Abstract

Fundo

Int-6

(local de integração 6) foi identificado como um oncogene em uma tela do vírus do tumor mamário de ratinho tumorigênico inserções (MMTV).

INT6

expressão é alterada em cancros humanos, mas o papel preciso da interrompido

INT6

na tumorigênese ainda não está claro, e um modelo animal para estudar

Int-6

função fisiológica tem faltado.

principais conclusões

Aqui, criamos um

in vivo

modelo da função INT6 no peixe-zebra, e através de abordagens genéticas e químicas genético-implicam INT6 como um tecido modulador espec�ico de sinalização MEK-ERK. Nós achamos que INT6 é necessária para a expressão normal da proteína MEK1 em células humanas, e por Erk sinalização em embriões de peixe-zebra. Perda de um INT6 ou de sinalização Mek causa defeitos no desenvolvimento craniofacial e INT6 e Erk de sinalização têm sobreposição de domínios de expressão tecidual.

Significância

Nossos resultados fornecem uma nova visão sobre o papel fisiológico do animal vertebrado INT6, e ter implicações para o tratamento de tumores humanos exibindo alterado

INT6

expressão

Citation:. Grzmil M, Whiting D, Maule J, Anastasaki C, Amatruda JF, Kelsh RN, et al . (2007) O

INT6

Gene Câncer e MEK vias de sinalização Converge durante o desenvolvimento do peixe-zebra. PLoS ONE 2 (9): E959. doi: 10.1371 /journal.pone.0000959

Editor do Acadêmico: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de agosto de 2007; Aceito: 02 de setembro de 2007; Publicação: 26 de setembro de 2007

Direitos de autor: © 2007 Grzmil et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de MRC a EEP, e por doações de CRUK eo AICR para CJN. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto ou na realização do estudo, na coleta, análise ou interpretação dos dados, ou na preparação, revisão ou aprovação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o desenvolvimento embrionário e o desenvolvimento do tumor, geralmente, têm mecanismos de uma moleculares subjacentes conceito ilustrado pela identificação de genes interrompidos pelo vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV) em cancros mamários [1]. Um exemplo importante, o

Int-1 gene

que é um local de integração comum para MMTV nos tumores mamários, codifica o homólogo do

Drosophila sem asas

gene [2], [3] e foi posteriormente chamado

Wnt1

(sem asas /Int), em reconhecimento desta função conservada. sinalização Wnt é agora conhecido por ser interrompido em muitos tipos de tumores humanos, especialmente câncer de cólon [4]. Outros

Int

genes, tais como

Int-2 Comprar e

4

(Fgf3, 4), e

Int-3

(Notch4), codificar mitogénios e reguladores de desenvolvimento, que também são misactivated em muitos cancros [1], [5].

na maioria dos casos, MMTV activa

Int

a expressão do gene como um resultado da integração proviral a montante da região promotora. Notavelmente, todos os três inserções de VTMR encontrada em

Int-6

, que codifica um componente do factor de translação eucariótica iniciação 3 (eIF3), foram encontrados estar dentro de intrões, e na orientação de transcrição oposta à do

Int-6

gene, criando uma truncado

Int-6

ARNm [1], [6]. A expressão ectópica de equivalentemente truncada

Int-6

podem transformar culturas de células [7], [8], e promover a hiperplasia alveolar mamário persistente e tumorigênese em camundongos transgênicos [9].

Apesar das evidências importantes a favor de um papel para INT6 na tumorigénese humana [10] – [12], a base molecular para INT6 no desenvolvimento do cancro continua por resolver. Altamente conservado nos eucariotas, INT6 contém um domínio PCI, encontrado em proteínas da tampa reguladora 19S do proteassoma, o signalosome COP9 (CSN), e o complexo de iniciação da tradução eIF3; todos os três complexos de partilhar semelhança estrutural global, e INT6 foi encontrado associado com cada [13]. Quando sobre-expressos em leveduras, INT6 induz resistência a múltiplas drogas por activação de um factor de transcrição AP-1 [14], [15], e em células humanas, a faixa da função INT6 inclui progressão ordenada através de mitose [16], a regulação do proteassoma estabilidade dependente de MCM7 [17] e HIF2α [18], e um disparate mediada mRNA decadência [19].

Com nenhum modelo animal para INT6 perda de função disponíveis, que argumentou que a compreensão da

INT6

durante o desenvolvimento proporcionaria novel insights sobre a função INT6 em células de vertebrados normais, proporcionando assim uma nova perspectiva sobre a função INT6 na formação do câncer. Aqui, utilizando células de peixe-zebra e mamíferos, nós descrevemos o primeiro fenótipo INT6 perda de função em um animal, e vinculá INT6 com uma via de sinalização, que, como os efectuados pelos outros

Int

genes, é fundamental para ambos desenvolvimento e câncer.

Resultados

INT6 é essencial para a embriogênese peixe-zebra

Nós escolhemos estudar o papel fisiológico do peixe-zebra INT6 durante o desenvolvimento, usando oligonucleotídeos morfolino (MOs) para reduzir proteína INT6, bem como um

INT6

hi2470

linha mutante de inserção (gentilmente cedido por N. Hopkins, A. Amesterdão e S. Farrington. MIT). Zebrafish INT6 é mais de 90% idêntica na sua sequência de aminoácidos para INT6 humano (

Ensembl

ENSDARG00000002549) e utilizando um anticorpo criado contra o INT6 N-terminal da INT6 humano [20], determinou-se que o

INT6

MO resultou na perda de INT6 (Figura 1A). Como INT6 tem sido implicada no controlo do ciclo celular /M-fase G2, foi realizada primeiro conjunto de montagem em imuno-histoquímica com o final de G2 /marcador fase M, fosfo-histona H3, e encontraram números apenas ligeiramente reduzida de células no final de fase G2 /M no

INT6

morphant em relação ao controle (Figura S1). Importante, descobrimos que os embriões injectados com

INT6

MO tinha defeitos de desenvolvimento específicos (Figura 1B-N), mais notavelmente reduzida melanisation 2 dias pós-fertilização (DPF:

int-6

MO n = 51/53; con MO n = 0/35;

int-6 5MM

n = 3/31); células de pigmento deslocada no dpf cauda 3 (

int-6

MO n = 46/49; con MO n = 3/30); e morfogênese mandíbula anormal, com elementos de cartilagem reduzidos ou malformações em 4 e 5 dpf (

int-6

MO n = 81/85 4 dpf, n = 76/83 5 dpf; con MO 1/67 4 dpf , N = 1/61 5 dpf). Os defeitos craniofaciais celulares e pigmentos observadas no

int-6

morphant e

hi2470

mutante sugerem que

int-6

pode contribuir para o desenvolvimento das células da crista neural (NCC ) derivados. Usamos múltiplos marcadores de NCCs e seus derivados para avaliar quando surgem esses fenótipos, e encontrou INT6 não pareceu ser necessário para a especificação ou organização de premigratory e migrando precursores cartilagem (Figura S2). Em contraste, alcian coloração azul cartilagem revelou uma perda específica dos cinco elementos de cartilagem ceratobranquial no

INT6

morphants, ao passo que, palatoquadrate e cartilagem hióide de Meckel estavam todos presentes, embora disforme (5,5 dpf

INT6

MO n = 45/53; con MO n = 1/34; Figura 1I-L, figura S3). Expressão de

INT6

mRNA restaurado elementos craniofaciais normais para o

INT6

morphant (

dados não mostrados

); e

INT6

hi2470

mutante tinha um fenótipo craniofacial quase idênticos (Figura 1 M, N), indicando um requisito genuíno para INT6 no desenvolvimento craniofacial.

(A) Análise de Western blot de INT6 (*) em embriões de peixe-zebra injetados com um controle (con) MO ou

INT6

MO. (B)

INT6

morphant melanócitos são menos pigmentadas. (C-F) INT6 é necessária para a colocação de células de pigmento na cauda, ​​como

INT6

morphants e

INT6

hi2470

mutantes ter extraviado células de pigmento na barbatana caudal (D, seta ). luz ambiente ilumina ‘star-luz “padrão os iridophore visto no

INT6

hi2470

embriões (F, seta). (G-H) por 5 dpf, embriões injectados com um con MO tem arcos certobranical claramente visíveis, enquanto que

INT6

morphants não têm arcos certobranical visíveis, além de outras anomalias, incluindo as unconsumed saco vitelino, do coração e o desenvolvimento do olho. (DENTRO). coloração azul Alcian de 5 embriões dpf mostra perda de arcos ceratobrancial 1 a 5. M, Meckel de; PQ, palatoquadrate; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial.

Perda de INT6 altera proteína MEK e Erk sinalização

A evidência bioquímica na levedura sugere que INT6 é parte de um complexo de iniciação da tradução especializada eIF3 que pode ter como alvo mRNAs específicos para a tradução [21]. Dado o envolvimento da proliferação celular INT6 em [16], transferências de Western utilizando um painel de anticorpos contra as proteínas envolvidas no ciclo celular e as vias de sinalização associadas foram realizadas usando os lisados ​​de controlo e ARNsi INT6 transfectadas células MDA-MB-231. De 16 proteínas investigados desta forma, apenas os níveis de MEK1 foram alteradas por INT6 siARN transfecção (Figura 2). Como relatado anteriormente [20], encontramos

INT6

-siRNA lisados ​​celulares tinham níveis reduzidos de proteína INT6 comparado com o não transfectada e reverter

INT6

-siRNA sequência. Encontramos também uma redução drástica dos níveis de proteína MEK1 que se correlacionaram com perda de INT6, enquanto BAX, os níveis de tubulina e proteína actina pareceu não ser alterada no

INT6

-siRNA células transfectadas (Figura 2A). A perda de MEK1 foi especificamente ao nível da proteína, como semi-quantitativa-PCR mostrou níveis normais de

MEK1

ARNm em

INT6

-siRNA células tratadas, bem como os reduzidos níveis esperados de a mensagem INT6 em

INT6

-siRNA células transfectadas (Figura 2B). A possibilidade de que

INT6

podem afetar MAPK sinalização através do controle dos níveis de proteína MEK nos levou a examinar o estado de fosforilação de ERK1 /2, alvos a jusante das quinases Mek, no

INT6

morphant embriões de peixe-zebra . Comparado com embriões de controlo MO,

INT6

morphant lisados ​​de embriões tinham níveis reduzidos de fosfo-Erk (Figura 2C). Estes dados sugerem nova função para INT6 no controle da MAPK sinalização no embrião em desenvolvimento, possivelmente pelo controle direto dos níveis de proteína MEK1.

A. Osteossarcoma células U2-OS não transfectadas (U), ou transfectadas com siRNA dirigido contra o

INT6

mRNA (si) ou a sequência inversa (R), mostram níveis reduzidos de proteína INT6 e MEK1 especificamente após a transfecção com o

INT6-

siRNA, mas nenhuma redução nos níveis de BAX, tubulina ou proteína actina. (B) mostra semi-quantitativa-PCR

MEK1

mRNA não é afectado na sequência inversa e

INT6

-siRNA células tratadas, juntamente com os níveis reduzidos esperados do

INT6

mensagem no

INT6

-siRNA células transfectadas. C, controlo de PCR sem ADN. níveis (C) Phospho-Erk são reduzidos em

INT6

morphants, enquanto a mancha ponceau detecta o carregamento igual de proteínas no gel.

INT6 e Mek caminhos convergem durante o desenvolvimento

Se INT6 controla a atividade Mek no embrião em desenvolvimento, que teorizou que os tecidos em desenvolvimento específicos poderia ter sobreposição de domínios de proteína INT6 ea atividade fosfo-Erk expressão. Com efeito, imuno-histoquímica com anticorpos dirigidos contra INT6 e fosfo-Erk revelou sobreposição de domínios de expressão no desenvolvimento de região craniofacial em 3 e 4 dpf embriões (Figura 3A-F). Forte expressão específica de tecido INT6 também foi detectado no intestino em desenvolvimento e da lente, regiões que tinham pouca ou nenhuma expressão de fosfo-Erk (Figura S4). Dada a expressão de fosfo-Erk e INT6 observada na região craniofacial, a hipótese de que alguns dos fenótipos INT6, tais como a formação de defeitos da mandíbula, pode ser phenocopied pela repressão da sinalização de Erk. Como interpretação de fenótipos MO recentemente tem sido complicada pela identificação de defeitos craniofaciais dependente de p53 induzida por MO [22], utilizou-se uma abordagem alternativa – o altamente selectivo, clinicamente activo inibidor MEK CI-1040 [23] – a reduzir a sinalização Mek em peixes-zebra. Nós adicionado o fármaco a 4 HPF a uma concentração de 0,25, 0,5, e 1,0 uM, e confirmada a perda da expressão de fosfo-Erk por análise de Western blot (

em dados não mostrados

). Notavelmente, a adição de CI-1040 causou uma perda dependente da dose das estruturas posteriores do embrião, de tal modo que 1,0 uM CI-1040 causou uma severa ântero-posterior (AP) defeito eixo (Figura 4A-C), consistente com uma papel para a sinalização do FGF no desenvolvimento do eixo AP [24]. CI-1040 também provocou perda de elementos de cartilagem ceratobranquial, enquanto que os elementos anteriores – Meckel’S, palatoquadrate hióide e cartilagens – estavam presentes, mas deformado (Figura 3G-J), semelhante aos efeitos observados em

INT6

morphants e mutantes .

(A-F). Imuno-histoquímica de INT6 e fosfo-Erk no desenvolvimento tecidos craniofaciais, contra-coradas com hematoxilina e H3 fosfo-histona para mostrar células de ciclismo. (G, H) montar toda Ventral vistas de Alcian Blue cartilagens faringe coradas mostram perda de arcos ceratobrancial 1-5 e uma redução de Meckel (M), palatoquadrate (PQ) e ceratohyal (CH) cartilagens em 4 dpf embriões tratados com 0,5 uM CI-1040. (I, J) As secções de 4 dpf hematoxilina embriões e eosina após o tratamento de 0,5 uM CI-1040 revela perda de arcos CB 1-5 (suportes). E, placa Ethmoid; PC, Parachordal cartilagem.

Para elucidar ainda mais a relevância biológica de sinalização INT6 e Mek, aproveitamos a facilidade com que as vias de sinalização pode ser alterada farmacologicamente em contextos genéticas específicas no sistema de peixe-zebra. Nós fundamentado que se INT6 contribui para a activação da sinalização de Mek, em seguida, reduzida com embriões INT6 deve ser hipersensíveis a doses baixas do inibidor de MEK CI-1040. Em embriões de controlo tratados com 0,25 uM de CI-1040, não há mudanças nas eixo anterior-posterior foram detectados (Figura 4B). Além disso,

INT6

morphants gerada por baixas doses de MO (0,25 ng) não tem um eixo AP alterados (Figura 4D). Em contraste, em combinação com doses baixas de CI-1040, a dose baixa de

INT6

morphant mostrou um fenótipo melhorado severamente eixo AP (Figura 4E). Tomados em conjunto, estes dados fornecem mais provas de que

INT6

pode desempenhar um papel na modulação MEK sinalização

in vivo

.

(A-C). Só os embriões tratados com o 1,0 uM CI-1040, e não de 0,25 uM, mostram uma perda das estruturas posteriores, em contraste com a (D)

INT6

morphants (

INT6

MO 0,25 ng). (E, F), em combinação com 0,25 M de CI-1040, 0,25 mg de

INT6

MO provoca uma alteração dramática do eixo ântero-posterior.

Discussão

se ativa na maioria dos cânceres, a via de sinalização MAPK está entre os alvos mais atraentes para as terapias anti-cancro novos [23]. Como vias de sinalização MAPK, a maior parte do

Int

vias – Wnt, o FGF, e Notch – são reguladores do desenvolvimento que são frequentemente ativados para promover oncogênese conservada. Os dados mostram que, como outro

Int

produtos de genes,

INT6

é necessária para o desenvolvimento dos vertebrados (Figura 1), em parte através de uma camada nova de MAPK regulação de transdução de sinal (Figura 2) . Com o grande variedade de actividades celulares atribuídas a INT6, o detalhe mecanicista deste controlo permanece para ser compreendido; nossas primeiras investigações indicam redução da MEK1 em

INT6

-siRNA trataram células de mamíferos não é dependente do proteassoma (MG CJN,

inédita

de dados), a regulamentação seja MEK1 direta por INT6-dependentes tradução uma possibilidade.

recentemente, importância da RAS, RAF e MEK na doença humana foi estendido para além do cancro pela descoberta de que as mutações da linha germinal humana nestes genes causam a família LEOPARD-Noonan de síndromes [25] . estudos de imuno-histoquímica detalhadas em ratos identificaram altamente regulamentados, domínios específicos de fosforilação ERK discreta e dinâmica ao longo do desenvolvimento, incluindo os arcos faríngeos e brotos dos membros [26]. Nos primeiros estudos de expressão de proteína INT6 em todo o desenvolvimento de um animal, que mostram que INT6 tem regionalmente sobreposição domínios de expressão de proteínas com fosfo-Erk, principalmente na região craniofacial (Figura 3, Figura S4). Emprestando significado biológico para estas observações, que mostram que as características fenotípicas são partilhadas entre a perda de INT6 e inibição da actividade de MEK (Figura 3). Além disso, a perda parcial da INT6 provoca embriões para ser altamente sensíveis a uma dose ligeiramente comprometimento da inibição Mek, revelando um

In vivo

interacção entre a expressão da proteína de sinalização INT6 e Mek-Erk desenvolvimento (Figura 4). Já sobre-expressão de sinalização de Ras-Raf-Mek causa defeitos morfológicos, estamos actualmente a gerar linhas transgénicas que permitem o controle temporal da sinalização Mek, que será uma ferramenta valiosa para mais profunda análise genética da relação INT6-Mek-Erk

in vivo

. Será fundamental em futuros estudos para estabelecer se INT6 é capaz de controlar tanto Mek1 e Mek2; nossos estudos MO iniciais indicam que MEK2 pode ter um papel específico na migração de melanócitos (CA EEP,

inédita

de dados), levantando a possibilidade de que os defeitos de migração de células de pigmento observadas no

INT6

morphants também refletem a sinalização MEK alterada.

sinalização FGF é crucial para o desenvolvimento do esqueleto, exemplificado pelas mutações que interrompem a sinalização FGF em síndromes genéticas humanas esqueléticos anormalidade [27]. No embrião de ratinho em desenvolvimento, a maioria dos domínios fosfo-ERK sobrepor-se com os domínios de sinalização FGF [26]. moléculas de FGF sinalização são candidatos para activação a montante da sinalização Mek-Erk INT6-moderado que molda o esqueleto craniofacial em vertebrados [28], [29] e candidatos alvos a jusante de sinalização INT6-Mek-Erk incluem a diferenciação de condrócitos fator de transcrição Sox9 , o que requer a actividade Mek para actividade de transcrição [30]. Observamos também que

ERK2

, mas não

ERK1

, é especificamente expressa nos arcos faríngeos em dois dias de embriões de peixe-zebra velhos [31], possivelmente sugerindo que a modulação INT6-Mek no desenvolvimento região craniofacial especificamente pode sinalizar através de metas de Erk2.

Relacionando a modulação INT6 de Mek-Erk sinalizando para o desenvolvimento do câncer é um novo ângulo para futuras investigações. Uma possibilidade é que em MMTV induzido tumores mamários, da proteína truncada Int-6 pode actuar como um oncogene, alterando sinalização MEK-ERK. Propomos que as diversas localizações celulares de INT6, combinados com a expressão temporal e localização de Mek1 /2 e ERK1 /2, pode resultar em ajuste fino de vias de sinalização Mek-Erk em tecidos específicos durante o desenvolvimento, e pode ter implicações importantes para o papel da INT6 na tumorigênese.

Métodos

Zebrafish zootécnicos e morfolino estudos

Zerbafish (

Danio rerio

) linhas AB, AB *, e AB * -TPL foram levantadas e encenado como descrito [32], [33]. MOs (Tabela 1) foram desenhados por e comprado de Ferramentas Gene, LLC (EUA), e 1 ng injetado em embriões em estágio de uma célula.

A análise do fenótipo

A análise do fenótipo foram realizada como descrito: estudos do ciclo celular [34]; coloração azul alcian [35]; síntese da sonda e de montagem em todo hibridizações in situ [36]. sondas de cDNA para marcadores da crista neural foram o dom tipo de David Raible (University of Washington, EUA). Poliadenilado

INT6

ARNm foi gerado usando Ambion mMessage mMachine (# 1340).

cultura celular e análise por RT-PCR

células MDA-MB-231 foram cultivadas e transfectadas como descrito [19] utilizando Lipofectamina (Invitrogen) com Si-oligonucleótidos (Tabela 1; Eurogentec) a uma concentração final de 100 nM em Optimem (Gibco). Quarenta e oito horas após a transfecção o ARN total foi isolado (RNeasy Mini Kit; Qiagen). E uma etapa reacções de RT-PCR (Qiagen) realizada utilizando iniciadores específicos (Tabela 1)

imunotransferência

Os lisados ​​de células inteiras e extractos de peixe-zebra foram gerados [31], [19] e imuno-histoquímica foi realizada como descrito [36]. Os anticorpos usados ​​como na Tabela 2.

Informações de Apoio

Figura S1.

análise do ciclo celular de morphants INT6. imuno-histoquímica com os números G2 tardio /marcador fase M, fosfo-histona H3 mostra apenas ligeiramente reduzidas de células inteiras de montagem no final de fase G2 /M no morphant INT6 comparação com o controlo. Da mesma forma, o teor de ADN como medido por citometria de fluxo revela apenas uma leve redução de células na fase G2 /M no morphant INT6. Assim, descobrimos que a perda de INT6 em células de vertebrado normal (bem como em linhas de células de cancro humanas adicionais, MG CJN dados não publicados) não parece conduzir a uma acumulação de células em G2 progressão /M

Doi.: 10.1371 /journal.pone.0000959.s001

(4,75 MB TIF)

Figura S2.

vistas lateral da hibridação in situ de marcadores da crista neural e no controle INT6 morphants, revelando nenhuma mudança no número de células ou de migração, conforme indicado pela expressão de Dlx2 aparentemente normal (fases 6-36 HPF, examinadas em intervalos de duas horas), nem de marcadores precoces de NCC e melanócitos, como SOX10, Crestin, caracol e mitfa (24 hpf) em morphants INT6. Estas observações foram estendidos pelo exame de uma linha SOX10-GFP transgênicos (1) revelando inalterado GFP-expressando células NC-derivados em morphants INT6 nas primeiras 48 hpf, mas uma perda de GFP expressando arcos faríngeos diferenciadas 3-7 de 3 dpf ( dados não mostrados)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s002

(40.41 MB TIF)

Figura S3.

Desenvolvimento dos arcos faríngeos no controle em desenvolvimento (A-C) e (D-F) INT6 morphant animais. Note-se a perda de arcos faríngeos (A, do suporte) nos morphants INT6 (suporte). Os cortes foram corados com azul de metileno. Anterior à esquerda

doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s003

(14.09 MB TIF)

Figura S4. A imuno-histoquímica de

INT6 e fosfo-Erk coloração em embriões 4 dpf. (A, B) Enquanto INT6 e fosfo-Erk sinalização sobreposição na região craniofacial, eles também têm padrões distintos, por exemplo, no olho e no intestino (C, D). Notamos que, enquanto INT6 e fosfo-Erk têm domínios sobrepostos de expressão na região craniofacial, coloração INT6 na região craniofacial era mais forte do que a fosfo-Erk, coloração e fosfo-Erk foi limitada a tecidos específicos dentro da região craniofacial. M, Meckel de; E: placa Ethmoid; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial. corte sagital, anterior à esquerda

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s004

(17.60 MB TIF)

Reconhecimentos

Somos gratos a N. Hopkins , A. Amesterdão e S. Farrington para o

INT6

linha hi2470

; R. Marais e C. Marshall para CI-1040; D. Raible para construções de ADN; K. Gull para detecção de anticorpos anti-tubulina; E. Prichard para observações adicionais CI-1040; D. Faratian para obter ajuda com imuno-histoquímica; B. Morgan para obter ajuda com preparação do manuscrito; L. Poulton para a leitura crítica do manuscrito; e N. Hastie e D. Harrison para discussões úteis.