Abstract

A enzima 5α-redutase, que converte a testosterona em dihidrotestosterona (DHT), desempenha funções fundamentais na andrógeno receptor (AR) via de sinalização. Os três isoenzimas da 5α-redutase identificados até à data são codificadas por genes diferentes:

SRD5A1

,

SRD5A2

, e

SRD5A3

. Neste estudo, foram investigados os mecanismos subjacentes a regulação de expressão de androgénio isoenzima 5α-reductase em células da próstata humana. Descobrimos que androgénio regula o nível de ARNm de isoenzimas 5α-redutase de uma forma específica do tipo de célula, que essa regulação ocorre ao nível da transcrição, e que a RA é necessário para esta regulação. Além disso, nossos resultados sugerem que a AR é recrutado para um elemento de resposta andrógeno negativo (Nare) no promotor de

SRD5A3 in vivo

e directamente liga ao Nare

in vitro

. Os diferentes níveis de isoenzimas 5α-redutase de expressão podem conferir resposta ou resistência aos inibidores da 5α-redutase e, portanto, podem ter importância na prevenção do câncer de próstata

Citation:. Li J, Ding Z, Wang Z, Lu JF, Maity SN, Navone NM, et ai. (2011) Regulamento do andrógeno de 5α-redutase Isoenzimas em Câncer de próstata: Implicações para Prostate Cancer Prevention. PLoS ONE 6 (12): e28840. doi: 10.1371 /journal.pone.0028840

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de maio de 2011; Aceito: 16 de novembro de 2011; Publicação: 14 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pelo programa de investigação do cancro da próstata no MD Anderson Cancer Center e apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde, através Cancer Support Center Grant do MD Anderson, CA016672. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O processo de vários anos, de várias etapas da carcinogênese de próstata e seu longo período de latência fazer câncer de próstata ideal para quimioprevenção [1]. O receptor de androgénio (AR) via de sinalização, que é essencial para o desenvolvimento e a função normal da próstata, também é central para a patogênese e progressão do cancro da próstata [2], [3]. A enzima chave na sinalização AR, 5α-redutase, converte a testosterona em di-hidrotestosterona o androgénio mais potente (DHT) [4]. Embora a testosterona pode ligar-se e activar o AR, o DHT liga-se a ele com uma velocidade de dissociação mais lenta do que três vezes o de testosterona [5], [6].

três isoenzimas de 5α-redutase, que são codificadas pelos diferentes genes (

SRD5A1

,

SRD5A2

, e

SRD5A3

), foram identificados. Imunohistoquímica e reação de polimerase em cadeia (PCR) as análises dos tecidos da próstata humanos sugerem que os níveis SRD5A1 e SRD5A2 mudar com o desenvolvimento e progressão do câncer de próstata [7], [8], [9].

In vitro

estudos têm confirmado a atividade 5α-redutase do SRD5A3 mais-recentemente identificado [10], que foi sobre-expresso em tecidos de câncer de próstata hormônio-refratário [10], [11]. Knockdown de

SRD5A3

expressão também reduziu o crescimento ea viabilidade das células cancerosas da próstata [10]. Ao utilizar um anticorpo monoclonal, Godoy et al. mostrou mais aumento do nível de proteína SRD5A3 no cancro da próstata em comparação com tecidos benignos da próstata [12]. Estas descobertas sugerem que SRD5A3 pode contribuir para a progressão do cancro da próstata. Também tem sido relatado recentemente que SRD5A3 pode desempenhar um papel importante na glicosilação de proteínas [13]. Mutações do

SRD5A3

resultar em distúrbios congênitos [13], [14] e síndrome Kahrizi [15].

Dois inibidores da 5α-redutase foram testados clinicamente. Finasterida inibe especificamente a actividade SRD5A2 [16], e dutasterida inibe tanto a de SRD5A1 SRD5A2 e [17]. O Prevention Trial do cancro da próstata (PCPT) produziu resultados encorajadores: finasterida reduziu a incidência global de câncer de próstata em 25%, embora os efeitos potenciais de tumores de alto grau foram a respeito [18]. Da mesma forma, a redução pela Dutasteride de Eventos do cancro da próstata (Reduzir) estudo mostrou que a dutasterida reduziu a incidência de câncer de próstata em 23% entre os homens com alto risco e não revelou aumento estatisticamente significativo de tumores de alto grau em homens tratados com dutasterida [19] , [20].

Três fatores podem conferir resposta ou resistência a 5a-redutase inibidores. Em primeiro lugar, a resposta de resistência ou pode resultar da presença de isoenzimas diferentes [21]. Em segundo lugar, as diferenças de sensibilidade pode ser conferida por

SRD5A2

variantes genotípicas [22]; Makridakis et ai. [23] mostraram

in vitro

que

SRD5A2

variantes têm diferentes afinidades para finasterida. Em terceiro lugar, os diferentes níveis de isoenzimas 5α-redutase expressão pode contribuir para a sensibilidade e resistência. Ao contrário de ablação de androgénios, o que diminui a testosterona prostática e DHT, a inibição da actividade 5α-redutase diminui DHT, mas aumenta a testosterona [24], [25], [26]. Uma vez que os inibidores da 5α-redutase alterar a razão testosterona-a-DHT, e dado o papel crítico de 5α-redutase na sinalização AR, os diferentes níveis de expressão 5α-reductase podem proporcionar pistas sobre a resposta e a resistência a 5a-reductase inibidores na prevenção do cancro da próstata .

os androgénios podem afetar a expressão de

SRD5A1

e

SRD5A2

em diferentes tecidos e tipos de células. Na próstata ventral de ratos, a regulação positiva de

SRD5A2

por andrógeno tem sido relatada [27], e no testículo de ratos, a regulação negativa do

SRD5A1

[28]. Andrógeno ablação levou à diminuição da imunocoloração de 5α-redutase [29].

SRD5A1

e

SRD5A2

também são regulados por células B linfóides testosterona e DHT em T e [30] e no fígado de rato e do cérebro [31], [32], [33], [ ,,,0],34]. No entanto, como a expressão 5α-redutase é regulada em células de próstata humana não tem sido extensivamente investigado.

O nosso objetivo principal deste estudo foi, portanto, para avaliar regulação andrógena das isoenzimas 5α-reductase em células da próstata humanos. Nós investigado se os efeitos de regulamentação dos androgênios sobre as 5a-reductases são mediadas por AR e se existe uma interacção directa entre o

cis

elementos -regulatory de isoenzimas 5α-redutase e AR.

os nossos dados demonstraram regulação androgénio específico do tipo de célula de isoenzimas que é mediada por AR. Para nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de que a AR pode ligar diretamente para o elemento negativo andrógeno resposta (Nare) do

SRD5A3

promotor em células de cancro da próstata LNCaP. Nossas descobertas podem ter implicações clínicas para a identificação de homens cuja doença pode se beneficiar de inibidores da 5α-redutase.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e culturas

PWR-1E, LNCaP, e células VCaP foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA); BPH-1-GFP, BPH-1-AR, e as células C4-2B4 foram uma oferta do Dr. Sue-Hwa Lin (The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); e LAPC-4 células foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Robert Reiter (Universidade da Califórnia, Los Angeles, CA).

células PWR-1E foram mantidas em meio de queratinócito isento de soro (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) suplementado com 50 ug /mL de extracto de pituitária de bovino, 5% de L-glutamina, e 5 ng /mL de factor de crescimento epidérmico. LNCaP, C4-2B4, HBP-1-GFP, e as células BPH-1-AR foram mantidas em meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina (P /S). células LAPC-4 foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Iscove (Invitrogen) suplementado com 5% de FBS e 1% de P /S. VCaP células foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 10% FBS e 1% de P /S. Todas as culturas foram mantidas a 37 ° C em ar humidificado com 5% de CO

2. As linhas celulares foram validados na Linha do MD Anderson Caracterizado celular Núcleo de DNA fingerprinting STR utilizando o kit AmpFℓSTR Identifiler (Applied Biosystems, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Os perfis STR foram comparados com os conhecidos impressões digitais ATCC, para a Linha celular autenticação integrada Molecular base de dados versão 0.1.200808 (https://bioinformatics.istge.it/clima/) [35], e à base de dados de impressões digitais do MD Anderson. Os perfis STR de PWR-1E, LNCaP, C4-2B4, e células VCaP combinado impressões digitais de DNA conhecidos; os de células BPH-1-AR e LAPC-4 foram únicas.

quantitativa de transcrição reversa-PCR (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído de cada linha celular, utilizando uma RNeasy Além disso Mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. qRT-PCR foi realizado usando um TaqMan One-Step RT-PCR kit (Applied Biosystems, Life Technologies Corp.), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, a configuração de qRT-PCR para cada reacção era de 48 ° C durante 30 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, e 42 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Humana β-actina foi utilizado como controlo em cada reacção endógena. Primer e sondas para

SRD5A1

,

SRD5A2

, e

SRD5A3

genes também foram da Applied Biosystems.

tratamento de andrógeno

A testosterona e DHT foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). R1881, um andrógeno sintético, foi gentilmente cedido pelo Dr. Sue-Hwa Lin. As células foram semeadas em placas de 12 poços com o seu meio de crescimento regular. Após privação de soro durante a noite, as células foram expostas ao etanol (controlo) ou de 1 nM, 10 nM, ou 100 nM de androgénio. Depois de 24 horas e 48 horas de incubação, as células foram colhidas e o RNA extraído para análise qRT-PCR.

actinomicina D tratamento

células BPH-1-AR, LNCaP e PWR-1E foram tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO; controlo) ou de 1 ug /ml ou 5 ug /mL de actinomicina D durante 30 minutos, seguido de etanol (controlo) ou 10 nM de DHT. Após 24 horas de incubação, as células foram colhidas e o RNA total extraído.

A transfecção com pequena interferência RNA (siRNA)

Para derrubar expressão AR, nós semeadas células LNCaP em placas de 12 poços, privadas de soro durante a noite deles, e, em seguida, transfectadas los com 20 nM de AR ou ARNsi de controlo usando uma DharmaFECT (Dhamarcon, Inc., Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Após incubação durante a noite, as células foram expostas ao etanol (controlo) ou 2 nM de DHT. Os ARNsi de AR e ARNsi de controlo foram obtidos a partir de Dhamarcon.

análise Western blot

Após 24 horas de incubação com siRNA, as células foram recolhidas e centrifugadas a 5000 rpm durante 5 minutos. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão de RIPA (Boston Bioproducts, Inc., Ashland, MA) com o inibidor da protease (Roche, Mannheim, Alemanha), incubadas durante 20 minutos com agitação ocasional vórtice, e depois centrifugada a 14000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi decantado e guardado para transferência de Western. O procedimento de extracção de proteína-total foi realizado a 4 ° C, e a concentração de proteína foi medida usando o ensaio BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). O sobrenadante foi fervida durante 5 minutos, carregada sobre gel de poliacrilamida, executar, e transferido para uma membrana de PVDF, que foi, em seguida, bloqueadas em TBST (TBS com 0,2% de Tween 20) + leite a 5% durante 1 hora antes de serem sondados com anti-AR anticorpo (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação à temperatura ambiente durante 1 hora com anticorpo anti-ratinho secundário conjugado com peroxidase de rábano. A detecção foi feita por meio de um kit de electroquimioluminescência (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ).

luciferase ensaio

O

promotor SRD5A3

(-1027 /+ 155 pb) foi clonado no vector básico pGL2 (Promega Corp., Madison, WI) nos locais XhoI e MluI, como eram mais construções de deleção. As células LNCaP foram transfectadas com estas construções, utilizando Fugene 6 reagente (Roche) ou Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Para testar a capacidade de repressão dependentes de AR da SRD5A3, também inserido o seu promotor (-191 /-72 pb) para a construção de pGL3-4ARE-E4-luc nos locais PstI e XhoI. As células LNCaP foram transfectadas com ela e, em seguida, cultivados na ausência e na presença de DHT durante 24 horas

.

Um ensaio de luciferase dupla foi realizada segundo o protocolo da Promega. A relação de luciferase foi obtido dividindo-se a actividade da luciferase pela

Renilla

atividade.

Mutagênese

As mutações foram feitas na região do Nare do

SRD5A3

promotor usando um kit QuickChange II XL mutagénese dirigida ao local (Stratagene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência CTGTTTTGCGTCT foi mutado para ATTTTTTTATTAT no contexto da construção pGL3-4ARE-E4-luc.

eletroforética ensaio de mobilidade-shift (EMSA)

ligação a oligos de cadeia dupla foi avaliada de AR em extractos nucleares de células LNCaP de realização EMSA com um kit LightShift (todos os kits para EMSA foram de Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. extractos de proteína nuclear foram isolados a partir de células LNCaP, e as concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio de proteína BCA. Os oligos foram concebidos para cobrir a região -191 /-91 no SRD5A3

promotor e marcado, utilizando um kit de biotina extremidade 3 ‘do ADN de rotulagem de acordo com as instruções do fabricante. AR ligação para oligos de cadeia dupla foi determinada em extractos nucleares de células LNCaP pela EMSA usando um kit LightShift de acordo com as instruções do fabricante. Os oligos foram utilizados não marcados em EMSA como um dos controlos. foi detectada biotina-ADN marcado na membrana de nylon usando um kit de módulo de detecção de ácido nucleico quimioluminescente.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio

células LNCaP foram cultivadas tanto na presença como na ausência de 100 nM de DHT, e chip foi realizada usando um kit da Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA), de acordo com o seu protocolo. Resumidamente, as células foram tratadas com 37% de formaldeído a proteínas de ligação cruzada com o ADN. cromatina reticulado foi digerido por nuclease microcócica a um comprimento de 150-900 pb, e as membranas nucleares foram quebradas por ultra-sons. anticorpos específicos de AR (Dako) foram usadas para precipitar os fragmentos de cromatina curtas, que foram em seguida lavadas e eluídas. As ligações cruzadas proteína-ADN foram invertidos e DNA ainda purificado por meio de colunas de spin em cada reacção de PCR. O iniciador directo para a nare foi CTGTTTTGCGTCTTTGCTTCTG, e o iniciador inverso foi GAGGTCCTTGGTCCTGGTC, que amplificam um produto de 120 pb.

modelos de xenoenxerto

ARN a partir do MDA CaP 183, MDA CaP 144, MDA CaP 146 e MDA CaP modelos 155 xenoenxerto foi gentilmente cedido pelo Dr. Sankar N. Maity e Dr. Nora M. Navone. O MDA CaP 183 xenoenxerto foi derivada de carcinoma da próstata dependente de androgénios, enquanto que as outras foram derivadas de carcinomas da próstata castração-resistente com carcinoma da próstata de células pequenas (SCPC) morfologia AR-negativo.

A quantificação do ARNm relativa nível de xenotransplante

SRD5A3 Comprar e antígeno prostático específico (

PSA

) foi feito por meio de qRT-PCR com SYBR Green (Applied Biosystems, Inc.). qRT-PCR foi realizada como descrito em [36]. As sequências dos iniciadores utilizados foram os seguintes: SRD5A3: para a frente, 5′-TCCAAGCTGGCTTCATGGTT-3 ‘, localizada no exão 2 e reverso, 5′-CACTCGAAGAGTCTTCGTAA-3′ localizado no exon 3; PSA: para a frente, 5’-GAGAGCTGTGTCACCATGTG-3 ‘, localizada no exão 1 e reverter, 5′-CACAATCCGAGACAGGATGA-3’, localizada no exão 2.

A análise estatística

Os dados são apresentados como médias ± SD. Frente e verso

t

testes foram realizados para comparar médias entre amostras e controlos tratados com andrógenos. Significância foi fixado em um valor de p de 0,05.

Resultados

Todos os três isoenzimas 5α-redutase estão presentes nas linhas de células de próstata humanos testados, com diferentes padrões de expressão

Para identificar bons sistemas modelo para estudar as funções de isoenzimas 5α-redutase, foram avaliados os níveis de mRNA das isoenzimas 5α-redutase em diferentes linhas de células da próstata, incluindo PWR-1E células epiteliais prostáticas normais imortalizadas; hiperplasia prostática benigna (BPH) as células BPH-1-AR, que expressam de forma estável Ar; células de câncer de próstata andrógeno-sensíveis LAPC-4 e LNCaP; e células andrógeno-independente C4-2B4. PWR1-E, as células BPH-1-AR e LAPC-4 de tipo selvagem expressar AR, ao passo que as células LNCaP e C4-2B4 expressar um AR mutante, T877A. (As características destas linhas de células, incluindo a sua fonte, a sensibilidade de androgénio, e o estado AR-expressão, estão resumidos na Tabela S1.) Como a Figura 1 ilustra, o ARNm de todos os três isoenzimas 5α-redutase foi detectada na análise de qRT-PCR de cada linha celular, indicando que todas as três são expressas nestas linhas celulares. No entanto, o nível de mRNA de cada isoenzima diferiu entre linhas celulares, e cada isoenzima tinha um padrão de expressão distinta.

Gráficos mostram os níveis de mRNA relativas do

SRD5A1

,

SRD5A2

e

SRD5A3

isoenzimas em PWR-1E, BPH-1-AR, LAPC-4, LNCaP, e células C4-2B4 conforme determinado na análise de qRT-PCR.

níveis de ARNm 5α-redutase são regulados por androgénios, em uma célula de tipo específico forma

Para testar se o nível de ARNm de 5α-redutase é regulada por androgénios, que trataram células LNCaP quer com etanol (ou seja, apenas veículo) ou com a testosterona ou DHT em diferentes concentrações (1, 10, e 100 nM). A concentração de plasma normal de testosterona nos homens varia 350-1050 ng /dl (12,1-36,4 nM) [37], e os níveis de castração de testosterona é inferior a 50 ng /dL (1,73 nM) [38]. A concentração plasmática de DHT é de cerca de 1/10 da concentração de testosterona [39], [40]. Assim, células tratadas com concentrações de andrógenos que são perto da castração, fisiológicos, e os níveis de superphysiologic. Nossa análise qRT-PCR mostrou que o tratamento DHT resultou em um aumento do nível de

SRD5A1

mRNA, enquanto que levou à diminuição dos níveis de

SRD5A2

e

SRD5A3

mRNA na próstata LNCaP células de cancro (Fig. 2A).

A, as células LNCaP foram tratados com etanol (apenas veículo) ou de diferentes concentrações de DHT (1 nM, 10 nM, 100 nM), durante 24 e 48 horas. PWR-1E (B), HBP-1-AR (C), células C4-2B4 (E) LAPC-4 (D), e foram tratados da mesma maneira, mas apenas durante 24 horas. Os níveis de mRNA de

SRD5A1

,

SRD5A2

, e

SRD5A3

para todas as linhas celulares foram quantificados por qRT-PCR. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; 2-sided

t

teste.

Também testamos o efeito de DHT em outras linhas celulares. DHT não afectou de forma notável o nível de ARNm de 5α-reductase em células PWR-1E (Fig. 2B), enquanto que em células BPH-1-AR, DHT aumentou os níveis de ARNm de todos os três isoenzimas (Fig. 2C). Em células de LAPC-4, que expressam AR de tipo selvagem, de DHT sobre-regulada SRD5A1 expressão sem afectar a expressão e SRD5A2 SRD5A3 (Fig. 2D). E nas células cancerosas C4-2B4 próstata andrógeno-independente, DHT regulamentado expressão 5α-redutase semelhante à sua regulação em células LNCaP, mas em menor grau (Fig. 2E).

Nós achei interessante que DHT regula o nível de mRNA de

SRD5A3

de uma maneira específica do tipo de célula, uma descoberta que nós não vimos antes registrado. Para avaliar se isso acontece apenas em LNCaP ou linhas de células derivadas de LNCaP, que similarmente tratada VCaP células, que são derivadas de uma metástase óssea de xenoenxerto de cancro da próstata humano. DHT também regulada para baixo o nível de mRNA de

SRD5A3

em células capnografia, (Figura S1), indicando que a regulação andrógeno-negativo de

SRD5A3

não é específico para LNCaP ou linhas celulares derivadas de LNCaP.

testosterona e R1881 tiveram efeitos semelhantes aos da DHT sobre a expressão de 5α-redutase em todas as linhas celulares testadas (Figuras S2 e S3). Os nossos dados demonstram, assim, que os androgénios regular o nível de ARNm de isoenzimas 5α-redutase de uma forma específica do tipo de célula.

regulação do nível de ARNm 5α-redutase ocorre através de transcrição

Os androgénios poderia regular 5α- redutase expressão através do controlo da transcrição 5α-redutase ou afectando a estabilidade do ARNm. Para compreender o mecanismo subjacente à regulação da 5α-redutase por androgénios, que trataram células BPH-1-AR com actinomicina D, um inibidor de transcrição. Como se mostra pelos resultados da análise de qRT-PCR na Figura 3, DHT induziu um aumento da expressão de todas as três isoenzimas 5α-redutase em relação ao que no controle etanol (veículo) em células BPH-1-AR. No entanto, o nível de ARNm de 5α-redutase não se alterou com o tratamento com DHT quando as células foram também tratadas com actinomicina D a 1 ug /mL e concentrações /ml 5 ug (fig. 3A). Estes resultados indicam que a sobre-regulação da expressão 5α-redutase por androgénios é sensível ao tratamento actinomicina D, sugerindo que os andrógenos regular a transcrição de 5α-redutase.

BPH-1-AR (A) e LNCaP ( B), e PWR-1E (C) As células foram tratadas durante 30 minutos com DMSO (controlo só com veículo) ou actinomicina D a 1 ug /mL e concentrações de 5 ug /ml. O tratamento com etanol (apenas veículo) ou 10 nM de DHT testosterona ou seguido. Foram quantificados os níveis de mRNA de

SRD5A1

,

SRD5A2

, e

SRD5A3

por qRT-PCR.

Da mesma forma, quando as células LNCaP foram tratadas com actinomicina D, a testosterona não aumentou significativamente

SRD5A1

ou diminuição

SRD5A2

e

SRD5A3

níveis de mRNA (Fig. 3B). Como um controlo negativo, que também tratada células PWR-1E com actinomicina D, seguido por tratamento DHT (Fig. 3C). No caso do controle só de DMSO, DHT não afetou o nível de mRNA de

SRD5A1

,

SRD5A2

, ou

SRD5A3

. Com o tratamento actinomicina D, DHT não alterou significativamente o nível de mRNA destes genes, também.

Regulamento do nível de mRNA 5α-redutase por andrógenos é AR

dependente

Usando Western blot, verificamos a expressão de AR em cada uma das linhas celulares estudadas em comparação com a das células BPH-1-GFP AR-negativa (Fig. 4A).

a, o nível de proteína AR de cada linha de células de próstata foi analisados ​​por transferência de Western. células BPH-1-GFP foram utilizadas como um controlo negativo para a expressão do AR. B, O nível de proteína AR foi analisado por transferência de Western para as células LNCaP (esquerda) com três tratamentos de controlo e duas de ARNsi de AR. O nível de mRNA AR foi analisado por qRT-PCR para células PWR-1E (direita), também com três controle e dois tratamentos AR siRNA. C, LNCaP e PWR-1E células foram tratadas com ARNsi de controlo e ARNsi de AR e, em seguida, tratou-se com 2 nM de DHT. Medimos os níveis de mRNA de

SRD5A1

,

SRD5A2

, e

SRD5A3

utilizando qRT-PCR e normalizou os valores a p-actina. As alterações nos níveis de ARNm com o tratamento de DHT são apresentadas em relação com os níveis em células tratadas apenas com veículo.

AR Para determinar se é necessário para mediar a regulação da expressão 5α-redutase por androgénios, foi realizada Ocidental blotting e análise de qRT-PCR após o tratamento de células LNCaP e PWR-1e com ARNsi de AR e, em seguida, com 2 nM de DHT. Western blotting e qRT-PCR validado o knockdown eficaz da expressão de AR pela AR siRNAs (Fig. 4B). qRT-PCR mostrou que os siRNAs de controlo não alterou significativamente o efeito sobre os níveis de DHT 5α-reductase em células LNCaP (Fig. 4C, em cima). tratamento DHT sozinho resultou em aumento da

SRD5A1

mRNA mas diminuiu

SRD5A2

e

SRD5A3

mRNA (Fig. 4C, em cima). Em contraste, os níveis de 5α-reductase em células de LNCaP tratadas com ARNsi de AR não se alterou em resposta a um tratamento com a DHT (Fig. 4C, em cima). Quando tratada LAPC-4 células de uma forma semelhante,

SRD5A1

ARNm aumentou de forma semelhante com DHT testosterona ou tratamento por si só, mas não quando as células foram também tratadas com ARNsi de AR (Figura S4). Quando se trataram células PWR-1E, com a mesma forma, DHT não afectou o nível de ARNm de 5α-reductase em células PWR-1E, não importa se eles foram tratados com ARNsi de controlo ou Ar siRNAs (Fig. 4C, parte inferior).

no seu conjunto, estes resultados indicam que a regulação da 5α-redutase por andrógenos é AR dependente.

SRD5A3

promotor contém um Nare

Nós mostramos que androgénio regula a transcrição de 5α-redutase e que a RA é necessário para mediar esta regulação da transcrição. AR se liga directamente a Ares e regula a transcrição de genes alvo-AR. Assim, foi investigado se o AR pode regular directamente a transcrição de 5α-redutase. Nós clonado uma região promotora de

SRD5A3

(-1.027-155 bp) para o vector pGL2-básico. Em células LNCaP, esta construção dirige a expressão de luciferase e, quando são tratados com 100 nM de DHT, uma redução de 75% dos resultados da actividade da luciferase (Fig. 5a). Isto é semelhante à resposta da endógena

SRD5A3

ao tratamento de andrógeno em células LNCaP. Assim, um ARE pode residem nesta região promotor 1-kb de

SRD5A3

.

A, análise de Supressão de

SRD5A3

promotor para refinar a localização do nARE- contendo a região. As células LNCaP foram transfectadas com construções de luciferase contendo uma série de deleção de

SRD5A3

promotor e, em seguida, tratada com etanol (apenas veículo; DHT) ou 100 nM de DHT (+ DHT) durante 24 horas. As células foram então colhidas, e os seus lisados ​​foram utilizados para o ensaio de luciferase. B,

SRD5A3

tem um Nare. As células LNCaP foram transfectadas com pGL3-4ARE-E4 constrói com e sem inserção da sequência

SRD5A3

promotor (-191 /-72 pb) em ambas as orientações ou com inserção de um

promotor SRD5A1

fragmento (-1601 /-1501 pb). As células foram tratadas com etanol (apenas veículo) ou 100 nM de DHT durante 24 horas e, em seguida, colhidas para o ensaio de luciferase. C, Mutações no Nare aboliu seu efeito supressor. As células LNCaP foram transfectadas com pGL3-4ARE-E4 constrói com e sem inserção de

SRD5A3

promotor (-191 /-72 pb) ou com a inserção do

SRD5A3

promotor mutado (-191 /-72 pb) e, em seguida, submetido a tratamento DHT eo ensaio de luciferase

para identificar os putativo SÃO, fizemos uma série de construções de deleção no

região promotora SRD5A3

.; as construções retida a capacidade de resposta ao tratamento de androgénio até os -191 /-91 pb foram suprimidos, o que sugere que o ARE putativa está localizado nesta região (Fig. 5A).

Para melhor avaliar se esta região contém de facto uma nare , que inserida na região de -191 /-72 pb entre o promotor-núcleo do 4ARE e E4 no construto pGL3-4ARE-E4-Luc [41], as células LNCaP transfectadas com ele, e depois tratou-se as células com DHT. A construção pGL3-4ARE-E4-luc contém quatro repetições em tandem do são do

PSA

gene e um núcleo promotor E4 [41]. Como mostrado na Figura 5B, o tratamento com DHT induziu cerca de um aumento de 24 vezes na actividade de luciferase do construto pGL3-4ARE-E4-luc. Quando a região -191 /-72 pb do

SRD5A3

promotor foi inserido entre 4ARE e E4, a actividade da luciferase foi aumentado apenas de 3 a 6 vezes por tratamento DHT, sugerindo que esta região contém uma nare. Quando uma região de 101 pb derivado do

SRD5A1

promotor (-1601 /-1501 pb) foi semelhante inserido entre 4ARE e E4, como um controlo, o tratamento de DHT ainda induziu um aumento de 26 vezes na actividade de luciferase. Além disso, mutações na região -191 /-72 pb de

SRD5A3

aboliu a sua capacidade repressor (Fig. 5C). Em conjunto, estes dados sugerem que o

SRD5A3

tem um Nare funcional em seu promotor.

AR é recrutado para a região Nare contendo de

SRD5A3

para investigar se a AR é recrutado para o promotor de

SRD5A3 in vivo

, realizamos chip, utilizando fragmentos de ADN genómico a partir de células LNCaP (150-900 pb; a Fig. 6A) com primers visando especificamente a região do Nare de

SRD5A3

. Como mostrado na PCR, AR foi enriquecido na região do nare quando as células cresceram na presença de DHT (Fig. 6B). Normal imunoglobulina de ratinho L (como um controlo negativo) foi também utilizado para imunoprecipitação com o ADN genómico de LNCaP; a imunoglobulina G não puxar para baixo todas as sequências de DNA associadas à AR do

SRD5A3

promotor (Fig. 6B). Estes resultados sugerem que a RA é recrutada para a região de nare no promotor de

SRD5A3

.

A, electroforese em gel de agarose da cromatina digerido de células LNCaP crescidas na ausência e na presença de 100 nM DHT. Os fragmentos de ADN variam geralmente entre 150 e 900 pb. B, digerido cromatina das células LNCaP crescidas na ausência e na presença de 100 nM de DHT foi utilizado na experiência de imunoprecipitação com anticorpo anti-AR ou de imunoglobulina de murganho normal G. Depois disso, a reticulação do ADN-proteína foi invertida, e o DNA purificado foi utilizado em as reações de PCR com primers flanqueando a região do Nare. C, Três sondas oligo foram concebidos para cobrir a região bp a -191 /-91 no promotor de

SRD5A3

. D, AR liga ao Nare de

SRD5A3

. As três sondas oligo (marcadas com biotina) foram incubadas com extrato nuclear de células LNCaP, com extrato nuclear de células LNCaP além de sondas oligo não marcados ou com extracto nuclear de células LNCaP além de anticorpo específico para AR.

Para determinar se AR pode interagir diretamente com o Nare de

SRD5A3

, realizamos EMSA com três sondas oligo, cada um dos 40 pb, para cobrir a região -191 /-91 pb do

SRD5A3

promotor (Fig. 6C). Apenas sonda 1 mostrou uma mudança de mobilidade (Fig. 6D). Para confirmar que este desvio de mobilidade é específico para o AR, que adicionados anticorpos anti-AR para as reacções; sonda 1 mostraram mais uma mudança de mobilidade (Fig. 6D). Embora não marcado do tipo selvagem sonda 1 foi capaz de competir com a sonda marcada 1 para a ligação AR em EMSA, perdeu essa capacidade quando fizemos mutações na sequência sonda 1 (Figura S5).

Estes resultados demonstraram que sonda 1 contém a Nare e que AR liga-se diretamente a esta região

in vitro

.

para

SRD5A1 Comprar e

análise promotor SRD5A2

, também conduzido e Chip, mas não detectar uma região é ou AR a ligação directa às suas regiões promotoras proximais. O mecanismo regulational para a sua expressão ainda está sob investigação.

SRD5A3

mRNA aumentos no modelo de xenotransplante SCPC AR-negativo

Ao observar a regulamentação andrógeno-negativo de

SRD5A3

nas linhas de células testadas, estávamos interessados ​​em investigar se este regulamento dependentes de AR também ocorre

in vivo

. Por isso, nós examinamos o nível de ARNm de

SRD5A3

em diferentes modelos de xenoenxerto, incluindo CaP MDA 183, um xenoenxerto de cancro da próstata dependentes de androgénios que expressam AR, e três xenoenxertos de AR-negativas SCPC independente de androgénios, MDA 144 CaP , MDA CaP 146, MDA e CaP 155. em qRT-PCR, observou-se um nível mais elevado de ARNm notavelmente

PSA

na MDA CaP 183 xenoenxerto do que nos outros (Fig. 7, no topo), que é consistente com o estado AR destas linhas celulares.