Abstract

Fundo

supressão Genomic em loci supressor de tumor é uma aberração genética comum em cancros humanos. O estudo teve como objetivo explorar genes supressores de tumor candidato no cromossomo 4q25-q28.2 e delinear novos biomarcadores de prognóstico associados com o cancro colorectal (CRC).

Métodos

mapeamento Deleção do cromossomo 4q25-q28 .2 foi realizado em 114 CRC esporádica pela perda de estudo heterozigosidade com 11 marcadores microssatélites. Um gene supressor de tumor candidato romance, nomeadamente

NDST4

, foi identificada em 4q26. a expressão do gene da

NDST4

foi investigada em 52 pares de tecidos primários CRC por reação em cadeia de polimerase reversa quantitativa. perda alélica do

gene NDST4

foi ainda determinado em 174 carcinomas colo-rectais pela perda de análise de heterozigosidade, e, em seguida, foi avaliada por relevância clínica.

Resultados

Uma região eliminação mínima foi de delineada entre D4S2297 e D4S2303 loci em 4q26, onde

NDST4

foi o único gene que marcadamente tinham sido reprimidos em tumores CRC. Por microdissecação de captura a laser,

NDST4

expressão de ARN foi demonstrada em células epiteliais do cólon, mas não foi detectada em células tumorais. No total, 30 (57,7%) de 52 carcinomas colo-rectais apresentaram uma redução dramática no

NDST4

expressão gênica comparada com mucosa normal, combinando. A perda genética de

NDST4

foi significativamente associada com o estágio patológico avançado (

P =

0,039) e mais pobre sobrevida global dos pacientes (

P =

0,036).

Conclusões

gene NDST4

é um novo gene supressor de tumor candidato no cancro humano, e a perda de sua função pode estar envolvido na progressão do CRC. Além disso, a perda de ensaio heterozigosidade, que foi criada para determinar a perda de alelos do gene

NDST4

, poderia ser uma ferramenta eficaz para a prestação de um biomarcador útil de prognóstico adverso no CRC.

Citação: Tzeng ST, Tsai MH, Chen CL, Lee JX, Jao TM, Yu SL, et al. (2013)

NDST4

é um candidato supressor de tumor novo gene no cromossomo 4q26 e sua perda genética prediz prognóstico adverso no cancro colorectal. PLoS ONE 8 (6): e67040. doi: 10.1371 /journal.pone.0067040

editor: Ludmila Prokunina-Olsson, do National Cancer Institute, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 24 Janeiro, 2013; Aceito: 13 de maio de 2013; Publicação: 25 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tzeng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência, Yuan Executivo (NSC99-2320-B-002-020-MY3), o Tien Hospital Cardinal (CTH-93-1-2A01), e do National Institutes Health Research (INDH-EX101 -10136BI), Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das causas mais comuns de morte por câncer em todo o mundo, ea maioria dos tumores surgem esporadicamente por uma combinação de mutações discretas e alterações cromossômicas [1] – [3]. Apesar operações agressivas suplementadas com várias terapias adjuvantes e uma maior compreensão dos mecanismos genéticos subjacentes a esta desordem, houve pouca melhoria na sobrevida de pacientes com CRC invasiva [4], [5]. Embora as características histopatológicas e estadiamento no momento da apresentação continuam a ser os indicadores de prognóstico mais importantes, muitos pacientes com características patológicas similares apresentam resultados clínicos consideravelmente diferentes [6]. Por conseguinte, a aplicação da análise genética sensível pode ser útil para a identificação de pacientes de alto risco e, em seguida, para estratificar o design de terapia adjuvante. Além disso, uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na tumorigénese colorrectal pode fornecer novos biomarcadores para os alvos potenciais de intervenção terapêutica e indicadores de prognóstico para a intervenção cirúrgica [7].

instabilidade cromossómica é a aberração genética mais comum em esporádica CRC [8], [9]. estudos substanciais revelaram que as perdas de alelos em várias regiões do cromossoma 4 está associada com a progressão da fase, metástase de tumor, e menor sobrevida em muitos cancros humanos, o que indica a presença de um ou mais gene supressor de tumor (TSG) loci [10] – [15 ]. No entanto, alguns ETG no cromossoma 4 envolvidos na patogénese CRC foram identificados. Nós recentemente realizado mapeamento eliminação do cromossomo 4 por perda de heterozigosidade estudo (LOH), e identificou o locus D4S402 em 4q27 que exibiu a maior frequência de alelos perda de 32,5% em 106 CRC esporádicos (os nossos dados não publicados). No presente estudo, buscamos explorar ETG CRC-associados na região adjacente de D4S402. Foram realizadas duas abordagens: (1) mapeamento de exclusão bem no cromossomo 4q25-q28.2 para delinear a região abrigar ETG, e (2) análise de alterações (expressão dos genes e de exclusão alélica) dos ETG candidatos em tumores CRC primários. Além disso, a perda genética do candidato TSG foi avaliada por relevância clínica.

Materiais e Métodos

Pacientes e Tissue espécimes

Um total de 174 pacientes com CCR esporádico, que passou por uma cirurgia no Cardeal Tien Hospital, Taiwan, foram recrutados entre agosto de 1997 e dezembro de 2008 (Tabela 1). Follow-ups foram conduzidos até abril de 2010. Todos os 174 pacientes foram operados para histologicamente verificada adenocarcinoma colorretal sem quimioterapia e /ou radioterapia pré-operatória. Ambos tumor emparelhados e amostras de mucosa normal adjacente foram coletadas de cada paciente durante a cirurgia. Além disso, os tecidos de pólipos adenomatosos foram coletados de 57 pacientes que foram submetidos a polipectomia colonoscopia. Todas as amostras de tecido foram imediatamente congeladas após a ressecção e armazenado em azoto líquido até à extracção de ácido nucleico. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito, eo estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Conselho de Cardeal Tien Hospital, Taiwan.

Análise LOH

Institutional Review o DNA foi extraído a partir de tecidos congelados usando o Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen). Para o mapeamento fino deleção do cromossoma 4q25-q28.2 (12,9 cm), com LOH estudo um painel de 11 microssatélites foi conduzido em 114 pares de ADN de tecido de CRC (Figura 1A e na Tabela 2). Para determinar a perda alélica do

NDST4

gene, estudo LOH com dois marcadores microssatélites, MS5850 (UniSTS: 536617) e D4S1580, foi realizado em 174 casos de CRC (Figura 1A e Tabela 2). Em cada par de iniciadores, o iniciador directo foi sintetizado com 6-FAM, VIC ou marcador fluorescente NED dependendo do tamanho do fragmento amplificado. A amplificação por PCR foi realizada em um volume final de 6 mL, utilizando 20 ng de ADN, 500 nM de cada um dos respectivos iniciadores, 200 uM de cada dNTP e 0,3 unidades de AmpliTaq Gold DNA polimerase (Applied Biosystems). A PCR foi conduzida sob as seguintes condições de ciclo: um passo de incubação pré-PCR a 95 ° C durante 15 min; seguido por 35 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 45 s, e 72 ° C durante 30 s; e uma extensão final de 72 ° C durante 10 min. Os fragmentos amplificados foram separados em géis de 6% de poliacrilamida desnaturante num ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), como descrito nas instruções do fabricante. pares de ADN normais e tumorais foram comparadas para as alterações no número de picos de alelos e a altura do pico de cada marcador usando software de análise GeneScan (Applied Biosystems). O índice de LOH de cada par de ADN normal e tumoral foi calculado como previamente descrito [16]. Resumidamente, a razão entre as alturas do pico do alelo calculados para cada amostra de tumor foi dividido pela razão da altura de pico do alelo normal de controlo correspondente. Um índice LOH de ≤0.67 ou ≥1.5, representando, pelo menos, uma diminuição de 33% de um alelo do tumor, era indicativo de perda de alelos.

A. marcadores microssatélites utilizados para perda de estudo heterozigosidade. Três genes estão localizados na região eliminação mínima delineada por D4S2297 e D4S2303. barras pretas indicam

UGT8 Comprar e

NDST4

genes.

miR-577

(

MIR577

) reside no intron de

UGT8

. B. Análise do

UGT8

e

NDST4

mRNAs em tumores (T) e mucosas combinado normal (N) dos tecidos CRC por RT-PCR.

β-actina

foi utilizado como um controlo interno de ARN. C. Análise do

expressão de miR-577

em tecidos CRC por qRT-PCR. Os níveis de expressão de tumores foram normalizados para os da mucosa normal correspondente. Os dados representam a média ± SD.

RNA Extração

O RNA total foi extraído a partir dos tecidos congelados e 10 linhas celulares de CRC (COLO205, HCC2998, HCT116, HCT15, HT29 , KM12 e SW620 do Instituto Nacional do cancro dos EUA; LoVo, SW48, SW480 e a partir da Colecção Bioresource e Research Center, Taiwan) usando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e a pureza do RNA foram determinadas com um espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific), e a integridade de ARN foi confirmada por electroforese em gel de agarose.

Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

Dez casos CRC selecionados aleatoriamente foram utilizados em um estudo piloto para a expressão do gene. O DNA complementar (cDNA) foi sujeitos a transcrição reversa a partir de ARN total (2 ug /20 uL de reacção) utilizando o High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems). A transcrição reversa foi conduzida sob as seguintes condições: 25 ° C durante 10 min, 37 ° C durante 2 h, a 85 ° C durante 5 min. O ADNc resultante foi diluída cinco vezes com dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com H

2O. específicos do gene conjuntos de iniciadores concebidos abrangendo os exões foram como se segue:

NDST4

directo 5′-TCTGGGAGTTACACCTCG-3 ‘e inverso 5′-TCTTGAGAGGCTTAGTTCTTG-3’;

UGT8

directo 5′-TTATATTATTCGTCACAATGG-3 ‘e inverso 5′-AAAACTAAGGTCTGACACAGT-3’;

β-actina

frente 5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3 ‘e reverso 5′-TCATCTTCTCGCGGTTGG -3’. A amplificação por PCR foi conduzida num volume final de 25 ul, utilizando 2,5 uL de ADNc diluída, 1 ^ M de cada um dos respectivos iniciadores, 250 uM de cada dNTP e 1 unidade de super-Therm ouro ADN polimerase (Empresa Bertec). A PCR foi realizada sob as seguintes condições de ciclo: um passo de incubação pré-PCR a 95 ° C durante 10 min; 36 (

NDST4

e

UGT8

) ou 28 (

β-actina

) ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 45 s, e 72 ° C durante 45 s; seguido por uma extensão final de 72 ° C durante 3 min. Os fragmentos amplificados foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose.

RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

Para a quantificação de

NDST4

expressão de ARN em 52 pares de CRC primária tecidos e 57 pólipos, um Expressão gênica TaqMan Assay (Hs00224024_m1, Applied Biosystems) foi usada com um gene de referência

TBP

(proteína de ligação caixa de TATA, Hs00920497_m1) como um controlo de qualidade RNA e quantidade. O ADNc foi sintetizado tal como mencionado na secção de RT-PCR. Os dados de PCR quantitativas foram capturados por um ABI Prism 7000 Sequence Detection System e analisadas por SDS ABI PRISM 7000 Software (Applied Biosystems). A mistura de reacção incluía 5 uL do ADNc diluída, 1 ul de uma mistura de sonda de hidrólise, 10 uL de TaqMan Mistura Universal Master (Applied Biosystems), com a adição de tratada com DEPC H

2O para um volume final de 20 uL . As reacções foram realizadas em duplicado com as seguintes condições de ciclo: um passo de incubação a 50 ° C durante 2 min; e um passo de activação da enzima a 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Os níveis de expressão

NDST4

em tumores, mucosas normais e pólipos foram normalizados para o gene de referência individual,

TBP

. A relação tumor-a-correspondência normal mucosa da

NDST4

expressão do RNA foi calculado usando o método Ct comparativa, 2

-ΔΔCt [17]. Os níveis de expressão relativa

NDST4

nas linhas celulares de CRC foram comparados com uma expressão média de 52 mucosa normal, o que foi ajustado para 1.

microRNA 577 Expression Analysis

para a quantificação da

microRNA 577

(

miR-577

) expressão em 10 pares de tecidos CRC primárias seleccionadas aleatoriamente, RNA pequeno foi extraído utilizando o kit de isolamento Mirvana ™ miRNA (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Os modelos de ADNc foram preparados a partir de ARN total utilizando o TaqMan microARN Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems), que utiliza iniciadores reversos de haste-laçada. Resumidamente, 10 ng de ARN total foi misturado com 0,8 mL de iniciadores de haste-laçada TA, 0,15 mL de dNTP 100 mM, 1,5 ul de tampão 10 × RT, 0,2 ul de inibidor de RNase (20 U /mL), e 1,0 MultiScribe uL de transcriptase (50 U /mL) inverter. A mistura (volume final, 15 mL) foi incubada a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, 85 ° C durante 5 min, e depois mantida a 4 ° C. Depois de RT, os produtos de ADNc, para além dos iniciadores TaqMan e as sondas, foram misturados com os outros reagentes da RCP no estojo de PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems), e qPCR foi realizado em triplicado, com o ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. As condições de PCR incluíram a incubação inicial a 50 ° C durante 2 min e desnaturação a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Os iniciadores utilizados para a

miR-577

(número 4.408.995) e

RNU6B

(RNA, U6 pequena nuclear 2, 4.373.381) foram adquiridos da Applied Biosystems. Como um controle endógeno,

RNU6B

foi amplificado em paralelo, e o valor de Ct de

miR-577

foi normalizado ao do

RNU6B

. Os níveis de expressão dos tumores foram comparadas com mucosas normais combinados, que foram ajustadas para 1.

Captura Laser Microdissecção

Para confirmar

NDST4

expressão de ARN em tipos específicos de células de CRC tecidos primários, carcinoma colo-rectal e células epiteliais da mucosa normal combinados foram recolhidas a partir de dois casos de CRC, bem como células linfóides associados a mucosas foram recolhidas a partir da terceira secção de tecido normal. As secções congeladas foram fixados e corados utilizando o HistoGene LCM congelado Seção coloração Kit (Arcturus Engineering). As células foram isoladas através da realização de laser de captura microdissection com AutoPix Automated Laser sistema de captura Microdissecção (Arcturus Engineering). Após a microdissecação, as células capturadas no tampão foram imediatamente incubados com um tampão de extracção, e o ARN total foi isolado utilizando o kit de isolamento de RNA PicoPure (Arcturus Engineering), de acordo com as instruções do fabricante.

Análise estatística

a associação entre a perda alélica do

NDST4

variáveis ​​de genes e correlação clínica foi analisada pelo Student

t

-test (por idade), linear-by-linear teste de associação qui-quadrado ( para o teste do qui-quadrado Dukes ‘estágios) ou Pearson (para outras variáveis ​​categóricas). A

valor P

de dois lados do 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. O tempo de sobrevida foi considerado o intervalo entre a cirurgia ea data do último follow-up ou de morte da doença (sobrevida global, OS), ou a data do último follow-up ou de reincidência (sobrevida livre de doença, DFS). As curvas de sobrevida, estimada pelo método de Kaplan-Meier, foram comparadas pelo teste de log-rank. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software IBM SPSS ®, versão 17.0.

Resultados

Gene NDST4 é um gene supressor de tumor candidato no cromossomo 4q26

Um total de 114 pares de CRC tecidos primários foram utilizados para determinar a região de eliminação mínima no cromossoma 4q25-q28.2 usando análise LOH. Cinquenta (43,9%) dos 114 tumores exibiram LOH em um ou mais marcadores microssatélites. Frequente LOH, definida como ocorrendo em mais de 30% dos tumores informativos, foi observado em quatro loci, incluindo D4S2297, D4S2303, D4S402, D4S2394 e. Por conseguinte, uma região mínima eliminação genética com um comprimento de 1,4 Mb foi então delineada entre D4S2297 e D4S2303, que foi envolvido em 80,0% (40/50) dos tumores com LOH. Os resultados demonstram uma elevada frequência de cromossomo 4q26 perda de carcinomas colo-rectal, e divulgar um locus TSG putativo envolvido no desenvolvimento de CRC.

Ao pesquisar no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) do banco de dados, apenas dois codificadores de proteínas genes,

UGT8

e

NDST4

, bem como um microRNA,

miR-577

, mostraram-se localizada na região eliminação mínima definida. A expressão de

UGT8

,

NDST4

, e

miR-577

foi exibido em 10 pares de tecidos CRC primárias seleccionadas aleatoriamente por RT-PCR ou qRT-PCR (Figura 1B e 1C). Os níveis de expressão

UGT8

e

miR-577

nos tumores testados foram compatíveis com a sua mucosa normal adjacente. Os resultados mostraram que

NDST4

expressão do gene foi evidentemente diminuída em seis dos 10 tumores. Os resultados sugerem que

NDST4

pode ser um romance TSG localizado na região 4q26, que é frequentemente excluído no CRC.

Gene NDST4 é expressa em normal cólon mucosa e pólipos, mas é regulada negativamente em Colorectal carcinomas

carcinoma colorretal origina de mucosa do cólon através da acumulação de alterações genéticas. Como um candidato do TSG CRC-associado,

NDST4

deve ser expresso no epitélio do cólon. Portanto, microdissecação de captura a laser foi realizada para isolar diferentes tipos de células em secções de tecido, incluindo o epitélio e células linfóides de mucosas normais, assim como as células de tumores de CDC, e, em seguida,

NDST4

expressão foi determinada por qRT -PCR (Figura 2). Os resultados mostraram que

NDST4

ARNm foi detectada nas células epiteliais a partir de ambos os casos de mucosas normais, mas não nas células do tumor emparelhados nem nas células linfóides, mesmo depois de 45 ciclos de amplificação por PCR. Para determinar a regulação negativa da

expressão NDST4

no CRC, foram analisados ​​mais 52 pares de tecidos primários. De acordo com a hipótese de Knudson dois atingida, uma cópia funcional de um TSG podem contribuir para a expressão do gene parcial [18]. Portanto, uma diminuição de 0,25 vezes foi definido como o limiar de regulação negativa significativa. No total, 30 tumores (57,7%) mostrou uma diminuição evidente no

NDST4

expressão, em comparação com a sua mucosa normal, combinado (Figura 3A). Além disso,

NDST4

expressão do gene também foi determinado em 57 pólipos adenomatosos. Ao contrário de tumores CRC, em que

NDST4

expressão foi diminuída substancialmente, os adenomas mostrou um nível semelhante de expressão como mucosa normal (Figura 3B). Além disso, todas as 10 linhas celulares de CRC estudados expressaram níveis extremamente baixos ou indetectáveis ​​de

NDST4

ARNm (Figura 3C). A redução drástica da

expressão NDST4

no CRC sustenta que

NDST4

é um romance candidato TSG, e que a perda de sua função pode desempenhar um papel na tumorigénese colorectal.

UMA. microdissecção de captura a laser de diferentes tipos de células de tumor CRC e seções mucosa normal combinados. Imagens representativas de lâminas HistoGene coradas antes e após microdissecção de captura a laser são mostrados. B. e C. qRT-PCR análise do

NDST4

e

TBP

expressão nas células capturadas.

TBP

foi usado como um controle RNA interno. Rn, sinal repórter normalizado.

A. Comparação de

expressão NDST4

entre tumor e combinados mucosa normal em 52 pares de tecidos CRC por qRT-PCR. A expressão relativa (Tumor /Normal), em cada caso é indicada por uma coluna. B. regulação negativa do

expressão NDST4

em tumores de CRC, mas não em pólipos adenomatosos. O

NDST4

expressão relativa a um controlo interno,

TBP

, é ilustrada através da análise caixa de enredo. Os bigodes denotam o intervalo entre o 5

th e 95

th percentis. Uma diferença significativa entre os grupos foi testada pela

t

-teste de Student (pareado, tumor

vs

mucosa;. Unpaired, mucosa

vs

pólipo.). N.S., não significativa. C. regulação negativa do

expressão NDST4

em todas as 10 linhas celulares de CRC humanos testados. Os níveis de expressão relativos de células de CRC foram comparados com a média de 52 expressão mucosas de cólon normais. Os dados representam a média ± SD.

Allelic Perda de Gene NDST4 é significativamente associada com o Advanced Patológica Stage and Poor Sobrevivência no CRC

Para determinar precisamente a eliminação genética de

NDST4

no CRC, o WebSat, software web para o desenvolvimento marcador microssatélite, foi utilizado para identificar repetições curtas em tandem dentro

NDST4

gene [19]. Um novo marcador, MS5850, que foi projetado neste estudo, e D4S1580 foram utilizados para análise LOH em 174 pares de tecidos CRC primários (Figura 1A). As correlações entre a alteração genética e características clinicopatológicas estão listados na Tabela 1. No total, 53 (30,5%) dos 174 tumores foram positivos para a perda alélica do gene da

NDST4

. A aberração genética foi aumentado consideravelmente nos tumores com estádios patológicos mais elevados (T3 e T4) (

P =

0,039). Além disso, embora não estatisticamente significativa, uma tendência de aumento foi observado na progressão de metástases à distância e estágio Dukes ‘(

P =

0,075 e 0,083, respectivamente). No entanto, a perda genética não foi associada a outras características clínico-patológicas.

A correlação de perda alélica do

gene NDST4

à sobrevida do paciente foi novamente avaliado. análise de sistema operacional foi realizada em 174 pacientes, dos quais a taxa OS foi de 67,8% (n = 118), com uma sobrevida média de 94 meses. Através da aplicação de Kaplan-Meier análise da curva de sobrevivência, a perda alélica de

gene NDST4

previsto um sistema operacional pior (

P

= 0,036) (Figura 4). Cinquenta e três pacientes com esta aberração genética tinha um sistema operacional de 60,4% e uma sobrevivência média de 74 meses, enquanto os outros 121 pacientes tinham um sistema operacional de 71,1% e uma sobrevivência de 100 meses significa. Além disso, a análise DFS foi realizada em 118 pacientes com Dukes fases B e C, dos quais a taxa de DFS foi de 73,7% (n = 87) com um DFS médio de 104 meses. No entanto, a característica genética não foi identificada como um preditor significativo de DFS para o grupo de pacientes com Dukes ‘estágios B e C.

A análise de Kaplan-Meier foi realizado para comparar pacientes com perda alélica do

NDST4

gene para os outros (sem perda de alelos). perda genética de

NDST4

mostra associação significativa com pior sobrevida (teste log-rank).

Discussão

No presente estudo, identificamos

NDST4

gene como um candidato a novel TSG cromossoma 4q26, que é uma região comum na supressão CRC. Em contraste com a mucosa de cólon normal com o

expressão NDST4

, a maioria dos tumores de CRC e linhas de células mostraram uma redução drástica na expressão do gene. Além disso, desenvolvemos um ensaio LOH com dois marcadores microssatélites, e revelou que a perda genética de

NDST4

foi significativamente associada com o estágio patológico avançado e sobrevivência pobres, apoiando a função supressora de tumores de NDST4 no CRC.

Apesar de certas vias moleculares subjacentes à tumorigênese colorretal elucidado, alterações genéticas diferentes podem resultar em um fenótipo específico que está correlacionada com vários comportamentos tumorais e os resultados dos pacientes [20]. Portanto, a identificação de novos marcadores moleculares é necessária para melhorar as estratégias de terapias específicas e de gestão adaptada ao paciente. No estudo, foram elucidadas uma região eliminação mínima de 1,4 Mb no cromossomo 4q26 em CRC esporádica, de acordo com o relatório anterior que a freqüência de exclusão alélica em 4q26 foi aumentada em carcinomas colo-rectais comparação com adenomas [11]. Apesar de numerosos estudos anteriores sugeriram candidato TSG loci no cromossomo 4 [14], [15], aqui identificado, pela primeira vez,

NDST4

gene como um romance TSG candidato em 4q26. Além disso, porque LOH em loci polimórficos permite a expressividade de eliminação de perda de função em ETG, este estudo genético tem relevância potencial diagnóstico e prognóstico [21]. O ensaio LOH estabelecida no estudo poderia ser uma ferramenta eficaz para a prestação de um biomarcador útil de prognóstico adverso no CRC.

NDST4 é um membro da N-deacetilase /N-sulfotransferase (glucosaminilo heparan) (NDST ) familiar, que é responsável para o sulfato de heparano (HS) a biossíntese de uma proteína do núcleo para formar os proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs) [22], [23]. HSPGs ubiquamente residem na superfície da célula, no interior da célula, e na matriz extracelular [24]. As cadeias de SH HSPGs interagir com uma vasta gama de ligandos proteicos, tais como as famílias de factores de crescimento, e assim, contribuem para a estrutura e função dos tecidos durante o desenvolvimento e homeostase do adulto [25], [26]. Mais importante, o conteúdo e distribuição de HSPGs são alteradas durante a tumorigénese, que têm sido implicados em aspectos positivos ou negativos de progressão tumoral. Por exemplo, a função HSPGs como co-receptores para factores de crescimento e seus receptores tirosina-quinase para estabilizar os complexos de sinalização durante a proliferação e invasão tumoral [27]. Em contraste, HSPGs promover célula-célula e as interacções célula-matriz extracelular e construir barreiras inibidoras para a invasão tumoral. Por conseguinte, a diminuição dos níveis de HSPGs correlacionar com a progressão tumoral [28], [29]. No presente estudo, a perda genética de

NDST4

foi significativamente associada com o estágio patológico avançado, que se refere à profundidade tumor local da invasão no CRC, sugerindo que a perda da função de

NDST4

gene pode prejudicar a modificação de cadeias de SH HSPGs específicos, conduzindo a células de tumor mais invasivos através de uma remodelação da interacção de receptores de adesão celular e ligandos.

Quatro isoformas diferentes de NDSTs são identificados em vertebrados. Ao contrário da expressão do gene universal da

NDST1

e

NDST2

,

NDST3

e

NDST4

transcrições são predominantemente expresso durante o desenvolvimento embrionário [30], [31 ]. No entanto, os padrões de expressão de

NDSTs

nunca foram ilustrados no cólon humano. Usando RT-PCR, descobrimos que as transcrições de quatro

NDSTs

eram facilmente detectável na mucosa do cólon normal, enquanto que apenas

NDST4

expressão foi regulada negativamente na maioria dos tumores CRC testadas (dados não mostrados ). De acordo com a estrutura prevista do domínio sulfotransferase de NDSTs, as quatro isoformas diferentes podem exibir diferentes especificidades de substrato [30]. Sheng

et ai.

Recentemente demonstrado que a modificação NDST1 realizada de uma forma altamente ordenada para controlar os domínios N-sulfatação em SH, sugerindo que iniciou e seguido de N-sulfatação pode ser realizada utilizando NDSTs diferentes [32]. Com a relativamente fraca actividade de desacetilação de NDST4 em cadeias SH não modificados, NDST4 pode preferir aqueles com uma modificação inicial por outras isoformas [30]. Além disso, NDSTs desempenhar um papel fundamental na biossíntese SH porque NDSTs são os primeiros participantes no processo de modificação sequencial [33]. Curiosamente, porque NDST4 é a única isoforma que tinha sido marcadamente reprimidos nos tumores CRC testadas (os nossos dados não publicados), os outros três isoformas NDST não parecem compensar a deficiência de NDST4 em uma condição específica do cólon. As cadeias do SH de HSPGs na mucosa do cólon pode ter padrões de modificação únicas mediado, pelo menos em parte, pela actividade NDST4. HSPGs alterada, que resulta da perda da função de NDST4 pode variar arranjo de células e tecidos, e, em seguida, promover CRC patogénese. No entanto, alterações na expressão de enzimas biossintéticas SH pode ser relativamente diferente de um modo específico do cancro do tipo-[34]. Fernandez-Vega

et al.

Relatado bastante recentemente que

NDST4

transcrição aumentada em 50% dos 23 infiltrando adenocarcinomas ductal estudado, quando ele estava ausente em tecidos mamários normais [35]. Tomados em conjunto, mais estudos são necessários para obter insights sobre o papel da NDST4 no desenvolvimento tumoral e progressão de cancros humanos.

Em conclusão, ao delinear uma região eliminação mínima no cromossomo 4q26, este estudo é o primeiro a identificar

NDST4

gene como um candidato romance TSG no CRC. Além disso, a perda genética de

NDST4

pode servir como um biomarcador de prognóstico adverso para pacientes com CRC. O ensaio LOH projetado para determinar a perda alélica do

gene NDST4

no estudo pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico molecular para a estratificação de risco em intervenções terapêuticas individuais.