Abstract
Fundo
A taxa de sobrevivência de pacientes com câncer colorretal (CRC) que transportam KRAS tipo selvagem é significativamente aumentada pela combinação de anticorpo monoclonal anti-EGFR (mAb) com a quimioterapia padrão. No entanto, existem dados conflitantes, tanto no KRAS tipo selvagem e grupos KRAS mutante, que desafiam fortemente CRC tratamento anti-EGFR. Aqui nós conduziram uma meta-análise em um esforço para fornecer informações mais confiáveis sobre o tratamento anti-EGFR em pacientes com CCR.
Métodos
Nós pesquisados relatórios completos de ensaios clínicos randomizados, através do Medline, o americano Society of Clinical Oncology (ASCO) e da sociedade Europeia de Oncologia médica (ESMO). Dois investigadores selecionados de forma independente a literatura publicada de acordo com nossos critérios de inclusão e exclusão e os dados relativos foram extraídos. Usamos Review Manager 5.2 software para analisar os dados.
Resultados
A adição de EGFR anti-mAb à quimioterapia padrão melhorou significativamente a sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global mediana (MOS ) no grupo KRAS do tipo selvagem; taxas de risco (h) para a PFS e MOS foram de 0,70 [intervalo de confiança de 95% (CI), 0,58-0,84] e 0,83 [95% CI, 0,75-0,91], respectivamente. Na sub-análise do grupo KRAS do tipo selvagem, quando os ensaios baseados em PCR são empregados, PFS e Mos nomeadamente aumentar: os RHs foram 0,74 [IC 95%, 0,62-0,88] e 0,87 [IC 95%, 0,78-0,96] , respectivamente. Na sub-análise do grupo KRAS mutante, nem PCR baseada em ensaios nem sequenciação directa melhorar PFS ou Mós.
Conclusão
Nossos dados sugerem que os ensaios baseados em PCR com alta sensibilidade e especificidade permitem identificação precisa dos pacientes com KRAS tipo selvagem e, assim, aumentar a PFS e MOS. Além disso, tais ensaios libertar pacientes com KRAS mutante dos efeitos colaterais dos medicamentos desnecessários, e proporcionar-lhes a oportunidade de receber tratamento adequado. Assim, o estabelecimento de um teste padrão de referência precisos irá otimizar substancialmente terapias CRC-alvo
Citation:. Shan L, Li M, Ma J, Zhang H (2014) Ensaios de PCR-Based contra direto Sequencing para avaliar o efeito da Estado KRAS em Anti-EGFR resposta ao tratamento em pacientes com câncer colorretal: uma revisão sistemática e meta-análise. PLoS ONE 9 (9): e107926. doi: 10.1371 /journal.pone.0107926
editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de abril de 2014; Aceito: 21 de agosto de 2014; Publicação: 26 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Shan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. O financiamento foi fornecido pela National Science Foundation Natural da China (Grant No. 30901727, 81372496). HZ recebeu os financiamentos. URL para 81372496: https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantindex/funcindex/prjsearch-list. URL para 30901727: https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantindex/funcindex/prjsearch-list. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Não há autores declararam quaisquer potenciais conflitos de interesse
Introdução
ao longo das duas últimas décadas, progressos consideráveis em relação à biologia molecular do câncer colorretal (CRC) tem um aumento notável da as opções terapêuticas biológicas [1]. Um avanço importante foi a descoberta de dois anticorpos monoclonais (mAb) de segmentação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR): imunoglobulina quimérica G1 mAb (cetuximab) e um mAb de imunoglobulina G2 completamente humanizado (panitumumab). Estes anticorpos têm sido encontrados para ser muito eficaz em combinação com quimioterapia padrão ou como agentes terapêuticos individuais para a quimioterapia resistente CRC metastático (CCRm) [2], [3]. Em 2004, a United States Food and Drug Administration (FDA) aprovou o cetuximab como o primeiro mAb inibição de EGFR para o tratamento de CCRm, que foi seguido por homologação de panitumumab em 2006 [4], [5]. Infelizmente, quase um terço dos pacientes com CCRm não beneficiar desta terapia-alvo, mas também experimentam efeitos colaterais consequentes [6], [7]. Assim, é essencial identificar os doentes que têm maior probabilidade de responder a conseguir um tratamento personalizado. proteína KRAS é uma molécula chave de sinalização entre ligantes extracelulares de EGFR e de sinalização nas células. estudos retrospectivos extensas e ensaios de fase III revelou que mutações ativadoras gene KRAS são o principal preditor negativo de mCRC terapia anti-EGFR [8] – [10]. Com base nestes resultados, o FDA mudou as diretrizes para recomendar que cetuximab e panitumumab só pode ser dado a pacientes com CCR com KRAS tipo selvagem [11]. No entanto, os investigadores continuam relatando fatos conflitantes, tanto no KRAS tipo selvagem e grupos de mutantes: por exemplo, pacientes portadores de tipo selvagem KRAS não respondem, ao passo que aqueles que transportam KRAS mutante fez [12] – [15]. Tais dados contraditórios desafiar fortemente tratamento mCRC. Independentemente de a contribuição esporadicamente relatada de outras variações do gene, tais como mutações de BRAF, mutações PIK3CA, e perda de expressão de PTEN [16] – [19], a precisão dos métodos de genotipagem pode explicar este fenómeno. Por exemplo, um estudo experimental suporta esta hipótese, mostrando métodos altamente sensíveis para detecção de mutações KRAS identificados resistentes 13 pacientes com CCRm adicionais para EGFR anti-mAb comparação com sequenciação directa [20].
Para abordar sistematicamente esta questão, realizamos uma revisão sistemática e meta-análise para avaliar a sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global mediana (MOS) em pacientes cujo estado de KRAS foram detectados por ambos os ensaios baseados em PCR ou sequenciação directa. Comparou-se a capacidade destes dois métodos de genotipagem para avaliar o efeito do status de KRAS em resposta a CRC tratamento anti-EGFR.
Métodos
Estratégia de busca
O prazo para julgamento publicação foi 31 de dezembro de 2013. os relatórios completos de ensaios clínicos randomizados que abordaram o efeito de KRAS em resposta a CRC tratamento anti-EGFR foram recolhidas através de Medline (PubMed: www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed), o americano Society of Clinical Oncology (ASCO, www.asco.org), e da sociedade Europeia de Oncologia médica (ESMO, www.esmo.org). As palavras-chave utilizadas para a busca foram: CRC, mutação KRAS, cetuximab, panitumumab, quimioterapia, randomizado e mAb anti-EGFR. Em primeiro lugar, excluídos os protocolos de duplo anticorpo que também avaliaram anticorpo vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Em seguida, procurou os ensaios alvo de acordo com o fluxo de trabalho mostrado na Figura 1.
Os grupos de pacientes e subgrupos
Para avaliar o efeito global de drogas anti-EGFR mAb como uma adição ao padrão quimioterapia, dividimos todos os pacientes inscritos em dois grupos: o grupo experimental, tratados com uma combinação de EGFR mAb anti-e quimioterapia padrão; eo grupo controle, tratados apenas com quimioterapia padrão. Em seguida, analisamos o efeito de KRAS em resposta ao tratamento com anti-EGFR, dividindo ainda mais pacientes para o tipo selvagem KRAS KRAS e grupos mutantes. Para realizar sub-análises para comparar a capacidade dos diferentes métodos de genotipagem para avaliar o efeito de KRAS em resposta a CRC tratamento anti-EGFR, separamos os pacientes com KRAS diferente em dois subgrupos: o subgrupo ensaio baseado em PCR e a sequenciação directa subgrupo.
análise estatística
Foram extraídos taxas de risco (h) para a PFS e Mós, com intervalos de confiança de 95% (IC) dos ensaios inscritos. Os dados de PFS e MOS para cada ensaio são representados pelo registo da AR e sua variância experimental em comparação com o grupo controle, tanto em pacientes com tipo selvagem e mutante KRAS, de acordo com um método descrito anteriormente [21]. A HR 1 indica uma melhoria no PFS ou Mós. Se os estudos relataram log HR e variância, utilizou-los diretamente. Se os ensaios não forneceu estes valores, que extraiu os dados de curvas de sobrevivência, quando disponíveis, para estimar os valores da HR log e variância. Quando as curvas de sobrevivência para os grupos de tratamento não estavam disponíveis, outros dados, tais como os valores de P log-rank de teste e o número de eventos em cada grupo, foram extraídas para permitir estimativa da HR log e variância. Para obter RHs de resumo do grupo experimental em comparação com o grupo controle, os RHs de log foram agrupados usando um modelo de efeito aleatório ou modelo de efeito fixo para os resultados contínuos com ICs criados em% de significância de 95 [22]. Para determinar o modelo apropriado, empregamos 5,2 software Review Manager para analisar inter-estudo heterogeneidade. Quando o
P valor Compra de heterogeneidade foi inferior a 0,05, optamos por um modelo de efeito aleatório. Quando o
valor P Compra de heterogeneidade foi maior ou igual a 0,05, nós escolhemos um modelo de efeito fixo.
Resultados
Trials seleccionados
identificados dez ensaios de acordo com o fluxo de trabalho mostrada na Figura 1 [13], [23] – [31]. Estes ensaios são apresentados na Tabela 1. Um total de 6699 pacientes foram avaliados nesta meta-análise.
Sobrevivência livre de progressão (PFS)
Os resultados que mostram a adição de anti terapia -EGFR à quimioterapia padrão são apresentados na Figura 2. para todos os doentes, com ou sem mutações KRAS, além da terapia anti-EGFR notavelmente melhorada PFS [HR, 0,84 (IC de 95%, de 0,73-0,98), p = 0,02] de acordo a um modelo de efeito aleatório (valor P para heterogeneidade 0,00001). Quando avaliamos os dados com base no estado KRAS, observou-se uma melhoria significativa da PFS em pacientes com estado de tipo selvagem [HR 0,70, (IC 95%, 0,58-,84), P = 0,0001] de acordo com um modelo de efeito aleatório ( valor de P para a heterogeneidade 0,00001), mas não em pacientes com KRAS mutante [HR 1,06, (IC de 95%, 0,91-1,25), P = 0,44] de acordo com um modelo de efeito aleatório (valor P para heterogeneidade = 0,009). Na sub-análise do grupo KRAS do tipo selvagem, PFS aumentou consideravelmente no subgrupo ensaio baseado em PCR [HR 0,74, (IC 95%, ,62-,88), p = 0,0009] de acordo com um modelo de efeito aleatório (valor P para heterogeneidade 0,0001), mas não no subgrupo sequenciação directa [HR 0,55, (IC de 95%, 0,29-1,05), P = 0,07] de acordo com um modelo de efeito aleatório (valor P para heterogeneidade = 0,002). ensaio em sub-análises do grupo KRAS mutante, nem com base em PCR, nem a sequenciação directa reforçada PFS [HR 0,99, (IC 95%, 0,78-1,27), p = 0,96], de acordo com um modelo de efeito fixo (valor P para heterogeneidade = 0,97) e [HR 1,08, (IC 95%, 0,89-1,32), p = 0,43] de acordo com um modelo de efeito aleatório (valor P para heterogeneidade = 0,0003), respectivamente.
Median sobrevida global (MOS)
para os pacientes em geral, a adição de anti-EGFR não notavelmente melhorar as Mos [HR 0,94, (IC 95%, 0,83-1,05), p = 0,26] de acordo com um aleatório modelo de efeito (valor P para heterogeneidade = 0,002). No entanto, observou-se melhoria significativa da MOS no grupo KRAS do tipo selvagem [HR 0,83, (IC 95%, 0,75-0,91), P 0,0001] de acordo com um modelo de efeito fixo (valor P para heterogeneidade = 0,06). Na sub-análise do grupo KRAS do tipo selvagem, Mos aumento no subgrupo ensaio baseado em PCR, [HR 0,87, (IC 95%, 0,78-0,96), P = 0,004] de acordo com um modelo de efeito fixo (valor P para heterogeneidade = 0,55). O subgrupo sequenciação directa só incluiu um ensaio e não é aplicável para a meta-análise. No grupo KRAS mutante, não houve melhora evidente em Mos [HR 1,09, (IC 95%, 0,98-1,21), P = 0,11] de acordo com um modelo de efeito fixo (valor P para heterogeneidade = 0,49). Na sub-análise do subgrupo KRAS do tipo mutante, ensaios baseados em PCR não, obviamente, mudar a terapêutica para o CRC [HR 1,10, (IC 95%, 0,99-1,23), P = 0,009] de acordo com um modelo de efeito fixo ( valor P para heterogeneidade = 0,42). No subgrupo sequenciamento direto, o único ensaio não permite a meta-análise. Estes dados são apresentados na Figura 3.
Discussão
Novas terapias moleculares-alvo têm sido amplamente utilizados no tratamento de CRC com as vantagens distintas de alta especificidade e baixa toxicidade [32]. As evidências atuais aprovou que os pacientes de CRC com KRAS tipo selvagem vai responder ao tratamento anti-EGFR. No entanto, alguns pacientes com o tipo selvagem KRAS não apresentam a resposta esperada, enquanto que alguns pacientes com KRAS mutante não respondem bem. A principal explicação para tal observação contraditória pode ser porque a precisão dos métodos de genotipagem atuais variou entre os diferentes laboratórios e diferentes ensaios clínicos. Neste estudo, foram sistematicamente analisar as capacidades de ensaios baseados em PCR contra sequenciação directa para avaliar o efeito do estado de KRAS em resposta a tratamento anti-EGFR.
Como esperado, a presente meta-análise confirma os benefícios clínicos quando a terapia anti-EGFR é adicionado à quimioterapia padrão para o tratamento de pacientes com CCRm albergando KRAS tipo selvagem, com uma melhoria significativa em PFS. Quando realizamos sub-análises com base nas diferentes métodos de genotipagem, tanto PFS e Mos melhorada quando ensaios baseados em PCR foram empregados. Nestes 10 ensaios, os pesquisadores usaram ensaios baseados em PCR, incluindo a PCR fixação de fusão método da curva e em tempo real PCR alelo-específica, para detectar mutações KRAS. As sensibilidades destes dois métodos são de 0,1% e 0,5% [33], [34], respectivamente. Em comparação, a sensibilidade de sequenciação directa é de 10-20% [35]. Assim, os métodos baseados em PCR permitir a detecção sensível de baixa abundância mutações KRAS, aumentar a taxa de detecção, exclui a maioria dos pacientes com KRAS mutante e, portanto, melhorar a PFS e MOS. Assim, expuseram uma nova pista sobre a contradição em tratamento mCRC: há uma subpopulação de pacientes com CCRm KRAS portadores de mutações de baixo nível entre os pacientes com KRAS tipo selvagem e aqueles com abundante KRAS mutante. Devido à sensibilidade limitada dos métodos de análise, esta subpopulação de pacientes normalmente não é agrupado corretamente, fazendo com que o tratamento de ir na direção errada. Isso resulta em um resultado imprevisível para pacientes individuais, como também dramaticamente confunde a estratégia de tratamento CCRm. Uma solução para este problema irá melhorar significativamente o tratamento de pacientes com CCRm.
Em comparação com a alta especificidade da sequenciação directa, devemos considerar a especificidade dos ensaios baseados em PCR quando usamos os resultados de genotipagem para estimar a eficiência de anti- EGFR terapia-alvo. A potencialmente alta taxa de erros falso-positivo de ensaios baseados em PCR pode excluir pacientes portadores do tipo selvagem KRAS de receber o tratamento correto. Nós propomos que os ensaios baseados em PCR irá grupo alguns pacientes KRAS do tipo selvagem para o grupo mutante, e assim incorretamente aumentar PFS e MOS do grupo mutante. Curiosamente, não observamos esse fenômeno em nosso estudo, o que sugere que os ensaios baseados em PCR utilizados nestes ensaios são específicas o suficiente para divulgar KRAS mutante. Um desses ensaios é uma fixação por PCR e o método de curva de fusão. A braçadeira é utilizada aqui PNA (ANP) em que a estrutura de fosfato de açúcar de ácido nucleico natural é substituído por um esqueleto do péptido sintético, e reconhece uma sequência específica de ADN obedecendo o esquema de ligações de hidrogénio de Watson-Crick [36]. O ANP-ADN heteroduplex exibe uma estabilidade extraordinária térmica, enquanto que a incorporação de qualquer desfasamento no duplex irá diminuir a estabilidade térmica em mais de 10 ° C; isso permite a detecção altamente específico de mutação [33], [36]. detecção de mutações por-tempo real, específico para o alelo de PCR baseia-se no princípio de que a extensão é eficiente quando a base do terminal 3 ‘de um iniciador corresponde ao seu alvo, ao passo que a extensão é ineficaz ou inexistente, quando a base do terminal é incompatível, e também mostrou boa especificidade em aplicações anteriores [37], [38]. O PCR em tempo real, específico para o alelo utilizado na corrente inscritos ensaios clínicos é um ensaio comercializado por DxS Ltd., que garante ainda mais a especificidade elevada [39]. Em suma, ao tratamento CRC precisamente directo personalizado, recomendamos tais métodos altamente específicos ou outros métodos, com alta especificidade.
Outros aspectos a avaliar um ensaio baseado em PCR incluem taxa de transferência, contaminação e conveniência. A combinação de amplificação por PCR e PCR em tempo real nestes dois tipos de métodos baseados em PCR, PCR de fixação de ponto de fusão análise da curva e em tempo real, específico para o alelo de PCR, permite de alto rendimento e de tubo de ensaio fechado para a detecção de mutações de ADN sem incómodo métodos de pós-PCR. Além disso, a amplificação em tempo real a monitorização do modelo melhorou significativamente a interpretação dos resultados de PCR [40]. Actualmente, ambos os métodos têm sido aplicados com sucesso para pesquisar diferentes mutações do gene em várias amostras de tumor. Por exemplo, as mutações KRAS em Bile [41], mutações EGFR em NSCLC [42], as mutações BRAF em CRC [35]. O DxS também fornece kit de biomarcadores validados para EGFR, RAF, BCR-ABL e outros genes que mostram uma correlação entre o estado de mutação do paciente e da resposta à droga [39].
Conclusão
Em CRC anti- tratamento de EGFR, os ensaios baseados em PCR com elevada sensibilidade e especificidade permitem exclusão efectivo de pacientes com KRAS mutantes, bem como reduzir os efeitos secundários da droga e aumentar a PFS e MOS nos pacientes KRAS do tipo selvagem. Simultaneamente, esses métodos permitem a identificação precisa dos pacientes KRAS mutante para que possamos realmente estreita o subgrupo de pacientes com mutações no KRAS e investigar as opções de tratamento mais eficazes para esses pacientes. Portanto, um teste padrão de referência precisa é urgentemente necessária para otimizar a terapia mCRC-alvo. Embora os métodos actuais baseados em PCR ter um desempenho muito melhor do que antes, a sua sensibilidade e especificidade pode não ser ainda melhorado devido à limitada resolução do sinal analógico e as moléculas de fundo inevitáveis. Esta limitação reduz consideravelmente o valor de certas amostras clínicas importantes, como fezes e sangue, onde DNA alvo representa apenas uma pequena fração do DNA total. Por exemplo, ADN derivado de tumores no sangue de patentes com tumores estágio inferior é 0,01-0,12% [43]. O método digital recentemente desenvolvido PCR (dPCR) possui o maior potencial para melhorar a precisão da detecção tanto em termos de sensibilidade e especificidade. Em dPCR, modelos em uma amostra são compartimentada em muitas reações individuais hora, cada um contendo, no máximo, um único modelo. Tal compartimentalização diminui eficazmente o ruído e aumenta a especificidade de amplificação de modelos de baixo nível [44], [45]. A sensibilidade reportada de dPCR atingiu 0,0005% [44]. Mais conveniente do que o PCR em tempo real, dPCR não requer o estabelecimento de curva padrão, e em termos de taxa de transferência de 96 poços versão dPCR foi desenvolvido [44], [45]. Este método promissor nos permitirá compreender substancialmente heterogeneidade do tumor e melhorar a terapia-alvo câncer [46], [47]. Em conclusão, este estudo fornece uma visão muito mais ampla para todo o campo da terapia do câncer.
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doi:. 10.1371 /journal.pone.0107926.s001
(DOC)