Abstract

Purpose

Para determinar a frequência e valor prognóstico das alterações de microssatélites elevados na repete tetranucleotídeo selecionados (EMAST) em câncer colorretal metastático (mCRC) pacientes em relação aos microssatélites instabilidade (MSI ) status e expressão da proteína MSH3.

material e Métodos

A frequência de EMAST foi avaliada em pacientes com CCRm com tumores MSI e tumores microsatélites estáveis ​​(MSS). Uma visão geral da literatura foi realizada para comparar a frequência de EMAST em nosso estudo com os dados existentes. Imuno-histoquímica para MSH3 foi comparado com o estado EMAST. O resultado foi estudada em termos de sobrevida global (OS) de pacientes com CCRm com tumores MSI e MSS.

Resultados

EMAST foi avaliada em 89 pacientes com tumores MSI (incluindo 39 pacientes com síndrome de Lynch) e 94 pacientes com tumores MSS. EMAST foi observada em 45,9% (84 de 183) dos pacientes, com um aumento da frequência em tumores MSI (79,8% versus 13,8%, p 0,001). Nós não encontramos nenhuma correlação entre a expressão da proteína EMAST e MSH3. Não houve efeito da EMAST sobre o prognóstico em pacientes com tumores MSS, mas os pacientes com tumores /não-EMAST MSI tiveram um prognóstico significativamente melhor do que pacientes com tumores MSI /EMAST. (OS: HR 3,22, 95% CI 1,25-8,30)

Conclusão

Frequência de EMAST foi aumentada em doentes com CCRm com tumores MSI, em comparação com tumores MSS. Os nossos dados sugerem que a presença de EMAST correlaciona com piores OS nestes pacientes. Não houve efeito da EMAST no prognóstico de pacientes com tumores MSS. Uma limitação do nosso estudo é o pequeno número de pacientes em nossa análise de subgrupo

Citation:. Venderbosch S, van Lent-van Vliet S, de Haan AFJ, Ligtenberg MJ, Goossens M, Punt CJA, et al. (2015) EMAST está associada a um mau prognóstico em microssatélites Instable câncer colorretal metastático. PLoS ONE 10 (4): e0124538. doi: 10.1371 /journal.pone.0124538

Editor do Academic: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 27 de junho de 2014; Aceito: 15 de março de 2015; Publicação: 17 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Venderbosch et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: Devido à ética restrições, estão disponíveis mediante solicitação de [email protected] dados relevantes

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma concessão do Grupo Câncer Colorretal Holandês (DCCG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro colorrectal (CRC) carcinogénese é um processo de passos múltiplos em que diferentes vias estão envolvidas, entre os quais a instabilidade microssatélite (MSI) é importante [1-3]. MSI é caracterizada por um sistema de reparação de emparelhamentos incorrectos deficiente, o que leva ao desenvolvimento de cancro através da acumulação de mutações de desvio de enquadramento não reparados em sequências repetidas simples ou microssatélites [4]. Até à data várias proteínas de reparação de emparelhamentos incorrectos (MMR) foram identificados em seres humanos: MSH2, MSH3, MSH6, MLH1 e PMS2. MSH2 forma um heterodímero com MSH6 ou MSH3, dando origem a MutSα ou MutSβ, respectivamente [5]. MutSα reconhece incompatibilidades de pares de base individuais e loops de inserção-deleção pequenas (IDLs), enquanto MutSβ preferencialmente reconhece incompatibilidades e IDLs maiores. Além disso, MLH1 e PMS2 formar MutLα, que actua como um matchmaker molecular. Além do defeito MMR primário, perda secundária de proteínas MMR pode ocorrer como consequência da

MSH3

e

MSH6

mutações de mudança de quadro promovido pela

MLH1

inativação [6, 7] ou por causa de MSH3 e MSH6 degradação da proteína em tumores que não expressam o seu parceiro heterodimérico MSH2 [8,9]. Como resultado, os defeitos individuais ou combinadas de subunidades MMR (MutSα, MutSβ e mutL) pode variavelmente subjacentes à instabilidade genética de tumores MSI. alterações da linha germinativa de genes MMR são a causa da MSI em pacientes com síndrome de Lynch [10]. MSI também é observada em 10-20% dos pacientes com CRC esporádica, geralmente devido a hipermetilação do promotor do

MLH1

gene [11,12]. tumores MSI tem características distintas, tais como a localização no cólon proximal, uma alta incidência de infiltrado linfocítico, uma histologia anel mucinoso ou sinete pouco diferenciado [13]. tumores MSI estão associadas a um prognóstico favorável no câncer de cólon estágio precoce [14].

Uma forma distinta de MSI é observado em vários tipos de cancros e é chamado de “alterações de microssatélites elevado em tetranucleotídeo selecionado repete ‘(EMAST) em contraste com mono e instabilidade baseada dinucleotídeo na MSI comum [15-20]. Apenas alguns estudos descrevem este subtipo em um pequeno número de pacientes com CCR [21-24]. EMAST não tem sido associada a defeitos maiores em reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN. a expressão da proteína heterogéneo e reduzida de MSH3 foi observada em associação com EMAST no CRC [21-24]. relatórios mais recentes sugerem que a deficiência MSH3 é a causa de EMAST em células de CRC humanos [25,26]. A ligação entre MSH3 e EMAST sugere um efeito adquiridas, como nenhuma mutação germinal no

MSH3

já foi demonstrado [4]. Há uma ampla gama na prevalência de EMAST é CRC e o significado biológico de EMAST no CRC não é clara. Apenas um artigo descreveu uma associação com a evolução para a fase II /III pacientes CRC [27].

apenas dados limitados disponíveis sobre EMAST ou expressão MSH3 em pacientes com CCR. No presente estudo avaliou-se a frequência de EMAST no MSI e estáveis ​​microssatélites tumores (MSS) CRC. Além disso, avaliou-se em uma análise exploratória o papel de EMAST como um biomarcador prognóstico em pacientes metastáticos CRC (CCRm).

Material e Métodos

populações de pacientes

Os dados foram derivada de pacientes com CCRm incluídos em dois grandes estudos de fase III: CAIRO (ClinicalTrials.gov NCT00312000) (n = 820) e CAIRO2 (n = 755) (ClinicalTrials.gov NCT00208546), cujos resultados foram publicados anteriormente [28,29 ]. Recolha de (FFPE) material fixado com formalina embebido em parafina do tumor primário era parte do protocolo inicial nos dois estudos. Para determinar o valor da frequência e prognóstico da EMAST em pacientes com CCRm com tumores MSI Foram selecionados 50 pacientes com CCRm com tumores MSI tratados em ambos os estudos Cairo. Desde MSI é relativamente rara em mCRC nós combinamos os pacientes do CAIRO (n = 19) eo CAIRO2 (n = 31) estudo. Nenhuma coorte de validação pode ser seleccionado para pacientes MSI. Para avaliar a relação entre EMAST e MSI, recuperamos 39 tumores de pacientes de CRC (amostras anónimas) com síndrome de Lynch conhecido (fase I-IV) do nosso próprio banco de dados (que foi configurado conforme as orientações do comitê de ética médica local (Commissie Mensgebonden Onderzoek Radboudumc) com consentimento informado por escrito dos pacientes, a partir do qual o uso de tecido é aprovado para este estudo). Para determinar o valor da frequência e prognóstico da EMAST em pacientes com CCRm com tumores MSS foram selecionados 54 pacientes do estudo CAIRO com características comparáveis ​​(teste). Os pacientes no grupo de teste foram todos tratados com primeira linha capecitabina em monoterapia durante pelo menos 3 ciclos, localização do tumor primário no cólon ou sigmóide recto- que foi ressecado, a OMS desempenho do escore 0, normal, soro da linha de base de lactato desidrogenase (LDH) de concentração, e não tinham recebido quimioterapia adjuvante anterior. Além disso, foram selecionados aleatoriamente 40 pacientes com CCRm adicionais com tumores MSS tratados no mesmo estudo CAIRO como um grupo de validação. (Fig 1)

análise EMAST

DNA genômico foi extraído entre quatro e oito microdissectados manualmente 30 mm seção de FFPE tecido dos tumores primários. Áreas contendo 50% de células tumorais foram seleccionados por avaliação microscópica de um diapositivo de referência coradas com H E. O ADN genómico a partir de tecidos MICRODISSECADO foi isolado utilizando o kit de micro DNA QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) seguindo as instruções do fabricante. concentração de ADN foi determinada a 260 nm utilizando o espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, EUA). EMAST análise foi realizada em duplicado em ADN normal e tumoral dos doentes seleccionados. estado EMAST foi determinado por análise de PCR e utilizando GeneScan cinco marcadores tetranucleotídeo: MYCL1, D8S321, D9S242, D20S82 e D20S85 (S1 Tabela) [23]. Um tumor foi definido EMAST se, pelo menos, dois dos cinco marcadores mostrou instabilidade e não-EMAST se apenas um ou nenhum dos marcadores mostrou instabilidade [22].

Os pacientes foram analisados ​​para a frequência e o valor prognóstico em quatro diferentes grupos: pacientes com tumores combinados MSI e EMAST (MSI /EMAST), pacientes com tumores combinados MSI e não EMAST (MSI /não-EMAST), pacientes com tumores combinados MSS e EMAST (MSS /EMAST) e pacientes com combinado MSS e os tumores não-EMAST (MSS /não-EMAST). A frequência de EMAST foi comparado para pacientes com tumores MSI e MSS. O resultado foi analisado dentro do grupo de pacientes com tumores MSI (excluindo os pacientes com síndrome de Lynch) para EMAST comparação com tumores não-EMAST e dentro do grupo de pacientes com tumores MSS para EMAST comparação com tumores não-EMAST.

a imuno-histoquímica MSH3

a imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada em microarrays de tecido (TMA) dos tumores primários de 549 doentes randomizados no estudo elegíveis Cairo como previamente descrito [30]. 4 uM lâminas foram cortadas de cada TMA e montado no vidro. Xileno e etanol foram usadas para desparafinização e desidratação das lâminas TMA. Água e solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram usadas para a lavagem das lâminas. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio em PBS durante 30 min e as lâminas foram lavadas com água, após o que a recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada. As lâminas foram coradas com um anticorpo monoclonal contra MSH3 (clone ERP4334;-Epitomics uma empresa Abcam, Burlingame, CA, EUA), diluição 1: 5000. Dois pesquisadores independentes realizaram o placar, e se a pontuação slide não foi inequívoca, a opinião de um terceiro pesquisador (patologista IDN) foi final. padrão de coloração da proteína MSH3 foi avaliada usando o epitelial normal, células estromais e inflamatórias como controlo interno. baixa expressão de proteína MSH3 foi definida como 85% da coloração castanha de núcleos celulares em células tumorais e a expressão da proteína de alta MSH3 foi definida como coloração castanha ≥85% de núcleos celulares em células tumorais e não se aplica se nem células tumorais ou do estroma mostrou proteína MSH3 expressão [21].

MSI, hipermetilação do promotor do gene MLH1 e estado BRAF

Para amostras de ambos os estudos Cairo, imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada em tecido FFPE com anticorpos contra MLH1, MSH2 , MSH6 e PMS2. Além disso, a análise foi realizada MSI onde havia uma ausência de expressão de proteína MMR ou IHC resultados ambíguos. estatuto MSI foi determinada utilizando dois marcadores microssatélites (BAT 25 e BAT 26). Se apenas um destes marcadores mostrou instabilidade, a análise foi estendida com quatro marcadores adicionais (BAT 40, D2S123, D5S346, e D17S250). Um tumor foi definida como a MSI se, pelo menos, dois dos seis marcadores mostrou instabilidade ou MSS se nenhum dos marcadores mostrou instabilidade. Tumores com apenas um dos marcadores que mostram instabilidade foram definidos como MSI-baixa e incluídos na categoria MSS. [30] Estado hipermetilação do

MLH1

promotor do gene e da

BRAF

estado de mutação V600E , foi avaliada como descrito anteriormente [30-32]

a análise estatística

Para a análise EMAST, os pacientes foram divididos em duas categorias:. tumores EMAST e não EMAST. A associação entre EMAST e expressão da proteína MSH3 foi investigada com um modelo de regressão logística com o grupo de fatores independentes e expressão MSH3. OS foi definido como o tempo desde a data da randomização até a data de morte por qualquer causa. curvas OS foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas usando um modelo de risco proporcional de Cox. Todos os testes foram em frente e verso e p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises foram realizadas utilizando o sistema SAS versão 9.2.

estratégia de busca Literatura, critérios de inclusão, e os dados de extração

Nós revisamos a literatura sobre a frequência de EMAST em pacientes com CCR com tumores MSI e MSS . A pesquisa foi realizada de Medline, PubMed e Cochrane Library de janeiro de 1990 a abril de 2014, com uma restrição de língua Inglês, usando os seguintes termos de pesquisa: EMAST, tetranucleotídeo repetir, em combinação com cancro do cólon e cancro colorectal. Foram selecionadas publicações originais se o resumo continha dados para pacientes com EMAST. No caso de publicações duplicados, o estudo mais recente e /ou mais completa foi incluído. Publicações Foram excluídos frequência de EMAST limitou-se a qualquer pacientes com tumores MSI ou MSS.

Resultados

Prevalência de EMAST

No geral, EMAST foi observada entre os 45,9% de um total de 183 tumores (Tabela 1). Frequência de EMAST foi significativamente maior entre pacientes com tumores MSI em comparação com tumores MSS:. 79,8% em comparação com 13,8% (p 0,001)

Em pacientes com MSS /EMAST os tumores instabilidade foi normalmente no 2 EMAST loci (69,2%, 9 em cada 13), enquanto que em pacientes com MSI /EMAST os tumores instabilidade foi frequentemente mostrado em 4 (33,8%, 24 em 71), ou 5 (50,7%, 36 em 71) EMAST loci ( Fig 2A). A frequência mais elevada de instabilidade em tumores EMAST foi demonstrada no locus D20S82 (91,7%, 77 de 84), seguido pelo locus MYCL1 (86,9%, 73 de 84), o locus D9S242 (84,5%, 71 de 84 ), o locus D8S321 (72,6%, 61 de 84) e o locus D20S85 (65,5%, 55 de 84) (Fig 2B).

EMAST e MSH3

a maioria dos pacientes com CCRm (n = 381, 69,4%) tiveram uma elevada expressão de MSH3 em células de tumor (Figura 3). 21,1% dos tumores demonstraram a heterogeneidade nuclear através da expressão de ambos os núcleos positivos e negativos sobre MSH3 coloração IHC (Fig 3A-3C). Ambos expressão MSH3 e estado EMAST era conhecido em 139 pacientes. a expressão da proteína heterogénea ou alta MSH3 não se correlacionou com o status EMAST (p = 0,088 e p = 0,856, respectivamente).

expressão heterogênea MSH3 proteína (A), demonstrada pela expressão de ambos marrom (positivo) e azul ( negativos) núcleos por coloração MSH3 IHC. Baixa expressão de proteína MSH3 foi definida como 85% da coloração castanha de núcleos de células de células tumorais (B) e a expressão da proteína de alta MSH3 foi definida como coloração castanha ≥85% de núcleos de células em células de tumor (C)

O desfecho de pacientes com tumores MSI

Os pacientes com tumores MSI /EMAST eram maioritariamente do sexo feminino (52% versus 22%, respectivamente, p = 0,038) (Tabela 2). Além disso, os tumores EMAST foram mais frequentemente localizado acima da área rectosigmoid (93% versus 63%, p = 0,006).

Median OS foi significativamente pior para pacientes com MSI /EMAST comparação com MSI /não- tumores EMAST tratados em ambos os estudos Cairo (11,4 contra 39,4 meses, respectivamente, HR 3,22; IC 95% 1,25-8,30) (Tabela 3).

MSI /EMAST ea relação às proteínas MMR

A distribuição de perda da MMR proteínas em tumores CCRm se resumido na figura 4A. A maioria dos pacientes com tumores MSI mostrou perda de MLH1 e /ou expressão da proteína PMS2 (72,0%, 36 de 50 pacientes). Perda de MSH2 e /ou expressão da proteína MSH6 foi encontrada em 18,0% (9 de 50) dos pacientes. Estes pacientes são susceptíveis Lynch ou pacientes com síndrome de Lynch-like. Apenas 7,1% (3 em 42) dos pacientes com um tumor MSI /EMAST mostrou perda de expressão da proteína MSH6, em comparação com 62,5% (5 de 8) de pacientes com tumores MSI /não-EMAST.

(A). Percentagem de pacientes com síndrome de Lynch conhecido e mutações germinativas dos diferentes genes MSI, subdividido em pacientes com tumores MSI /EMAST e pacientes com tumores MSI /não-EMAST (B).

hipermetilação do

MLH1

promotor do gene (32 de 40 pacientes) e

BRAF

mutações (24 dos 40 pacientes) foram limitados aos pacientes com um tumor MSI /EMAST (p 0,001 e p = 0,004, respectivamente).

EMAST em pacientes com síndrome de Lynch

a fim de analisar melhor a relação entre MSI e EMAST foram selecionados 39 pacientes com síndrome de Lynch conhecido (com mutações germinativas em

MSH2

gene (n = 11),

MLH1

gene (n = 10),

MSH6

gene (n = 10) e

gene PMS2

(n = 8)). A maioria dessa população mostrou EMAST (29 de 39 pacientes). Nenhum dos pacientes mostrou hipermetilação do

promotor do gene MLH1

, e todos os tumores foram

BRAF

de tipo selvagem. Nove em cada 10 pacientes com tumores não-EMAST tinha uma mutação germinativa no

MSH6

(Fig 4B).

O desfecho de pacientes com tumores MSS

paciente de linha de base e tumor características de pacientes com tumores MSS (grupo de teste e grupo de validação), subdividido por EMAST e tumores não EMAST são apresentados na Tabela 2. não houve diferença significativa nos resultados para os pacientes com EMAST em comparação com pacientes com tumores não-EMAST (Tabela 3 ).

a revisão da literatura

a pesquisa bibliográfica identificou 7 estudos em que EMAST foi descrito no estádio pacientes I-IV CRC com tumores MSI e MSS [21-24,27,33, 34]. Foram excluídos os dois estudos: um estudo descreveu a mesma população [23] e um estudo avaliou a prevalência de EMAST apenas em pacientes com tumores MSS [27]. Três estudos tinham números de tumores MSI limitado. Fig 5 resume a parcela florestal dos 5 estudos publicados e atual estudo sobre a prevalência de EMAST em pacientes na fase I-IV CRC com tumores MSI e MSS. EMAST é significativamente mais frequente em tumores com MSI (148/174) (RR 4.80, 95% intervalo de confiança 3,90-5,91). Foi observada uma heterogeneidade significativa.

Discussão

Este estudo apresenta a análise da frequência e valor prognóstico da EMAST em pacientes com CCRm. Embora EMAST foi observada em 45,9% de todos os pacientes com CCRm, que foi mais pronunciado em tumores MSI (79,8%). A frequência de EMAST entre os tumores MSS (13,8%) foi muito inferior em nosso estudo em comparação com a maioria dos estudos em fase I-IV CRC [21-24,27,34]. A ampla gama de frequência (0,54-60,2%) de EMAST entre os tumores MSS descritos na literatura [21-24,27,33,34] pode ser devido ao fato de que não há um consenso sobre a definição de EMAST eo painel necessário para o seu diagnóstico. Devido à natureza polimórfica de repetições tetranucleotídeo no estudo atual que usamos critérios rigorosos para a definição de EMAST:., Pelo menos, dois dos cinco marcadores tetranucleotídeo deve mostrar instabilidade

Apesar do fato de que vários estudos pequenos (n = 3 a n = 56) [21-24,33,34] demonstraram que a MSI invariavelmente associada com EMAST, a correlação entre EMAST MSI e não é amplamente aceite. Encontramos uma alta frequência de EMAST em tumores MSI, o que foi confirmado em uma análise da literatura existente na fase I-IV CRC (Fig 5). Apenas um pequeno subconjunto de pacientes com tumores MSI é não-EMAST. Curiosamente, a maioria dos pacientes com tumores MSI /não-EMAST mostrou perda de MSH6. Isto está de acordo com o fato de que MSH6 só está envolvida na reparação mononucleótido incompatibilidade [35,36]. Pacientes com tumores MSI /não-EMAST são mais frequentemente do sexo masculino e desenvolveram tumores mais frequentes no reto, essas características são comparáveis ​​aos pacientes com

MSH6

mutações germinativas [37]. Na nossa população de tumores MSI a presença de EMAST está correlacionada com

MLH1

deficiência, o que provoca uma avaria total reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN, tanto na síndrome de Lynch, bem como na configuração esporádica, confirmando observações anteriores [21,27 ].

os dados sobre o fenótipo EMAST na CRC são escassos e subjacente mecanismo (s) permanecem obscuros. Os relatórios mais adiantados sugeriram que EMAST pode estar associado a mutações no

TP53

gene [16,17] ou que agentes cancerígenos ambientais podem agravar este fenótipo [38], em que não sejam CRC cancros. Mais tarde, foi feita uma associação entre a perda de MSH3 e EMAST no CRC [21]. Devido ao facto de MutSβ tem uma forte afinidade para o reconhecimento de mais do que dois nucleótidos desemparelhados e complementação genética de deficiência de MSH3 em células humanas maior estabilidade em loci contendo dinucleótido e repete tetranucleotídeo [39], argumentou-se que esta perda de MutSβ devido à MSH3 a inactivação pode resultar em MSI, não só em loci contendo repetições dinucleotídicas, mas também em loci com repetições tetranucleotídica, tais como EMAST [21]. Estudos recentes confirmam a associação entre a perda de MSH3 e EMAST na CRC, no entanto, o mecanismo subjacente exata permanece desconhecida [25,26]. Nós não conseguiu demonstrar uma correlação entre a expressão da proteína MSH3 e EMAST. Na verdade, nós encontramos o padrão de expressão heterogênea de MSH3 em 21,1% dos pacientes, como descrito por outros, embora isso não se correlacionou com EMAST. No entanto nosso estudo tinham um pequeno número de pacientes. Outra possível explicação para a diferença entre nosso estudo e estudos anteriores pode ser um viés undersampeling potencial desde que usamos um espécime TMA por tumor em vez de lâminas tumorais completas.

Nós demonstramos que pacientes com tumores MSI /não-EMAST teve um prognóstico significativamente melhor em comparação com pacientes com tumores MSI /EMAST. A adição de EMAST a tumores MSI parece piorar o prognóstico global e sobrevivência. O grupo MSI /não-EMAST seria esperado para ser enriquecido para

MSH6

deficiência desde EMAST seria identificado com um defeito total de reparo incompatível DNA, tal como com

MLH1

ou

MSH2

deficiência. Os nossos resultados sobre a correlação de EMAST com o resultado clínico deve ser interpretado com cautela, devido ao pequeno número de pacientes nos diferentes subgrupos.

Em resumo, a frequência de EMAST entre os pacientes com CCRm com tumores MSS é baixo quando comparado com pacientes com tumores MSI. Não houve correlação entre a expressão da proteína EMAST e MSH3. Conseguimos encontrar uma ligação clara entre MSI e EMAST, eo resultado foi significativamente melhor para pacientes com CCRm com tumores MSI /não-EMAST. Mais estudos são necessários para elucidar a base molecular para EMAST e para mostrar se as alterações tetranucleotídeo observados em tumores EMAST pode ter um impacto funcional por si só ou apenas representar alterações espectador em um subconjunto de tumores com defeitos específicos na replicação do DNA e reparação.

Informações de Apoio

Tabela S1. Tetranucleotídeo microssatélites sequências iniciadoras de PCR

doi: 10.1371. /Journal.pone.0124538.s001

(PDF)

Reconhecimentos

Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Dutch Colorectal Grupo câncer (DCCG).