais derivados de EIGENSTRAT 3.0 [31], foi utilizado para avaliar a significância associação de cada SNP, usando o pacote de software executado em GLM R (versão 2.14.0; a Fundação R para a estatística de computação). SNPs foram atribuídos a um gene se localiza-se dentro de 50 kb a jusante ou a montante do gene. O significado de cada gene foi derivado do SNP representativa. Todos os genes foram designados para vias. Em seguida, a associação entre o risco de câncer de pulmão e cada via foi avaliada por software GenGen [16] usando o Kolmogorov-Smirnov-like estatística soma parcial ponderada (indicado por pontuação enriquecimento,
ES
), que refletiu a sobre-representação de um grupo de genes dentro desta via na parte superior de toda a lista de genes classificados no genoma. Nós aleatoriamente embaralhadas o status de caso-controle de 1.000 vezes, e repetiu estes passos acima para obter os resultados de associação via permutadas. Assim, o normalizado
ES
depois de ajustado para diferentes tamanhos de genes, podem ser adquiridos através do procedimento de permutação. Enquanto isso,
P valor
de cada percurso e a taxa de descoberta de falsas (FDR) para manter a proporção de resultados positivos falsos esperados foram derivados. O nível de significância da análise de percursos foi definido para ser
P
≤0.05 e
FDR
≤0.5.
Resultados
informação genética e informação biológica Antes usado em Análise de Caminho
do total de 570,373 SNPs genotipados, 340,060 SNPs foram mapeados em 17,225 genes dentro de 50 kb a montante ou a jusante. Entre eles, 135,160 SNPs foram finalmente atribuído a 3.514 genes dentro dos percursos pré-definidos (41,560 SNPs para 1.003 genes em vias BioCarta e 120.864 SNPs para 3.134 genes em vias de KEGG). Todos os genes foram designados para 368 vias que continham 10 a 200 genes (191 percursos utilizados na base de dados BioCarta, 177 percursos utilizados na base de dados KEGG) na seguinte análise de caminho.
Resultados da Análise Pathway usando o método GSEA
Conforme apresentado na Tabela 1, um total de 22 vias foram significativas (
P
≤0.05,
FDR
≤0.5) em estudo Nanjing. Entre eles, cinco vias foram replicadas com sucesso no estudo de Pequim, incluindo achPathway (
P
= 0,007), agrPathway (
P
= 0,033), At1rPathway (
P = 0,003
), metPathway (
P
= 0,007) e rac1Pathway (
P
= 0,041). Depois de combinar os dois estudos, quatro dos cinco percursos replicados permaneceu significado, incluindo achPathway (
P
= 0,012), At1rPathway (
P
= 0,022), metPathway (
P
= 0,010) e rac1Pathway (
P
= 0,005). Enquanto, na base de dados KEGG, não foi identificada via (dados não mostrados). Entre as vias significativas (
P
≤0.05) para o conjunto de dados combinados dos dois estudos (Tabela S1 no arquivo S1), estes quatro caminhos identificados foram classificados no topo da lista (No.1 para rac1Pathway, No. 3 para metPathway, No.4 para achPathway e No.5 para At1rPathway)
para o achPathway, 9 de 16 queridos tinha SNPs com
P
valores . 0,05; Do mesmo modo, foram observados 15, 14 e 18 genes significativas entre os 28 genes na At1rPathway, 32 genes na metPathway e 23 genes na rac1Pathway, respectivamente. Os SNPs representativas com o risco de câncer pulmonar em
P
valores 0,01 para cada gene nestes 4 vias apresentados na Tabela 2.
baseado no Caminho Análise de Sensibilidade da Associação
de modo a avaliar a influência da estratégia de mapeamento SNP-para-gene na via de análise, que ainda mapeado SNPs de genes dentro de 20 kb a montante ou a jusante. Vinte e três vias foram significativos em estudo Nanjing, e 7 deles foram replicados em estudo Pequim. Depois de combinar dois estudos em conjunto, três vias (achPathway, metPathway e rac1Pathway) ainda foram significativas (0,019, 0,005 e 0,004, respectivamente) (Tabela S2 em S1 Arquivo). Estas três vias foram também identificadas na abordagem de análise inicial. Além disso, At1rPathway que foi identificado na análise inicial também foi significativa para combinação de dados (
P
= 0,015), embora o
valor P
foi 0,086 em estudo Nanjing. Para as vias significativas observadas no estudo de Nanjing, 19 vias foram detectados em ambas abordagens utilizando ’50 kb ‘regra e ’20 kb’ regra e a taxa de concordância foi de 73,08% (19/26) entre duas abordagens.
considerando-se a sobreposição de genes entre as vias, foram calculadas as sobreposições de pares entre 4 vias identificadas e encontrou as taxas de sobreposição variou de 6,25% a 25,00% (Tabela S3 no arquivo S1). Uma vez que apenas genes significativos nas vias contribuíram para os resultados finais, nós re-calculou as sobreposições entre estas vias usando seus genes significativos, e as taxas de sobreposição foram de 4,17% a 18,75% (Tabela S3 em S1 Arquivo). Além disso, quatro genes (
PAK1
,
PIK3R1
,
pTK2
, e
PTK2B
) que contribuiu para mais de 2 vias (Tabela S4 em Arquivo S1), foram posteriormente removidos da vias de análise de sensibilidade. Como resultado, as quatro vias identificadas (achPathway, metPathway, At1rPathway e rac1Pathway) ainda foram significativas (Tabela S5 em S1 Arquivo) no conjunto de dados combinados (
P
= 0,033, 0,040, 0,039 e 0,012, respectivamente).
Discussão
GWAS identificaram com sucesso um número de loci associados com doenças /traços, que melhoraram muito o nosso entendimento sobre o mecanismo genético destes fenótipos. No entanto, como o procedimento rigoroso controle de qualidade e correção rigorosa sobre as comparações múltiplas são usados em GWAS, SNPs individuais que são realmente associados com fenótipos com efeito modesto pode ter sido perdida. Portanto, uma abordagem baseada no caminho que avalia a contribuição cumulativa dos genes relacionadas com a função pode fornecer novos insights sobre a biologia de uma determinada doença utilizando dados GWAS. GSEA tem duas grandes vantagens em comparação com outros métodos [16], [26]. Em primeiro lugar, ele executa processo de correcção baseada em permutação de dois passos que se ajusta de forma eficaz para diferentes tamanhos de genes e preserva correlações de SNPs no mesmo gene. Em segundo lugar, co-variáveis, tais como idade, sexo ou estratificação populacional em GWAS pode ser ajustado em GSEA. Assim, no presente estudo, foi utilizado GSEA e identificou quatro vias (achPathway, metPathway, At1rPathway e rac1Pathway) que podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do câncer de pulmão em população chinesa Han. Esses achados foram estável após análise de sensibilidade quando se considera a abordagem SNP-to-gene mapeamento e sobreposição de genes entre as vias.
O achPathway (Papel dos receptores nicotínicos de acetilcolina na regulação da apoptose) foi identificado como sendo as principais vias associado com o risco de câncer de pulmão no presente estudo. receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR) são essenciais para a sinalização neuromuscular e também foram encontrados em células não neuronais, tais como células epiteliais brônquicas e linhas celulares de cancro de pulmão, [33], [34] [32]. A nicotina e as suas nitrosaminas carcinogénicas derivados podem desempenhar um papel importante na patogénese do cancro do pulmão através da ligação a nAChRs expressos em células epiteliais do pulmão, que resultam principalmente da resistência das células cancerosas a apoptose [35]. Maneckjee et ai. (1994) mostraram que baixas concentrações de nicotina poderia bloquear a indução de apoptose em células de cancro do pulmão [33]. Além de conferir resistência contra a apoptose, vários estudos têm mostrado que os nAChRs podem induzir a proliferação celular, bem como a angiogénese [36], [37], sendo que ambos estão envolvidas na génese do cancro.
Importante, várias GWAS com base em populações caucasianas têm consistentemente identificado 15q25 como a região suscetibilidade ao câncer de pulmão [5], [6], [7], que contém o cluster gene da subunidade do receptor de acetilcolina nicotínico, abrigando
CHRNA5
,
CHRNA3
e
genes Chrna4
.
TERT
está incluído no achPathway e seus representativos rs2736100 SNP tem sido identificada como um locus de susceptibilidade para cancro do pulmão em diferentes populações étnicas [3], [8], especialmente em populações asiáticas [38], [39], [40].
no (activação mediada angiotensina II de JNK Pathway via de sinalização dependente Pyk2) At1rPathway, Clereet. al (2010) propôs que a angiotensina II receptor de tipo 2 (AT2R) iria promover o desenvolvimento do tumor, incluindo tanto a proliferação de células malignas e angiogénese de tumores [41]. A sobre-expressão do receptor de angiotensina II do gene do tipo 2 induz a morte celular em células de adenocarcinoma de pulmão [42], [43]. A via JNK activada aberrante pode causar morte celular patológica e diferentes doenças, incluindo o cancro [44], enquanto as mutações na via da JNK também pode ser envolvido no desenvolvimento do cancro [45].
Para o metPathway (sinalização de crescimento de hepatócitos receptor do factor), o receptor do factor de crescimento de hepatócitos, também chamado de c-Met, é activada pelo factor de crescimento de hepatócitos (HGF). Aberrante sinalização de c-Met desempenha um papel significativo na patogênese e biologia dos cânceres humanos [46]. Enquanto isso, mutantes e sobre-expresso formas de c-Met estão associados com a oncogénese e metástase, fazendo com c-Met um potencial alvo terapêutico para o cancro drogas [47], [48]. Curiosamente, receptor de c-Met e factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores podem inibir a proliferação celular sinergicamente e promovem a apoptose no cancro do pulmão [49]. Yano et ai. (2008) propuseram que a ativação MET HGF mediada pode induzir resistência gefitinib no adenocarcinoma de pulmão com
EGFR
mutações ativadoras [50].
Para o (via Rac 1 motilidade celular sinalização) rac1Pathway, rac-1 é uma pequena proteína de ligação de GTP Rho na família que regula a motilidade celular e a proliferação em resposta a sinais extracelulares [51]. Enquanto isso, Rac-1 pode funcionar como oncogenes em fibroblastos quando sobre-expressa [52]. Rab5 pode induzir a activação do ácido rac através de vários mecanismos, tráfico Rab5-regulada de Rac está envolvido na motilidade celular, o que também pode influenciar a migração de células durante a morfogénese e a metástase de cancros [53], [54]. Enquanto isso, a ativação Rac pelo complexo IRSp53 /Eps8 desempenha um papel importante no comportamento metastático das células tumorais malignas [55].
Além disso, nós também verificados os caminhos relatados por Chung et al. (2012) e Fehringer et ai. (2012) em nosso estudo. Curiosamente, a associação mais forte relatado por Fehringer et ai. (2012) foi a via de actividade do receptor da acetilcolina, enquanto o achPathway foi identificado no presente estudo. Alguns estudos têm demonstrado que a activação de receptores de acetilcolina nicotínicos podem alterar a sinalização apoptótica, assim como estimular a proliferação, ambas as quais desempenham um papel importante na carcinogénese pulmonar [56], [57], [58]. Os resultados consistentemente apoiar a importância das vias 2 no desenvolvimento de cancro do pulmão, o qual é biologicamente plausível. No entanto, não encontramos sinais significativos por outras vias relatados. Isso pode ser explicado pela heterogeneidade étnica, métodos de análise via diferentes ou definição de caminhos de bancos de dados diferentes.
Este estudo tem vários pontos fortes. Primeiro, foi realizada uma análise de caminho de dois estágios em duas populações independentes, que podem reduzir os resultados falso-positivos e melhorar a credibilidade dos resultados. Em segundo lugar, as quatro vias identificadas ainda eram estáveis após análise de sensibilidade ao considerar abordagens de mapeamento SNP-a-gene e sobreposição de genes entre as vias. Este ponto, bem como a biologia importante das vias identificadas na carcinogénese do pulmão tem aumentado a confiança de que os nossos resultados podem ser verdade que não seja apenas por acaso. No entanto, várias limitações são também precisam ser abordadas neste estudo. Em primeiro lugar, anotação incompleta do genoma humano pode reduzir o poder do estudo para a análise de via, uma vez que muitos genes de função desconhecida não pode ser atribuído a vias conhecidas e SNPs intergénicas fisicamente distantes a partir de genes não foram incluídos ainda. Assim, novos estudos com base na melhoria da base de dados do genoma-anotação pode fornecer entendimentos adicionais em genética de câncer de pulmão. Em segundo lugar, diferentes bases de dados via têm diferentes orientações para a construção de via. Assim, o conteúdo de genes de vias que representa o mesmo processo biológico pode variar consideravelmente entre diferentes bases de dados [14]. Nós só focado em bases de dados KEGG e BioCarta que podem ter acesso restrito a nossa análise, devido à definição inerente da via, embora esses dois bancos de dados têm sido comumente usado em análise de caminho [19], [22], [24]. Finalmente, é melhor para realizar a análise de interação ou interação gene-gene análise do gene fumadores para discutir mais sobre o envolvimento dessas quatro vias na carcinogênese relacionada ao tabagismo. Vamos investigá-los em nossos estudos futuros.
Em resumo, este estudo realizou uma análise de caminho de dois estágios em GWAS de câncer de pulmão em chinês Han usando o método de GSEA, e identificou quatro vias (achPathway, metPathway, At1rPathway e rac1Pathway) associado com o risco de câncer de pulmão. Estes resultados podem ser um complemento importante para GWAS e fornecer novos insights sobre a biologia do câncer de pulmão.
Informações de Suporte
arquivo S1.
Tabela S1. O ranking de vias com base no conjunto de dados combinados dos estudos Nanjing e Pequim. Tabela S2. Análise de sensibilidade de análise de caminho de genes definidos por SNPs dentro de 20 kb a montante ou a jusante. Tabela S3. Gene sobreposições entre 4 vias identificadas para todos os genes definidos pelo banco de dados BioCarta ou genes com SNPs representativos significativas (
P Art 0,05)
a. (A) A parte inferior esquerda da matriz simétrica é o número de genes sobreposição entre as vias de pares e seu número total de genes. A parte superior direita é a taxa de sobreposição entre as vias de pares (%). Tabela S4. Genes com SNPs representativos significativas (
P
≤0.01) contribuiu para múltiplos caminhos. (A) Derivado do modelo de regressão logística com ajuste para idade, sexo, pack-ano de componentes para fumadores e principais no conjunto de dados combinados dos estudos Nanjing e Pequim. Tabela S5. Os resultados da análise de sensibilidade para 4 vias identificadas após a remoção genes sobrepostos significativas (
PAK1
,
PIK3R1
,
pTK2
e
PTK2B
).
doi: 10.1371 /journal.pone.0057763.s001
(DOCX)
Reconhecimentos
os autores agradecem a todos os sujeitos do estudo, a equipe de pesquisa e alunos que participaram neste trabalho. Nós também apreciamos dois revisores anônimos por suas valiosas sugestões para este manuscrito.