Abstract

overexpressed CEACAM6 em tecidos tumorais desempenha um papel importante na invasão, metástase e resistência anoikis em uma variedade dos cancros humanos. Nós informou recentemente que a expressão CEACAM6 é regulada no cancro gástrico (CG) tecidos e promoveu a metástase GC. Aqui, nós relatamos que CEACAM6 promove metástases peritoniais

em

vivo

e está negativamente correlacionada com a expressão de E-caderina em tecidos GC. Overexpressed CEACAM6 transição epitelial-mesenquimal induzida (EMT) em GC, tal como medido por um aumento nos marcadores de EMT N-caderina, e Vimentina Slug enquanto que a expressão de E-caderina foi reduzida nas células que sobre-expressam GC CEACAM6-; resultados opostos foram observados em células silenciou-CEACAM6. Além disso, a expressão de E-caderina foi negativamente correlacionada com a profundidade de invasão tumoral, metástases linfonodais e estágio TNM em tecidos GC. Além disso, CEACAM6 elevada matriz metaloproteinase-9 (MMP-9) na actividade de GC, e anticorpo anti-MMP-9 poderia reverter a crescente invasão e a migração induzida por CEACAM6. CEACAM6 também aumentou os níveis de AKT fosforilado, que está envolvida na progressão de uma variedade de tumores humanos. Nós ainda observado que LY294002, um inibidor de PI3K, poderia reverter EMT-induzida CEACAM6 via mesenquimal-epitelial. Estes achados sugerem que CEACAM6 aumenta a invasão e metástase no GC através da promoção de EMT através da via de sinalização PI3K /AKT

Citation:. Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Zhu Z, et al . (2014) CEACAM6 Promove câncer gástrico invasão e metástase através da indução de transição epitelial-mesenquimal via PI3K /AKT via de sinalização. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10.1371 /journal.pone.0112908

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 07 de agosto de 2014; Aceito: 16 de outubro de 2014; Publicação: 14 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81.172.324, No. 91.229.106, No. 81.272.749, e nº 81372231), e Projeto chave do Comitê Shanghai Educação (No. 12ZZ105 e No.12ZZ102) e da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (No. 13ZR1425600). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

GC é um dos tumores malignos mais comuns e um grave problema de saúde em todo o mundo, particularmente em países do leste da Ásia, como o Japão, Coreia, China, onde é a segunda causa de morte relacionada ao câncer [1] – [3]. Carcinoembrionário molécula de adesão célula-antigénio relacionado 6 (CEACAM6) é um glicosilfosfatidilinositol (GPI) membro da superfamília de imunoglobulina -Conectado que é sobre-expresso numa variedade de cancros humanos, especialmente cancros gastrointestinais [4], e funciona como uma molécula de adesão intercelular [4] – [6]. Embora CEACAM6 é uma superfície celular ancoradas a GPI glicoproteína transmembranar que carece de um ou domínio intracelular, mas é capaz de influenciar os acontecimentos intracelulares de sinalização e desempenha um papel importante na progressão do cancro gastrointestinal [4], [6] – [8]. moléculas ancoradas a GPI são frequentemente co-localizada para microdomínios membrana pequenas na membrana do plasma [9], o qual pode activar cascatas de sinalização a jusante, tais como a via de sinalização da integrina [10]. CEACAM6 actua como um oncogene em tumores e promove a invasão do cancro, metástase, resistência e anoikis quimiorresistência, inibe a diferenciação e [7], [8], [11]. Nós informou recentemente que a expressão CEACAM6 é regulada e associado a metástases em linfonodos em tecidos GC [12]. No entanto, os mecanismos através dos quais as influências CEACAM6 transdução de sinal intracelular em GC continuam a ser determinado.

epitelial-mesenquimal transição (EMT) é não só um processo fisiológico durante o desenvolvimento embrionário ou a regeneração dos tecidos, mas também um elemento patológico em a progressão do cancro, envolvendo metástase de tumor, apoptose e resistência à senescência [13] – [15]. EMT sempre indica um prognóstico clínico pobre em cancros humanos. Um número de mecanismos necessários para a iniciação EMT foram documentados, incluindo o TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK, e vias SRC [15] – [18]. Em nosso estudo anterior, observou-se a activação SRC induzida por CEACAM6 em células GC [12], e observaram aumento do número de células-superexpressão CEACAM6 fusiformes em comparação com células de controlo. Por isso, ficamos muito interessados ​​em determinar a relação entre CEACAM6 e EMT em células GC. Embora correlação negativa entre CEACAM6 e EMT foi gravada em carcinomas de pâncreas [19], os mecanismos pelos quais CEACAM6 regula EMT são mal compreendidos.

Neste estudo, examinamos mais profundamente os efeitos e possíveis vias de CEACAM6 em GC invasão e metástase, e investigou sua correlação com EMT.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

consentimento informado escrito no estudo foi obtido de todos os participantes. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Ruijin Hospital, Escola de Medicina da Universidade de Shanghai Jiao Tong. procedimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) em Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China.

As linhas celulares e amostras de tecido

O humano linhas celulares GC SGC-7901, MKN-45 e MKN-28 foram adquiridos a partir de Xangai Institutos de Ciências Biológicas, da Academia chinesa de Ciências. As células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 e saturação de humidade no meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal de bovino.

tumor gástrico e tecido não tumoral adjacente foram obtidos a partir de 93 pacientes com GC submetidos à cirurgia curativa em Shanghai Jiaotong University School of Medicine Filiado Ruijin Hospital de 2010 a 2013. Os pacientes consistiu de 69 homens e 24 mulheres com idade média de 62,1 anos (variação, 30-85 anos). Nenhum dos pacientes havia recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. dados clínico-patológicos foram coletadas e estadiamento do tumor patológico foi determinada de acordo com a classificação UICC TNM. tipagem histológica foi realizada por, pelo menos, dois patologistas especialistas que trabalham independentemente num modo duplamente cego. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Shanghai Ruijin Hospital de Ética, e todos os pacientes foram devidamente informados dos procedimentos experimentais.

construção Vector e transfecção

cDNA CEACAM6 Full-length foi obtida por RT- PCR a partir de ARN total extraído de amostras de GC. As sequências iniciadoras foram 5′-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 ‘(directo) e 5′-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3’ (inverso). Nós montamos uma pIRES2-eGFP-CEACAM6 construir através da inserção de cDNA CEACAM6 em pIRES2-eGFP vetor. Nós próxima transfectadas pIRES2-eGFP-CEACAM6 ou pIRES2-eGFP vector no SGC-7901 e MKN-45 células usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Os clones estáveis ​​foram seleccionados por meio de tratamento contínuo com G418 (1,2 mg /ml; Gibco, New York, EUA)

vector lentiviral construção

Com base em dados de genes humanos CEACAM6, um par de sequências de oligonucleótidos. e sequências de controlo negativo foram concebidos e sintetizados por Shanghai Novobio Scientific Co., Ltd. shRNA sequências foram as seguintes: CEACAM6, 5′-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 ‘(para a frente), e 5′-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3′ (inverso); controlo, 5’-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 ‘(para a frente), e 5′-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’ (inverso). CEACAM6 shRNA foi subclonado em PL /shRNA /F lentiviral vector para obter uma construção PL /shRNA /SHR-CEACAM6. Em seguida, PL /shRNA /SHR-CEACAM6 ou controlar vetores de lentivírus foram transfectados para MKN-28 células GC. As células transfectadas estavelmente foram selecionados por tratamento com 5 mg /ml blasticidina e foram utilizados para a identificação e investigação futura.

Western blot

As células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA (Solarbio, Beijing, China ) contendo inibidores de proteases PMSF 1%. Um kit de ensaio BCA (Pierce, Rockford, EUA) foi utilizado para medir a concentração de proteína total. quantidades equivalentes de proteína foram separadas por 10% SDS-PAGE, e as proteínas resolvidas foram transferidos para membranas PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% durante 2 h e, em seguida, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários foram como se segue: CEACAM6 (1:500; Abcam, EUA), a E-caderina (1:500; Cell Signaling Technology (CST), EUA), N-caderina (1:500; CST, EUA), vimentina ( 1:1000; CST, EUA), Slug (1:500; CST, EUA), p-AKT (Ser473) (1:1000; CST, EUA), AKT total (1:1000; CST, EUA) e GAPDH ( 1:10000; Abcam, EUA). As membranas foram então incubadas com o anticorpo secundário durante 2 h a temperatura ambiente e foram visualizadas utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, EUA), em conformidade com o protocolo do fabricante.

coloração de imunofluorescência

As células foram cultivadas em lamelas durante 24 h e, em seguida, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 min. As células foram lavadas com PBS, depois permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 durante 20 min e bloqueadas com BSA a 5% durante 30 min à temperatura ambiente. A seguir, as células coradas com anticorpo CEACAM6 (01:50; Abcam) a 37 ° C durante 2 h, seguido de incubação com o anticorpo secundário fluorescente durante 1 h à temperatura ambiente. Os núcleos foram corados com DAPI. anticorpo rodamina faloidina (1:150; citoesqueleto) foi usada para visualizar o citoesqueleto das células de GC. As lâminas foram analisadas e fotografada em um microscópio de fluorescência.

Imunohistoquímica

As secções de 4 mm de espessura foram cortadas de blocos de tecido embebidos em parafina e depois desparafinizadas e reidratadas. a coloração imuno-histoquímica de secções foi realizada de acordo com o protocolo DAKO, usando o rato anti-CEACAM6 (1:100; Abcam) e E-caderina (1:100; cSt) a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram então incubadas com o anticorpo secundário marcado com HRP e visualizadas por diaminobenzidina. Dois patologistas que foram cegados a quaisquer dados de pacientes avaliados independentemente e marcou as seções. pontuação pontuação = celular positiva mancha imuno-histoquímica + coloração pontuação intensidade. A percentagem de células positivas foi pontuado como se segue: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 ( 75%). intensidade de coloração imuno-histoquímica foi classificada como se segue: 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (coloração castanha), e 3 (coloração castanha escura). Os escores totais de ≥3 foram definidos como positivo para simplificar a análise de dados. Para analisar a correlação entre CEACAM6 e expressão da caderina-E, Imagem-Pro Plus versão 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, EUA) foi utilizado para quantificar a expressão de CEACAM6 e E-caderina em 20 amostras.

gelatina zimografia

Para examinar a actividade de MMP-9, foi realizada zimografia utilizando géis de 10% SDS-PAGE contendo 1 mg /ml de gelatina (Sigma). Resumidamente, as células de GC foram cultivadas em meio RPMI-1640 isento de soro durante 24 h e o sobrenadante foi, então, recolhido e centrifugado a 1000 rpm durante 5 min. Os geles foram lavados duas vezes em tampão de renaturação (2,5% de Triton X-100) durante 30 min de cada vez para remover o SDS após electroforese e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 24 horas num tampão de reacção (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 5 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl). A seguir, os géis corados com 0,5% de azul brilhante de Coomassie R-250 durante 2 h e descorado os geles em tamp (30% de metanol, 10% de ácido acético). bandas transparentes claro no fundo da coloração azul representavam as atividades gelatinase.

ensaios

migração e invasão celular

Para os ensaios de migração e invasão celular, um total de 1 × 10

5 células foram suspenso em isento de soro RPMI-1640, com ou sem anticorpo MMP-9 (Abcam, 2 ug /200 ul) e plaqueadas em Transwell câmaras (8 uM para placa de 24 poços; Corning Costar, NY, EUA), com ou sem Matrigel ( BD Bioscience, CA, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. Para ambos os ensaios, meio contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. Após 24 h de cultura, as células foram fixadas em 10% de formalina e coradas em 0,5% de violeta de cristal. Finalmente, as células na câmara inferior foram fotografadas e contadas por microscopia invertida.

rato Nude modelo de xenotransplante

macho de quatro semanas de idade camundongos BALB /c nu (Institute of Zoology, China Academy of Ciências) foram usadas para avaliar o papel da CEACAM6 em peritoneal espalhando

em

vivo

. ratinhos nus foram alojados em um ambiente específico isento de agentes patogénicos na Unidade de Laboratório Animal, Faculdade de Medicina da Shanghai Jiao Tong University, na China. Os ratos receberam cuidados e os protocolos de estudo foram realizadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) em Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China. Um total de 2 x 10

6 SGC-7901-CEACAM6 ou células SGC-7901-nc foram injectados em cinco ratinhos cavidade abdominal de cada grupo (aleatorização). Os ratinhos foram sacrificados no dia 30 após a injecção, e as massas abdominais foram visualizados e fotografados. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações oficiais da comunidade Chinese animal.

Estatísticas

Student

t

-test foi usado para examinar as diferenças estatísticas entre os dois grupos . As correlações entre a expressão da caderina-E em tecidos GC e os parâmetros clínico e expressão CEACAM6 foram analisadas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher ou análise do coeficiente de correlação de Pearson. Os dados são apresentados como média ± DP.

P Art 0,05 e

P

. 0,01 foi considerado estatisticamente significativo e altamente significativa, respectivamente

morfologia celular Resultados

CEACAM6 afeta eo citoesqueleto

Os nossos resultados anteriores implícita de que as células MKN-28 GC inerentemente expressam altos níveis de CEACAM6, enquanto que as células SGC-7901 e MKN-45 GC expressam níveis baixos [12]. Superexpressão de CEACAM6 no SGC-7901 e MKN-45 células GC e atenuação da expressão CEACAM6 em células MKN-28 GC pelo PL /shRNA /SHR-CEACAM6 lentivirais foram confirmados no nível de proteína por análise de western blot (Fig. 1A). imunofluorescência sempre mostraram que as células SGC-7901-CEACAM6 expressa mais proteína do que CEACAM6 SGC-7901-NC células (Fig. 1B).

(A) superexpressão estável e supressão de CEACAM6 em células GC. expressão (B) CEACAM6 foi analisado por imunof luorescência, e mais CEACAM6 expressão foi detectada em células que sobre-expressam CEACAM6 do que em células de controlo (200 ×). Azul: DAPI; vermelho: CEACAM6. (C) A superexpressão de CEACAM6 no SGC-7901 e as células MKN-45 induziu uma morfologia mesenquimais, enquanto knockdown de CEACAM6 em MKN-28 células induzidas morfologia epitelial (200 ×). (D) A imunocoloração de F-actina em células que sobre-expressam CEACAM6 e células de controlo (400 ×). Vermelho: F-actina; azul:. DAPI

Curiosamente, houve alteração morfológica seguinte CEACAM6 atenuação e superexpressão. Em comparação com as células de controlo, as células SGC-7901-CEACAM6 e MKN-45-CEACAM6 exibiu uma morfologia mais mesenquimais semelhante, e foram spindle- e em forma de fusiforme (Fig. 1C). Por outro lado, a transição típica da morfologia mesenquimal epiteliais foi detectada em células MKN-28-SH em comparação com células-MKN-28 NC (Fig. 1C). No entanto, não era claro se a sobre-expressão CEACAM6 tinha um efeito sobre o citoesqueleto, assim coloração imunofluorescente de coloração de F-actina foi realizada. Curiosamente, foram observadas células fusiformes em forma de maior porte para MKN-45-CEACAM6 e linhas SGC-7901-CEACAM6 em comparação com as células de controlo (Fig. 1D).

CEACAM6 está negativamente associado com a E-caderina em tecidos GC

análise imuno-histoquímica foi usada para determinar os níveis de expressão de e-caderina em tecidos de cancro e tecidos emparelhados não-tumorais adjacentes. coloração imuno-histoquímica mostrou expressão de E-caderina foi menor em tecidos tumorais do que em tecidos não tumorais adjacentes, e revelaram que a E-caderina está localizado principalmente no cytomembrane de células epiteliais (Fig. 2D, E, F). Em seguida, investigou-se a relação entre a expressão da caderina-E e as características clinicopatológicas de GC, e descobriu que subregulado E-caderina foi associada a profundidade da invasão (

P

= 0,046), metástases em linfonodos (

P

= 0,013), e estágio TNM (

P

= 0,035), mas não com outros fatores clínico-patológicas, incluindo sexo, idade, ou diferenciação (Tabela 1). Além disso, CEACAM6 foi negativamente correlacionada com EMT em carcinomas de pâncreas [19] e supressão CEACAM6 poderia aumentar a atividade do promotor E-caderina em câncer colorretal [20].

(A) expressão CEACAM6 negativo na mucosa gástrica não-tumor. (B, C) expressão CEACAM6 positivo ou negativo em amostras de GC. (D) a expressão da caderina-E positivo forte na mucosa gástrica não-tumoral. (E, F) expressão da caderina-negativos ou positivos em amostras de GC. (G) correlação negativa entre a expressão CEACAM6 e E-caderina foi detectada em tecidos GC (R = -0,636,

P Art 0,01). (200 ×)

Além disso, investigamos a correlação entre a e-caderina e CEACAM6 em GCs pela seção de imuno-histoquímica de série (20 amostras). CEACAM6 expressão em tecidos de tumor foi maior do que em correspondentes tecidos não tumorais (Fig. 2A, B, C), consistente com os nossos resultados anteriores [12]. Curiosamente, descobrimos que a expressão CEACAM6 foi negativamente correlacionada com a expressão de E-caderina em tecidos GC por Pearson análise do coeficiente de correlação (

P Art 0,01; Fig. 2G).

CEACAM6 induz EMT em células GC

proteínas relacionadas à EMT em células de GC foram avaliados por análise de western blot. Observou-se que a N-caderina, vimentina e os níveis de proteína do Slug foram aumentadas, enquanto que a E-caderina foi reduzida nas células que sobre-expressam CEACAM6 em comparação com as respectivas células de controlo (Fig. 3A, B). resultados inverso foram obtidos após CEACAM6 foi derrubado em células MKN-28 (Fig. 3C, D). Estes resultados sugerem um papel funcional para CEACAM6 na regulação EMT em células GC. Além disso, estas observações em células de GC foram semelhantes com os achados no tecido GC.

(A, C) Os níveis de proteína de marcadores EMT foram analisadas por análise de western blot em células GC com CEACAM6 superexpressão ou knockdown. (B, D) expressão do marcador EMT Relativa em células GC CEACAM6-superexpressão e -silenced foram calculados pela relação de escala de cinza. Os resultados são meio de três experimentos independentes nos gráficos de barras. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

CEACAM6 eleva a atividade da MMP-9 em células GC

é bem sabido que a adesão, a degradação ea migração são questões importantes na metástase do câncer. Gelatina zimografia foi levada a cabo para examinar os efeitos de CEACAM6 sobre a actividade da MMP-9, o que é importante na degradação da ECM. MMP-9 em células de actividade MKN-45-CEACAM6 SGC-7901-CEACAM6 e foi aumentado em comparação com os grupos de controlo (Fig. 4A, B). A seguir, investigou se o aumento da actividade de MMP-9 induzida por CEACAM6 em células GC resultou numa verdadeira incremento no número de invadir células e a migração. Foram examinados, assim, a contribuição de anti-MMP-9 anticorpo activo ou PBS às células GC CEACAM6-superexpressão. Como esperado, houve diferenças significativas no número de invadir e migração de células em células tratadas com anticorpo, quando comparada com células tratadas com PBS (

P

0,01; Fig. 4C, D, E, F).

(A) O sobrenadante de células de GC foi colhida após 24 h. Em seguida, a actividade de MMP-9 foi examinado por zimografia em gelatina. (B) Relativa expressão de MMP-9 em células de GC. ensaio (C, E) Transwell. Imagens mostram células que tinham viajado através da membrana microporosa com ou sem matrigel (200 ×). (D, F) Os histogramas mostram os números de células e a migração de células invasoras. Os resultados são meio de três experimentos independentes nos gráficos de barras. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

CEACAM6 regula positivamente AKT fosforilada em células GC

Foi observado anteriormente que a atividade SRC foi induzida por CEACAM6 em células GC SGC-7901. AKT é uma proteína a jusante do SRC e é dramaticamente associada com EMT, invasão e metástase em progressão tumoral. Por isso, avaliou a actividade AKT em células GC CEACAM6-superexpressão. Western blot mostrou que a AKT fosforilação em serina 473 foi significativamente aumentada em células que sobre-expressam GC-CEACAM6 em comparação com os grupos de controlo (Fig. 5A, B). Para examinar se as alterações EMT foram induzidas por CEACAM6 através da via PI3K /AKT, células SGC-7901-CEACAM6 e MKN-45-CEACAM6 foram tratadas com 100 nM de LY294002, durante 24 h. Curiosamente, a E-caderina foi aumentada e N-caderina foi reduzida nas células que sobre-expressam CEACAM6 tratados com LY294002 em comparação com os controlos, tal como medido por análise de Western blot (Fig. 5C, D).

(A) Ocidental análise de mancha mostraram que a sobre-expressão de P-CEACAM6 aumentou a fosforilação de AKT (Ser473). GAPDH e AKT total foram usados ​​como controlos de carga. (B) A quantificação da expressão de p-AKT (Ser473) em células de GC. expressão (C) E-caderina foi aumentada enquanto que a expressão de N-caderina foi reduzida nas células que sobre-expressam GC CEACAM6-tratados com LY294002, um inibidor de PI3K. (D) Relativa de E-caderina e N-caderina nas células que sobre-expressam CEACAM6 e GC-tratada LY294002 foram calculados pela relação de escala de cinzentos. Os resultados são meio de três experimentos independentes nos gráficos de barras. *

P

. 0,05

CEACAM6 promove peritoneal propagação in vivo

Finalmente, examinou os efeitos de CEACAM6 superexpressão em peritoneal propagação e metástase

em

vivo

. Nós injetamos SGC-7901-CEACAM6 e SGC-7901-NC células nos abdomens de ratos nus. peritoneal extensa propagação foi observada no grupo SGC-7901-CEACAM6 em comparação com o grupo SGC-7901-NC (Fig. 6A). Havia nódulos peritoniais significativamente mais visíveis no grupo SGC-7901-CEACAM6 do que no grupo controle (5,400 ± 0,510

vs

1,400 ± 0,245,

P

. 0,01; A Fig. 6B ). Além disso, a sobre-expressão de CEACAM6 reforço metástase

em

vivo

também tem sido relatada em câncer pancreático [19].

(A) foram observados Aumento do número de nódulos metastáticos na grupo SGC-7901-CEACAM6 do que o grupo de controlo, como indicado pelas setas pretas. (B) Número médio de nódulos peritoniais em dois grupos. Mais nódulos ocorreu no grupo SGC-7901-CEACAM6 do que o grupo SGC-7901-NC.

Discussão

GC é a segunda causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1] . A evidência crescente indica que CEACAM6 desempenha um papel importante no cancro gastrointestinal progressão [7], [20] – [22], e CEACAM6 está mais amplamente distribuído do que o CEA (CEACAM5) em tecidos normais, com expressão significativa em muitos epitélios [4]. influências CEACAM6 eventos de sinalização intracelular através homofílico e adesão heterofílico com outros CEACAMs ou integrinas [23], [24]. O objetivo deste estudo foi examinar as contribuições de proteínas GPI-ancorada CEACAM6 na progressão GC.

Curiosamente, observou-se que a morfologia das células e da estrutura do citoesqueleto foi alterada pela regulação positiva estável e downregulation CEACAM6 em células GC. células que sobre-expressam CEACAM6 eram mais mesenquimais-like e exibiu uma forma de fuso e fusiforme, e mais fibras de stress de actina foram detectadas em comparação com os grupos de controlo, em um processo como definido EMT. O fenótipo mesenquimal dota células com propriedades mais migratórias e invasivos [15]. Esta observação foi consistente com o

em

vivo

resultados pelo qual CEACAM6 induzidas extensa peritoneal espalhando em ratinhos nus. TEM foi observado após silenciamento de CEACAM6 em células GC. Estas observações demonstram que CEACAM6 podem estar envolvidos na indução de EMT em GC. A seguir, examinou a correlação entre CEACAM6 e E-caderina, um marcador de EMT, em tecidos GC por coloração imuno-histoquímica. Como esperado, foi observada correlação negativa significativa entre CEACAM6 e E-caderina, e expressão da caderina-E foi associado com profundidade de invasão tumoral, metástases linfonodais e estágio TNM em tecidos GC. Além disso, CEACAM6 promovido metástases em linfonodos (

P

= 0,001) em 98 tecidos GC em nosso estudo anterior [12]. Resultados anteriores mostraram que CEACAM6 atenuação aumentada a actividade do promotor de E-caderina em cancro colorrectal [20]. Com base nos resultados acima referidos, que postularam que CEACAM6 promovido GC invasão e metástase através da indução de EMT e pode servir como um marcador mesenquimais.

A metástase é a principal causa de morte associada a cancro, mas tem sido difícil de estudar porque envolve uma série de acontecimentos raros, estocásticos. Um certo número de potenciais vias de sinalização relevantes para metástases de cancro tenham sido ilustradas, incluindo a via PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ, e vias MMPs [25] – [27]. Neste estudo, a sobre-expressão de CEACAM6 elevada actividade de MMP-9, e o anticorpo anti-MMP-9 pode reverter as crescentes propriedades invasivas e migratórias induzidas por CEACAM6. iniciação EMT é significativamente correlacionada com a metástase do cancro, induz a haste e as propriedades das células, impede a apoptose e senescência, e contribui para a imunossupressão na progressão do cancro [15]. EMT pode ser induzida através da activação da via de sinalização de PI3K /AKT [28], [29]. funções CEACAM6 como uma molécula de adesão intercelular e podem formar maiores jangadas lipídicas por interagir com o próprio ou outros CEACAMs, activando assim as cascatas de sinalização a jusante, tais como a integrina e PI3K /AKT [10], [30]. Portanto, examinámos os efeitos de CEACAM6 superexpressão sobre os níveis de fosforilação de AKT em células de GC. níveis AKT fosforilados foram aumentados em células que sobre-expressam CEACAM6, consistente com resultados anteriores observou nos carcinomas pancreáticos [8], [11]. De acordo com estas observações, propomos uma hipótese em que EMT induzida por CEACAM6 ocorre através da ativação da PI3K /AKT cascata de sinalização na GC. Além disso, as células-superexpressão CEACAM6 tratados com LY294002, um inibidor de PI3K, passou por uma reversão de EMT via MET. Assim, podemos concluir que CEACAM6 induz EMT ativando o PI3K /AKT via de sinalização no GC e pode servir como um alvo potencial no tratamento de tumores.

Em conclusão, temos ilustrado que CEACAM6 atua como um oncogene, promovendo EMT através da ativação PI3K /AKT no GC. Além disso, E-caderina é marcadamente reprimidos em tecidos de GC do que os tecidos não tumorais adjacentes emparelhados. CEACAM6 promove invasão e metástase

em

vitro

e

em

vivo

, e pode ser um potencial novo marcador diagnóstico e prognóstico e novo alvo para GC terapia.

Informações de Apoio

Checklist S1.

A CHEGADA orientações. Todos os experimentos in vivo em nosso manuscrito foram exportados em conformidade com as orientações CHEGAM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112908.s001

(DOC)

Reconhecimentos

gostaria de agradecer Xuehua Chen e Zhang Jianian para a assistência técnica, a Beiqin Yu por seu apoio material.