Abstract

Fundo

Um problema fundamental no câncer pesquisa é identificar o tipo de célula que é capaz de sustentar o crescimento neoplásico e a sua origem a partir de células de tecido normal. Investigações recentes de uma variedade de tipos de tumores tenham mostrado que subfracções fenotipicamente identificáveis ​​e isoláveis ​​de células possuem a capacidade de formação de tumor. No presente trabalho, utilizando duas linhas de células de melanoma humano relacionadas com a linhagem, linha de melanoma primário IGR39 e sua linha derivado metastático IGR37, duas observações principais são relatados. O primeiro é a primeira evidência fenotípica para apoiar a origem das células estaminais cancro melanoma (CSCs) a partir de células estaminais de tecidos específicos mutados; ea segunda é a identificação de uma subpopulação mais agressiva de CSCs no melanoma que são CXCR6 +.

Métodos /Apreciação

Foi definido CXCR6 como um novo biomarcador para auto assimétrico com células-tronco específicas do tecido -renovação. Assim, a relação entre a formação de melanoma e ABCG2 e expressão CXCR6 foi investigada. Consistente com o seu carácter não-metastático, as células IGR39 indiferenciados formado tumores significativamente menores do que as células IGR37 indiferenciados. Além disso, as células ABCG2 + produziu tumores que tinha uma massa de 2 vezes maior do que os tumores produzidos por células não triados ou células ABCG2-. células CXCR6 + produziu tumores mais agressivos. CXCR6 identifica uma subpopulação mais discreta de células de melanoma humano em cultura com um fenótipo MCSC mais agressivas do que as células seleccionadas na base do ABCG2 + fenótipo sozinho.

Conclusões /Significado

A associação de uma forma mais agressiva fenótipo tumoral com assimétrica fenótipo auto-renovação revela um aspecto até então desconhecida da fisiologia da célula tumoral. Ou seja, a retenção de alguns atributos de células-tronco de tecidos específicos, como a capacidade de se auto-renovar assimetricamente, os impactos da história natural do desenvolvimento do tumor humano. O conhecimento desse novo aspecto do desenvolvimento e progressão tumoral pode fornecer novos alvos para a prevenção e tratamento do câncer

Citation:. Taghizadeh R, Noh M, Huh YH, Ciusani E, Sigalotti L, Maio M, et al. (2010) CXCR6, um biomarcador recém-definido de Tissue-Specific Stem Cell assimétrica auto-renovação, Identifica mais agressiva do cancro da melanoma humano Stem Cells. PLoS ONE 5 (12): e15183. doi: 10.1371 /journal.pone.0015183

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 05 de agosto de 2010; Aceito: 28 de outubro de 2010; Publicação: 22 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Taghizadeh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas Institues Nacionais de Saúde do Director Pioneer Award # 5DP1OD000805 e por COFIN Nacional concessão italiana 2008. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a quimioterapia do cancro eficácia é prejudicada frequentemente pela resistência tanto intrínseco ou a resistência adquirida tumor, um fenômeno denominado multi-droga (MDR) [1]. MDR pode resultar de vários mecanismos distintos, incluindo a redução da acumulação do fármaco em células tumorais [1]. O mecanismo que é mais frequentemente encontrado no laboratório é o aumento do efluxo de uma ampla classe de fármacos citotóxicos hidrofóbicos, que é mediada por uma de uma família de transportadores dependentes de energia (família ABC) [2]. Embora vários membros da superfamília têm dedicado funções específicas que envolvem o transporte de substratos específicos, está se tornando cada vez mais evidente que a rede fisiológico complexo de transportadores ABC tem um papel fundamental na desintoxicação de acolhimento e proteção do corpo contra xenobióticos. Entre superfamília ABC humana, única ABCB1, ABCC1 (MDR1) e ABCG2 têm até à data sido mostrado para mediar MDR, cada uma com especificidades de substrato de efluxo sobrepostas distintas e padrões de distribuição nos tecidos [3]. Cumprindo o seu papel na desintoxicação, vários transportadores ABC foram encontrados para ser sobre-expresso em linhas celulares de cancro cultivadas sob pressão seletiva. Em particular, ABCB5 é sobre-expresso no melanoma, e ABCG2 é expressa por uma subcelulares células de melanoma CD133-positivos [4], [5].

Neste relatório, nós investigamos um novo candidato para uma célula-tronco do câncer melanoma (MCSC) marcador, o co-receptor de citocina CXCR6, no que diz respeito às propriedades de MCSCs-expressando ABCG2. Uma questão não resolvida importante no campo da pesquisa com células-tronco cancerosas (CSC) é se existe uma relação directa entre a linhagem CSCs e células-tronco de tecidos específicos (TSSCs) encontrados nos tecidos normais a partir do qual surgem cancros. Vale a pena identificar marcadores que distinguem entre tumorigénico de células não tumorigénicas [6]. CD133 é expressa pela maior parte das linhas celulares de melanoma [4], e não parece ser capaz de distinguir tumorigénico de células não -tumorigenic [6]. Além disso, recentemente, o grupo de Weissman confirmou a presença de uma subpopulação mais agressivo CD217 + no melanoma humano [8]. Propusemo-nos a lançar luz experimental sobre esta questão, investigando CSCs melanoma descritos anteriormente associados com linhas de células de melanoma estabelecidas [4], [6] para a evidência de assimétrica auto-renovação, uma propriedade específica de TSSCs [7], [9]. Para esta avaliação, foi empregado um novo biomarcador que mostramos aqui para ser associado com auto-renovação assimétrica, o receptor de quimiocina CXCR6. Em estudos anteriores, CXCR6 foi identificado como um co-receptor para a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana de linfócitos [10]. Baixos níveis de expressão CXCR6 também foram detectados especificamente na memória /efectoras Th1 em células de sangue periférico [11]. Mais recentemente, a expressão de CXCR6 foi associado com os tumores humanos, incluindo o melanoma [12] – [14]. Aqui, nós mostramos, com base em estudos com linhas de células de camundongo geneticamente modificado se submeter assimétrica auto-renovação como TSSCs, que tanto o padrão e nível de expressão CXCR6 é especificamente relacionado com a divisão de auto-renovação assimétrica.

Olhamos para co-associação de expressão CXCR6 e expressão ABCG2 com a atividade MCSC e provas para a descida dos CSCs melanoma de TSSCs. Na verdade, descobrimos que uma grande porcentagem de células de melanoma ABCG2 positivo com propriedades CSC conhecidos, também expressam CXCR6. Além disso, como as células de melanoma que expressam ABCG2, as células que expressam CXCR6-se uma pequena fracção de células em culturas de linhas celulares, melanoma metastático e espécimes de biópsias de melanoma humano.

In vivo

células CXCR6 + melanoma produziu um tumor em menos tempo do que as células ABCG2 + e, mais interessante, a subpopulação negativa não dar um tumor. Esta co-associação fenotípica de CXCR6, um biomarcador para assimétrica auto-renovação em células não-cancerosas, com actividade de CSC em células derivadas de tumor é evidência de uma relação de linha recta entre TSSCs e CSCs no caso de células melanocíticas e melanoma, respectivamente .

Finalmente, têm caracterizado a ABCG2 subpopulação + /ABCG2- e CXCR6 + /CXCR6- de melanoma para a expressão de melanoma associado antígenos (MAA), tendo em vista uma possível abordagem imunoterapêutico contra subpopulações mais agressivo expressando ABCG2 e /ou CXCR6.

resultados

Identificação de CXCR6 como um biomarcador para assimétrica auto-renovação divisão

estudos Anteriormente, temos relatados com um modelo de célula de cultura geneticamente modificada que fornece experimentalmente controladas divisões assimétricas auto-renovação semelhantes aos do TSSCs [15], [16], [17]. As células contêm um gene de ADNc de p53 de tipo selvagem de Zn-regulado. Em meio de Zn-livre, estas células se dividem com cinética celular simétricas, produzindo duas células do ciclismo de cada divisão. Estas divisões divisões modelo simétrica TSSC em que duas células-tronco são produzidos. Em ZnCl

2 suplementado com meio de cultura, consequentes níveis normais de expressão da p53 induz divisões auto-renovação assimétricas que são caracterizadas por divisões que produzem uma irmã ciclismo e uma irmã que as prisões no G1 /S. . Estes assimétricas divisões TSSC divisões modelo que produzem uma célula-tronco e uma célula que quer diferencia ou serve como o progenitor de uma linhagem de células de diferenciação

Em gene micro-array análises (base de dados NCBI-GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dlmlzmuowumsqxy acc=GSE25334),

Cxcr6

foi identificado como um gene cuja expressão era indetectável no simetricamente congênica auto-renovação células de controlo p53 cultivadas em ZnCl

meio 2 suplementado. No entanto, foi induzida em células p53 induzível submetidos a auto-renovação assimétrica sob as mesmas condições de cultura. A análise quantitativa RT-PCR revelaram que as células simetricamente auto-renovação fez express

Cxcr6

mRNA em um nível detectável; mas a sua expressão aumentada de 8,6 ± 4,4 vezes (n = 6 analisa; p = 0,002). em células induzidas para deslocar a assimétrica auto-renovação

O micro-matriz inicial análises mostraram também que a auto-renovação assimétrica era obrigatória para o aumento da

Cxcr6

expressão; e, assim, indicam que o aumento da expressão não foi devido a expressão de p53 sozinha.

Cxcr6

expressão também foi indetectável em células p53-inducible cong�icas geneticamente modificadas com expressão forçada do tipo II inosina monofosfato gene desidrogenase (IMPDH II), mesmo quando foi induzida a expressão da p53. Expressão de IMPDH II, a enzima limitante da velocidade para guanina ribonucleótido biossíntese celular, induzida por p53 impede assimétrica auto-renovação, deixando a regulação de genes dependente de p53 intactas [16], [18], [19]. Por esse critério,

Cxcr6

foi definida como uma “auto-renovação assimétrica associados (ASRA)” específica do gene.

Para investigar as propriedades ASRA biomarcador de proteína CXCR6, examinamos o seu padrão de expressão determinada pela detecção indireta

in situ

imunofluorescência (ISIF) em dois ensaios padrão de auto-renovação de uma única célula relacionados. No primeiro, o ensaio irmã par (SP; [19]), as células são plaqueadas a uma densidade suficientemente baixa para permitir o delineamento de células irmãs, pela sua proximidade relativamente próxima da divisão. Na segunda, as células são analisadas após a divisão na presença de citocalasina D (CD; [20]). CD impede citocinese, mas não impede a divisão nuclear. As células binucleadas assim produzidos fornecer uma comparação mais confiante de núcleos irmã

Em aplicações anteriores da SP (anteriormente chamado. “Par filha”; [19] e ensaios de CD, Bromodeoxiuridina (BrdU) incorporação foi usado como um marcador para a células em fase de ciclismo S. para os presentes estudos, foi utilizado o ciclo celular específico de fase ciclina proteína a como um indicador de células em divisão. ciclina a é um marcador bem descrito de células em divisão, que aumenta progressivamente em nível da fase G1 tardia a fase G2 do ciclo celular [21]. as micrografias de epifluorescência na Fig. 1 mostram como ISIF indirecta pode ser empregue em ensaios de SP e de CD para distinguir células assimetricamente auto-renovação (ASYM) a partir de outras simetricamente renovação (MJS). Sob condições que promovam simétrica auto-renovação, pares de células irmã e células binucleadas prendeu-CD mostram uma elevada frequência de ciclina simétrica a detecção. Em contraste, sob condições que promovam assimétrica auto-renovação, um padrão assimétrico da ciclina a expressão é significativamente mais frequente.

são mostrados exemplos de epifluorescência e micrografias de contraste de fase a partir de SP e paralelo análises de CD, tal como descrito no texto. SYM, simétrica auto-renovação (linhas celulares cong�icas p53 modificadas cultivadas no ZnCl

meio 2 suplementado). ASYM, assimétrica auto-renovação (células Zn-dependente, p53 induzíveis engenharia cultivadas em ZnCl médio

2 suplementado). ADN, DAPI fluorescência do ADN nuclear. CiA, ISIF indirecta com anticorpos específicos para a ciclina A. CXCR6, ISIF indirecta com anticorpos específicos para CXCR6. Note-se que no estado ASYM, CXCR6 é regulado para cima na célula de ciclismo, que modela TSSCs assimetricamente auto-renovação. Fase, micrografia de contraste de fase. Barra de escala = 50 microns.

Como mostrado na Fig. 1, proteína CXCR6 é detectada no citoplasma e núcleo das células geneticamente modificadas utilizadas para identificar CXCR6 como um biomarcador ASRA. O nível de expressão nuclear é maior em células em condições de auto-renovação assimétrica, consistente com os dados de expressão do mRNA, o que foi descrito anteriormente. Em ambas as análises de CD e SP, sob condições de auto-renovação simétrica, proteína CXCR6 é detectado em ambos os núcleos de células irmãs. Em contraste, sob condições que promovam assimétrica auto-renovação, as células mostram uma maior frequência do padrão de expressão assimétrica que também está diretamente correlacionado com o padrão assimétrico da ciclina A. No CD análises quantitativas, em condições para simétrica auto-renovação, apenas 6 % de células binucleadas mostrou expressão de coordenadas assimétrica de ciclina A e CXCR6; enquanto 27% apresentaram este padrão específico em condições de auto-renovação assimétrica (p = 0,001). Estes resultados identificam CXCR6 como primeiro-descrito-regulada biomarcador de células em assimétrica auto-renovação como TSSCs.

ABCG2 e melanoma formação

Em um artigo recente, o nosso grupo publicou que ABCG2 é expressa por uma subpopulação de células de melanoma humano (linha celular WM115) expressando elevado nível de CD133 [4]. Nós alargado desta análise de ABCG2 para duas linhas celulares de melanoma adicionais derivadas a partir do mesmo paciente de melanoma:. A linha celular de melanoma primário IGR39 e metastático da linha relacionada IGR37

Primeiro, como mostrado na Tabela 1, foram analisados ​​três polimorfismos C /a (421 C a), C /T (S248T) e C /T (F208S) nas populações não triados e na ABCG2 + e ABCG2- classificados subpopulações revelando um estado heterozigótico de ABCG2 para todos os três polimorfismos. Estes resultados são consistentes com a origem das linhas celulares a partir do mesmo paciente. Nós incidir sobre estes polimorfismos SNP desde 421C A é a mais comum entre diferentes grupos étnicos [22], e tem sido associada com a diminuição da expressão da proteína ABCG2 [23]. Além disso, os polimorfismos F208S e S248P foram associados com o transporte ativo com defeito de metotrexato e hematoporfirina [24]; e, em particular, proteínas variantes F208S (ambas as formas glicosiladas e imaturas) são reconhecidos como proteínas deformadas por sistemas de supostos “pontos de controlo” e prontamente submeter ubiquination e degradação de proteínas em proteasomas [25].

respectivamente, -11% e -40% de células em culturas de crescimento activo de IGR37 e IGR39 tinha expressão detectável para ABCG2 (Fig. 2). IGR37 e IGR39 células foram classificados em ABCG2 + e subpopulações ABCG2- e transplantadas em ratinhos NOD-SCID (n = 3 para cada sub-população avaliada). células não separados também foram injectadas em ratinhos NOD-SCID (n = 3) para comparação. Após dois meses, os ratos de todos os grupos foram sacrificados. As massas tumorais foram excisadas, fotografada, pesados, e digeriu-se isolar suspensões de células individuais para posterior análise. Como mostrado na Tabela 2 e na Fig. 3, o transplante de células ABCG2 + IGR37 resultou em tumores com 2 vezes maior de massa, em média, em comparação com tumores que surgiram a partir de células ABCG2- (p 0,01). Curiosamente, a injecção de células não triados IGR37 também resultar em tumores menores do que ABCG2 + células que foram estatisticamente semelhantes em tamanhos de tumores a partir de células ABCG2- (figura 3;. Tabela 2). IGR39 células não separados resultou em massas tumorais pequenas, em comparação com células não triados IGR37 (0,13 gramas vs. 1,4 gramas, respectivamente; p 0,01) 2 meses após a injecção das células (Tabela 1). ABCG2- classificados IGR39 células não exibiram quaisquer massas macroscópicas neste ponto de tempo (Tabela 2), enquanto ABCG2 + células IGR39 produzidos tumores com um 3,6 vezes maior de massa comparativamente com as células IGR39 não triados (Tabela 2; p 0,01).

melanoma primário IGR39 células e células metastáticas de melanoma IGR37 foram incubadas com os anticorpos conjugados com FITC fluorescentes indicados e analisadas por citometria de fluxo como descrito em

Materiais e Métodos

. Y-eixos, dispersão lateral; x-eixos, intensidade de fluorescência relativa. painéis esquerdos, análises com anticorpos de controlo de isotipo (IgG); painéis médio, análises com anticorpos anti-ABCG2 conjugados com FITC. Após o isolamento FACS com base no portão indicado (contorno azul), células classificadas ABCG2 + foram reanalisados ​​para confirmar enriquecimento (painéis da direita). Números, por cento do total avaliado células.

5 × 10

5 indiferenciados, ABCG2 + ou ABCG2- células classificadas foram injectados por via subcutânea em cinco semanas de idade NOD-SCID ratos (3 ratos para cada condição experimental). Após 60 dias, a massa de tumor foi excisado e pesado fotografado.

suspensões de células individuais foram obtidos a partir de todos os xenoenxertos de tumor e analisadas após 1-2 passagem por meio de citometria de fluxo para detectar ABCG2- expressando células. Consistente com as observações anteriores com WM115 células de melanoma e de biópsias de melanoma humano [4], ABCG2 expressão não foi detectada em todas as preparações de células de tumor de xenoenxerto (dados não mostrados).

CXCR6 e melanoma formação

IGR37 e IGR39 populações de células exibiram 10,6% e 9,6% frequências de expressão para CXCR6, respectivamente (Fig. 4). CXCR6 + e subpopulações de CXCR6- IGR37 e IGR39 células foram classificados e injectadas em ratos NOD-SCID (n = 3 ratos por grupo), tal como foi feito para as células escolhidas com base na expressão ABCG2. Surpreendentemente, como mostrado na Fig. 5 e na Tabela 2, após apenas 21 dias a partir da injecção de células + CXCR6 IGR37, tumores significativas que apareceu foram, em média 1,8 vezes maior em massa do que os tumores que surgiram a partir de células não triados IGR37 (p 0,01). Além disso, não há tumores foram detectados a partir de células CXCR6- (Tabela 2 e Figura 6) injectado, mesmo depois de 2 meses. Além disso, as células CXCR6- não mostraram qualquer massa, mesmo após 4 meses. Resultados semelhantes foram obtidos para IGR39 células. células CXCR6 + produziu tumores com 2,5 vezes maior massa em comparação com células não triados; e nenhuma massa foi detectada para as células CXCR6- (Tabela 2). Quanto ABCG2, células + CXCR6 também foram indetectáveis ​​em xenoenxertos tumorais por citometria de fluxo (dados não apresentados).

analisa único marcador CXCR6. Melanoma primário IGR39 e células de melanoma metastático de células IGR37 foram incubadas com os anticorpos conjugados com APC fluorescentes indicados e analisadas por citometria de fluxo como descrito em

Materiais e Métodos

. Y-eixos, dispersão lateral; x-eixos, intensidade de fluorescência relativa. painéis esquerdos, análises com anticorpos de controlo de isotipo (IgG); painéis de média, análises com anticorpos anti-CXCR6 APC-conjugados. Após o isolamento FACS com base no portão indicado (contorno azul), CXCR6 + classificadas células foram novamente analisadas para confirmar enriquecimento (painéis da direita).

5 × 10 subcutaneamente

5 CXCR6 + células classificadas foram injetados em cada cinco ratinhos NOD-SCID -week de idade (3 ratos para cada condição experimental). Após 21 dias, a massa do tumor foi extirpado pesados ​​e fotografado.

5 × 10

5 CXCR6- células classificadas foram injectados por via subcutânea em ratos NOD-SCID de cinco semanas de idade (3 ratos para cada condição experimental). células CXCR6- não deu tumores.

Por fim, analisamos a percentagem de CXCR6 + /células double-positivos ABCG2 + para ambas as linhas celulares. Como mostrado na Fig. 7, 6,7% e 3,1% do IGR37 e IGR39 células, respectivamente, foram duplamente positivo para ABCG2 e CXCR6. Quando se injectou células duplamente positivas IGR39 ABCG2 + /CXCR6 + em ratinhos NOD-SCID, tumores surgiram que tinham, em média, 4 vezes maior de massa em comparação com os tumores desenvolvidos a partir de células não triados (p 0,01; Quadro 2). Como IGR39 células classificadas com base apenas na expressão CXCR6, tumores de IGR39 ABCG2 + /CXCR6 + células exigida apenas 21 dias para a detecção de tumores (Tabela 2).

analisa marcador duplo para CXCR6 e ABCG2. Melanoma primário IGR39 e células de melanoma metastático de células IGR37 foram incubadas com os anticorpos conjugados com APC fluorescentes indicados e analisadas por citometria de fluxo como descrito em

Materiais e Métodos

. painéis esquerdos, intensidade de fluorescência análises bivariadas com anticorpos de controlo de isotipo conjugado com FITC (IgG) respectiva APC- e; painéis de média, intensidade de fluorescência análises bivariadas com a respectiva APC- e conjugado com FITC específico CXCR6 e anticorpos específicos para ABCG2. Números, por cento das células avaliadas no total.

Melanoma fenótipo de xenoenxertos tumorais

A análise imuno-histoquímica multiparamétrico de ABCG2 + IGR37 células xenotransplantes (Tabela 3 e Figura 8) revelou que o tumor proveniente estas células exibido uma expressão homogénea dos antigénios de diferenciação HBM45, HMW-MAA, e o receptor de endotelina B, e uma expressão heterogénea do Melan-a antigénio. Nenhuma coloração específica para o péptido de ET-1 poderia ser documentado. Todas as células de antigénios associados a progressão avaliadas foram expressos de forma homogénea. A tenascina macromolécula matriz extracelular foi detectado no enxerto do tumor como uma extensa rede de ninhos de células intersticiais aprisionamento de tamanho variável. Entre os antigénios fetais analisadas, não há níveis detectáveis ​​de NY-ESO foram encontrados enquanto foi observada uma fraca expressão de antigénios MAGE. Resultados semelhantes foram obtidos para células ABCG2 IGR39 + (dados não mostrados).

A população de células de tumor expressa de forma homogénea em Melan-A (A) e os antigénios de diferenciação HMW-MAA (B). A mesma distribuição caracteriza a progressão do tumor antigénios HER-3 (C) e a tenascina macromolécula extracelular (D). Esta última característica delimita áreas de tumor de tamanho variável. (160 × ampliação).

O CXCR6 + /ABCG2 + fenótipo em biópsias de melanoma humano

Embora as linhas de células de melanoma avaliados foram derivadas de tecidos de tumores humanos, o CXCR6 recém-descrita + /+ ABCG2 fenótipo da célula pode ter sido limitadas a células de tumor em cultura. Por conseguinte, foram investigados 4 melanoma positiva linfáticos espécimes de biopsia nó humanos não cultivados para detectar a presença de células com o CXCR6 + /+ ABCG2 fenótipo. Todos os quatro speciments biopsia continha uma pequena subpopulação de células ABCG2 + (12,2%, 8,4%, 2,65%, 0,1%). Um destes três também continha uma pequena população CXCR6 + (0,25%) e uma pequena população positiva dupla ABCG2 + /+ CXCR6 (0,3%). FIG. 9 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo da CXCR6 + /+ ABCG2 espécimes positivos.

análise de citometria de fluxo de um ser humano melanoma espécime de biópsia para um CXCR6 + /+ ABCG2 subfracção. Um melanoma metastático espécime de biópsia foi processado tal como descrito em

Material e Métodos

e imediatamente analisadas por citometria de fluxo. O painel esquerdo, intensidade de fluorescência análises bivariadas com anticorpos de controlo de isotipo conjugado com FITC (IgG) respectiva APC- e. painel direito, intensidade de fluorescência análises bivariadas com a respectiva APC- e anticorpos específicos para CXCR6 e específicos de ABCG2 conjugado com FITC. Números, por cento do total de células avaliadas.

função CXCR6 e CXCL16 níveis em linhas de células de melanoma

Em um estudo recente, a ligação da CXCR6 pelo fragmento solúvel clivada da sua membrana-bound ligando CXCL16 ( “sCXCL16”) foi mostrada para aumentar a proliferação de linhas de células de carcinoma de [11]. Foram investigados os efeitos do ligando sCXCL16 livre no crescimento de IGR37 e IGR39 células.

Os níveis de CXCL16 no meio por células não triados de ambas as linhas celulares e em células CXCR6 + correspondentes foram ensaiadas utilizando ELISA (Fig. 10 ). O nível de CXCL16 detectado era extremamente baixa (0,06 unidades OD ± 0,03, n = 8). Não se observou qualquer diferença significativa entre a célula não triados e CXCR6 + células classificadas após 3 dias de cultura (Fig. 8).

50000 células /cavidade foram semeadas em 24 placas de poços múltiplos. Quando as células atingiram confluência ~ 90% (~3-4 dias), o meio foi recolhido e centrifugado brevemente. Uma alíquota de 50 ul do meio foi usado para a detecção de CXCL16 usando o Quantikine Human CXCL16 Immunoassay (R D Systems, Minneapolis, MN). Barras representa a média ± S.D. de três experiências independentes, cada um realizado em quintuplicado.

De acordo com os métodos descritos, ambas as linhas celulares foram incubadas com sCXCL16 durante 4 ou 7 dias. No final da incubação, as células foram tripsinizadas e contadas. Como mostrado na Fig. 11, por dia 7, ambas as linhas celulares exibiram um aumento significativo (p 0,01). Que em média 1,4 vezes no número de células em resposta a sCXCL16 adição

Vinte mil culas foram semeadas durante a noite em poços individuais de 12 múltiplas placas Bem em condição de crescimento médio completo. SCXCL16 recombinante (100 ng /ml) foi adicionado no dia seguinte e substituída cada 48 horas. No dia 4 e 7 de cultura, as células foram tripsinizadas e os números de células viáveis ​​determinado. O gráfico de barras representa a média ± S.D. de três experiências independentes, cada um realizado em triplicado. *, P 0,01

vs

. células não tratadas (barras negras); ** P 0,001

vs

. células não tratadas (barras pretas).

Melanoma antígeno associado (MAA) expressão e ABCG2 contra expressão CXCR6

O perfil do MAA pertencente ao testículo Antígenos Cancro (CTA) expressão família ( MAGE-A1, -A2, -A3, -a6, GAGE ​​1-2, 1-6 GAGE, SSX-2, SSX 1-5, e NY-ESO-1) e do HMW-MAA foi realizada por RT-PCR . Como mostrado na Tabela 4, foram observados padrões de detecção similares para ABCG2 + e subpopulações ABCG2- para ambas as linhas celulares. Além disso, o tratamento com o agente de hipometilação de DNA 5-aza-2′-desoxicitidina foi capaz de induzir uma

de novo

expressão de MAGE-A3, MAGE-A4, GAGE ​​1-2, 1-6 GAGE e SSX 1-5 em ambos os ABCG2

+ e ABCG2

-. IGR37 células de melanoma (Tabela 5)

com relação a subpopulações de células CXCR6 + e CXCR6- em IGR37 e IGR39 populações de células, bem como a ABCG2 duplo positivo + + IGR37 células /CXCR6, houve uma sobreposição da família CTA e de HMW-MAA (Tabela 6). Além disso, no xenoenxerto de tumor CXCR6 IGR37 +, todas as proteínas da família da MAA sobreposto com a excepção de células + IGR37 CXCR6 para a tirosinase, MART-1, e Gp100 (Tabela 6).

Discussão

Um problema fundamental na pesquisa do câncer é identificar o tipo de célula que é capaz de sustentar o crescimento neoplásico. Há evidências de que a maioria das células de cancro são clones de células cancerosas e que representam a descendência de uma única célula (revisto em [6]). No entanto não é claro que as células possuem a função de células de iniciação do tumor, a manutenção do crescimento do tumor. A ideia da teoria de células-tronco do câncer é que as células específicas (

i., Células-tronco cancerosas

, CSCs) possuem as propriedades regenerativas necessários que levam à formação de tumores [6]. Outro ponto importante, até agora pouco clara, é a origem das CSCs putativos [6]. Uma forma importante para demonstrar que uma subpopulação específica pode sustentar o crescimento do tumor é a utilização de modelos de xenoenxerto de células humanas ou modelos singénicos para células de murídeo. No entanto, uma crítica importante sobre, em particular, o modelo de xenoenxerto é que é um modelo artificial, sendo, por exemplo, em que os factores ambientais heterólogos não são considerados [6]. Por outro lado, outro ponto fundamental é identificar os marcadores que são capazes de definir um câncer /iniciando subpopulação de células-tronco.

No presente trabalho, identificamos um novo biomarcador que é associado com auto-assimétrica renovação, o co-receptor de quimiocina CXCR6. Além disso, para o papel de CXCR6 na resposta imune [10], [12], mais recentemente, a expressão CXCR6 foi relatado em alguns tumores humanos, incluindo o melanoma [12]. Comparando-se duas linhas de células de melanoma humano progenitoras, IGR39 (primário) e IGR37 (metastático), o último foi mais agressiva para a formação de xenoenxerto de tumor em comparação com células de melanoma primário IGR39. Esta diferença de potencial tumorigénico foi refletida nas subpopulações classificadas-CXCR6. Na verdade, as células CXCR6 + resultou em maior massa do tumor num período de tempo mais curto signficantly, em comparação com células não separadas. Além disso, as células CXCR6- não resultou em qualquer massa tumoral significativa, observável. Uma vez que a expressão CXCR6 foi encontrado para ser ligada a auto-renovação assimétrica que é típico de TSSCs, MCSCs parecem ser derivado de células-tronco dos melanócitos específicos de tecidos. Embora, postula-se que assimétrica auto-renovação por TSSCs deve ser cauterizado para que se tornem precursoras de tumores [9], [15], tais células mutantes podem ainda manter marcadores associados à sua capacidade anterior para assimétrica auto-renovação, mesmo depois desta TSSCs função é alterada por mutações.

Vários transportadores ABC foram encontrados para ser sobre-expresso em linhas celulares de cancro em cultura sob pressão selectiva [6]. Em particular, no que diz respeito ao melanoma, ABCB5 é sobre-expresso no melanoma e ABCG2 é expressa por uma sub-fracção da população celular de melanoma positiva CD133-[4], [5]. Aqui, demonstramos pela primeira vez, uma relação entre ABCG2 e auto-renovação assimétrica. Na verdade, as células ABCG2 + deu uma massa de tumor maior do que as células ABCG2- em ratinhos imunodeficientes. No entanto, as células que expressam CXCR6 eram mais agressivos para a formação de tumores do que as células que expressam ABCG2, sugerindo que as células da subpopulação CXCR6 + /ABCG2 + podem ser os MCSCs mais potentes.

Por outro lado, uma questão interessante é por isso que nem ABCG2 + nem CXCR6 + células foram detectados em xenoenxertos de tumor. Eles podem ser muito raro, ou eles podem não receber a entrada ambiental necessária para a expressão em ratinhos imunodeficientes. Na verdade, se cultivadas derivadas de tumores ABCG2 + ou células CXCR6 + sua expressão retornada em cultura após uma a duas passagens [4] (dados não mostrados). A este respeito, é importante salientar que a nossa análise de biópsias de melanoma humano confirmou a presença de um ABCG2 + /+ CXCR6 subfracção em tecidos humanos. Esta descoberta é importante para descartar a possibilidade de que o fenótipo celular ABCG2 + /CXCR6 + existe apenas em cultura de células. Assim, a sua parece mais provável que a expressão das proteínas é impedido por algum mecanismo desconhecido em ratinhos imunodeficientes, ou outras espécies em geral.

Segmentação de MCSCs pode apresentar uma abordagem nova e mais eficaz clínica para o tratamento de melanoma humano. No entanto, o seu perfil antígeno específico pode dificultar a evolução clínica de estratégias de imunoterapia para esses pacientes. Neste contexto, foi investigada na medida em perfil MCSCs para antígenos associados a tumores específicos (TAAs) actualmente utilizados como alvos terapêuticos no contexto clínico. Na realidade, a falta dos alvos terapêuticos adequados no MCSCs pode, de facto, resultar da resistência a longo prazo ao tratamento, sustentado pelo crescimento de clones de células de melanoma AT-negativas. Neste contexto, o surgimento de células AT-negativas capazes de escapar controlo imunitário tem sido relatada em doentes de melanoma submetidos a tratamento imunológico [26].