Abstract

Fundo

Aumento dos níveis de NF-kB são características de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) e ambos vias clássica e alternativa da activação de NF-kB têm sido implicados.

Metodologia as principais conclusões

Aqui mostra-se que a activação da via alternativa é uma fonte para a actividade basal elevada de NF-kB em PDAC linhas de celular. O aumento da actividade da p52 /RelB NF-kB complexo é mediada através de estabilização e activação de cinase de NF-kB induzindo-(NIK). Identificamos downregulation proteossómica do factor associado ao receptor TNF 2 (TRAF2) na forma de um mecanismo através do qual os níveis de NIK activo são aumentados em linhas celulares PDAC. Tal regulação positiva de NIK níveis de expressão e da atividade relés para o aumento da proliferação e crescimento independente de ancoragem, mas não de migração ou sobrevivência das células PDAC.

Conclusões /Significado

O crescimento rápido é uma característica do câncer de pâncreas . Nossos dados indicam que a TRAF2 /NIK /NF-κB2 via regula tumorigenicidade de células PDAC e poderia ser um alvo valioso para a terapia desse tipo de câncer

Citation:. Doppler H, Liou GY, Storz P (2013) regulação negativa do TRAF2 Medeia NIK-Induced cancro do pâncreas proliferação celular e tumorigenicidade. PLoS ONE 8 (1): e53676. doi: 10.1371 /journal.pone.0053676

editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 26 de julho de 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 03 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Doppler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da AACR (08-20-25-STOR), os Institutos Nacionais de Saúde concede CA135102, CA140182 e P50CA102701 (SPORE Mayo Clinic, em cancro do pâncreas). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os fatores de transcrição do NF-kB (fator nuclear kappa-light-chain-potenciador de células B activadas) da família são regulados positivamente em muitos cancros humanos [1]. NF-kB tem funções em todas as características de carcinogénese ou progressão do cancro, incluindo a protecção contra a morte celular, aumento da proliferação celular, motilidade celular e metástase, inflamação e angiogénese de tumor [1]. Além disso, as células de tumor muitas vezes adquirir resistência a drogas anti-cancro (quimiorresistência) por regulação positiva de sinalização de NF-kB [2].

complexos do factor de transcrição NF-kB são formados por homo ou heterodímeros de subunidades p65 da (RelA) , RelB, c-Rel, p50 ou p52 [3]. Rela dímeros /p50 representam a clássica (canônica) NF-κB1 e RelB /p52 dímeros a alternativa (não-canônica) NF-κB2 complexo [4]. Tanto a alternativa e clássica percursos de activação do NF-kB contar com o complexo de cinase IkB (IKK) que é composto por IKKα, IKKβ e nemo /IKKγ. IKKβ e nemo /IKKγ mediar a activação da via NF-canónica κB1, em que IKKα não tem um papel essencial. Em contraste, a activação da via alternativa do NF-κB2 requer IKKα, mas não IKKβ nemo e [5]. Envolve também a NF-kB induzindo-quinase (NIK) como uma quinase a montante directa para [4] IKKα. Uma vez ativado por NIK, IKKα induz o processamento de NF-κB2 /p100 para p52.

Na ausência de um estímulo, NIK é rapidamente degradada e isso depende de sua associação com TNF fator associada ao receptor 3 (TRAF3) . A ligação a TRAF3 recruta NIK ao complexo TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 ligase [6], [7]. inibidor celular de proteínas apoptose (CIAPS) são ubiquitina ligases que podem promover a ubiquitinação e degradação de proteossoma-se, bem como os seus associados de ligação do TRAF2 e TRAF3 [8], [9]. Ambos os CIAPS também mediar polyubiquitination K48-ligado da NIK, resultando na sua degradação proteossómica [7]. Em células estimuladas (isto é, após a ligação do receptor de CD40), os complexos de TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 /TRAF3 são recrutados para o receptor e TRAF2 induz a ubiquitinação e degradação de TRAF3 [10]. Como os níveis de TRAF3 diminuir, recém-sintetizado NIK é estabilizada e ativa, porque já não pode interagir com a TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 complexo [6].

O cancro do pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC), os níveis de NF-kB são aumentada em linhas de células de cancro, bem como amostras de pacientes e medeiam a proliferação das células e resistência à quimioterapia [11], [12], [13]. O aumento da actividade de NF-kB em PDAC é devido a ambos os percursos de activação canónicos e alternativas [14], [15]. Já que até agora não há alterações genéticas para TRAF, cIAP ou NIK foram descritas para este cancro, os mecanismos pelos quais a via alternativa é regulada são largamente desconhecidos para PDAC.

Aqui nós mostramos que, em níveis de proteína linhas celulares TRAF2 PDAC são regulados negativamente e de que este é o mecanismo pelo qual a estabilização da NIK é conseguido para induzir a activação da via alternativa do NF-kB. Nós ainda mostrar que relés actividade NIK ao aumento da proliferação celular e o crescimento independente de ancoragem. O crescimento rápido é uma marca registrada do câncer de pâncreas e nossos dados indicam que a TRAF2 /NIK /NF-κB2 via pode ser um alvo valioso para a terapia desse tipo de câncer.

Resultados

NIK expressão e atividade são aumentados em linhas celulares PDAC

Activo NIK é sobre-expresso em amostras humanas de PDAC, em comparação com o tecido de pâncreas normal (Fig. 1A). Este promovido nós para analisar um painel de nove linhas celulares PDAC estabelecidos, bem como células humanas do pâncreas epitelial ductal (HPDE), que serviu como controlo normal para a expressão e a actividade da NIK. Na maioria das linhas de células PDAC que foram analisadas, NIK expressão foi aumentado em comparação com células normais HPDE (Fig. 1B, painel superior). O aumento da expressão correlacionada com actividade aumentada, tal como determinado com um anticorpo específico para fosfo (anti-pT559-NIK) que reconhece NIK fosforilação na sua ansa de activação (Fig. 1B, painel do meio). De todas as linhas de células PDAC analisados, apenas dois, Capan2 e HPAFII, não mostraram aumento da atividade da NIK. Usando RT-PCR quantitativo, nós próxima testado se o aumento da expressão do mRNA NIK poderia ser a razão para os níveis de proteína aumentado. Embora tenhamos observado variações na expressão de ARNm de NIK entre as diferentes linhas de células, uma correlação evidente com a sua expressão ao nível da proteína não foi observada (Fig. 1C). Isto indicou que em linhas celulares PDAC expressão aumentada NIK não é alcançado por aumento da transcrição, mas sim por mecanismos que estabilizam os níveis de proteína

A:., As amostras de tecidos humanos normais e de pâncreas PDAC foram imuno-histoquimicamente coradas para o total de NIK ( anti-NIK) ou NIK activo (de expressão anti-pT599-NIK) ou sujeitas a H e de coloração. A barra indica 50 um. B: Os lisados ​​celulares de linhas de células indicadas ou células PDAC HPDE foram normalizados para 0,5 mg /ml e, em seguida, submetidas a SDS-PAGE. As amostras foram transferidas para nitrocelulose e analisadas por transferência de Western para a expressão de NIK (NIK-anti) ou a actividade de NIK (anti-pT559-NIK). A coloração para β-actina (β anti-actina) serviu como controlo de carga. C: As amostras de ARNm de linhas celulares indicadas foram submetidas a RT-PCR quantitativa dirigido contra a NIK. As amostras foram normalizadas para GAPDH.

Expression TRAF2 é regulada negativamente em linhas celulares PDAC

A seguir, testamos se NIK é regulado pós-traducionalmente. Na ausência de um sinal de activação, NIK mostrou ser regulada negativamente na sua expressão por interacção com a TRAF2, TRAF3 e 2 cIAP1 complexo e subsequente ubiquitinação /[15], [16]. Deste complexo regulamentar para NIK, TRAF3 e cIAP1 /2 são abundantemente expressa em todas as linhas celulares PDAC, bem como células de controlo de HPDE normais (Fig. 2a). TRAF2, no entanto, só foi expressa em células de HPDE, mas não, ou muito pouco expresso em sete das nove linhas de células PDAC. Em Capan1 e células HPAFII foi detectada expressão de TRAF2, mas a um peso molecular invulgar de aproximadamente 65 kDa (Fig. 2A, Fig. S1, seta branca). A perda da expressão de TRAF2 foi observada em todas as linhas celulares PDAC que mostraram um aumento da actividade da NIK (comparar Fig. 1A e Fig. 2A). Curiosamente, a TRAF2 ARNm era abundante em todas as linhas celulares PDAC (Fig. 2B), indicando que a sua expressão, também não é regulada a nível da transcrição. Uma vez que os níveis de expressão a TRAF2 pode ser regulada por ubiquitinação, que se testou lado a sua perda em linhas celulares PDAC é devido a ubiquitinação e subsequente degradação de proteossoma. Quando re-expressos em células Panc1, a TRAF2 foi ubiquitinadas (Fig. 2C), ao passo que não foi detectado quando ubiquitinação ectópica TRAF2 foi expressa em células de HPDE (não mostrado). Tratamento de linhas celulares PDAC com MG-132, um inibidor de proteassoma, restabeleceu os níveis endógenos TRAF2 dentro de 4 a 24 horas, dependendo da linha de células (Fig. 2D). Além disso, a re-expressão ectópica de TRAF2 em Panc1 conduziu a um decréscimo na expressão da NIK, indicando ainda que o aumento dos níveis NIK são mediadas por regulação negativa da TRAF2 nestas células (Fig. 2E). Tomados em conjunto, isto sugere que um mecanismo de como basais elevados níveis de expressão e a actividade de NIK são regulados na maioria das linhas celulares PDAC é por ubiquitinação e degradação proteossómica de TRAF2, resultando em maior estabilidade e actividade de NIK.

A : Os lisados ​​celulares de células indicadas foram normalizados para 0,5 mg /ml e, em seguida, 20 g foram submetidos a SDS-PAGE. As amostras foram transferidas para nitrocelulose e analisadas por transferência de Western para a expressão de TRAF2 (anti-TRAF2), TRAF3 (anti-TRAF3), cIAP1 (anti-cIAP1), cIAP2 (anti-cIAP2) ou β-actina (anti-β-actina ; carregamento de controle). TRAF2 sobre-expresso em células Hek293 serviu como um controlo adicional do peso molecular. B: As amostras de ARNm de linhas celulares indicadas foram submetidas a RT-PCR quantitativa dirigido contra a TRAF2. As amostras foram normalizadas para GAPDH. Panc1 células (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) foram co-transfectadas com TRAF2 e vector de controlo ou HA-ubiquitina: C. Após 24 horas as células foram lisadas, imunoprecipitadas TRAF2 (anti-TRAF2) e analisados ​​por imunotransf erência para ubiquitinação de TRAF2 (anti-HA). Blots foram re-sondados para a TRAF2 (anti-TRAF2). D: Indicado linhas celulares foram tratados com MG-132 (20 uM) durante 0, 4, 8, 16 ou 24 horas. As células foram lisadas e analisadas quanto à expressão de TRAF2 endógena (anti-TRAF2) ou β-actina (anti-β-actina; carregamento controlo TRAF2 sobre-expresso em células Hek293 serviu como controlo positivo E:.. Células Panc1 (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) foram transfectadas com controlo de vector ou TRAF2 como indicado. Depois de lisados ​​celulares 24 horas foram analisados ​​por transferência de Western para a expressão da NIK (anti-NIK), TRAF2 sobre-expresso (anti-TRAF2) ou β-actina (anti -β-actina) como controle de carga.

NIK medeia basal NF-kB Atividade no PDAC linhas celulares

Uma vez ativado NIK pode induzir a via não-canônico da activação de NF-kB, induzindo o processamento de NF-κB2 /p100 para P52. Em lisados ​​de células totais de linhas celulares PDAC, aumento dos níveis de p52 correlacionados com o aumento da expressão e actividade de NIK indicando que NIK activo também é funcional (comparar Fig. 3A e a Fig. 1B) . também foi observado um aumento da expressão de RelB, um

fidedigno

parceiro de ligação para a p52 na via alternativa do NF-kB, indicando que o aumento da actividade da NIK leva à formação de /P52 complexos NF-kB RelB. Na verdade, ambos os componentes deste complexo foi detectado nos núcleos de linhas celulares PDAC (Fig. 3B) e análises EMSA supershift mostrou que ambos têm actividade de ligação a ADN (Fig. 3C). De nota, extractos nucleares também continha p65 e p50 (Fig. S2). Utilizando ensaios de gene repórter da luciferase que próximo testado se a indução mediada por NIK-relés de NF-κB2 para o aumento dos níveis basais de NF-kB. Quando as células Panc1 foram lentivirally infectados com controlo shRNA ou duas sequências de NIK-shRNA específicos (NIK-shRNA1 e NIK-shRNA2) e, em seguida, transfectadas com o gene repórter de NF-kB-luciferase, observou-se uma diminuição significativa na actividade de NF-kB quando NIK era regulados negativamente na sua expressão (Fig. 3D). Em contraste, quando as células foram transfectadas com um alelo activo de NIK (NIK.T559D) níveis de NF-kB basais foram aumentados (Figura 3E).

A:. Os lisados ​​celulares de células indicadas foram normalizados para 0,5 mg /ml e em seguida 20 g foram sujeitos a SDS-PAGE. As amostras foram transferidas para nitrocelulose e analisadas por transferência de Western para a expressão de RelB (anti-RelB), p52 (anti-p52) ou β-actina (anti-β-actina; controlo de carga). B: Os extractos nucleares e citosólicos frações de linhas celulares indicadas foram analisados ​​por Western blot para RelB e p52 e, adicionalmente para p65 e p50 (ver Figura Suplementar S2). A imunocoloração para nucleolina serviu como um marcador para extractos nucleares. coloração de prata dos lisados ​​serviu como controle de carga. C: Nuclear extractos de células Panc1 foram incubadas com anticorpos anti-P52 anti-RelB ou como indicado, e em seguida submetido a análise de ADN de ligação actividade utilizando a EMSA. 100x oligonucleótido não marcado serviu como um controlo de especificidade. D: células que expressam Panc1 controle (mexidos) shRNA ou NIK-shRNA (duas sequências diferentes, NIK-shRNA1 ou NIK-shRNA2) foram adicionalmente transfectadas com NF-kB-e luciferase Renilla repórteres. Foram realizadas 16 horas após a ensaios de luciferase gene repórter transfecção. Knockdown da NIK foi controlada com a análise de RT-PCR. RT-PCR para mRNA de β-actina serviu como controlo. Os asteriscos indicam significância estatística. E: as células foram transf ectadas com Panc1 NF-kB-luciferase e repórteres de luciferase de Renilla como controlo do vector ou um mutante NIK.T599D, como indicado. Foram realizadas 16 horas após a ensaios de luciferase gene repórter transfecção. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​quanto a expresso NIK activo utilizando Western blot e anticorpos dirigidos contra NIK.T559D marcado com FLAG (anti-FLAG) ou β-actina (anti-β-actina) como um controlo de carga. O asterisco indica significância estatística.

NIK é um regulador crítico do Crescimento transformado em células de PDAC

Em seguida, avaliaram a exigência de NIK no crescimento transformado células PDAC. Portanto, primeiro estabelecidas linhas celulares Panc1 e MiaPaCa2 expressam de forma estável, quer NIK-shRNA ou controlo mexidos shRNA. Em seguida, utilizou estas linhas de células para determinar o crescimento independente de ancoragem em ensaios de formação de colónia softagar. O knockdown da NIK nas células MiaPaCa2 Panc1 e diminuiu significativamente o crescimento independente de ancoragem e esta correlacionada com os níveis de expressão de proteína NIK em células (Fig. 4a). A expressão ectópica de um alelo NIK maior crescimento e colônia formação constitutivamente activa independente de ancoragem em células Panc1 (Fig. 4B). Resultados semelhantes sobre o crescimento celular foram obtidos com genética inversa acima (Fig. 4C, linha superior) ou a sobre-expressão ectópica (Fig. 4C, linha inferior) aproxima-se, quando as células Panc1 foram cultivadas em cultura de células 3-dimensionais (3D) de Matrigel em vez de softagar. Os nossos resultados indicam que a NIK é necessária e suficiente para mediar o crescimento tumorigénico de linhas celulares PDAC

A:. Panc1 ou células MiaPaCa2 (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) que expressam de forma estável o controlo (scrambled) shRNA ou NIK-shRNA (duas sequências diferentes, NIK-shRNA1 ou NIK-shRNA2) foram submetidos a ensaios de formação de colónias em agar mole. Uma fracção das células transfectadas foram recolhidos e analisados ​​quanto à expressão NIK utilizando análise de Western blot, e os anticorpos dirigidos contra a NIK (anti-NIK) ou β-actina (anti-β-actina) como controlo de carga. Os asteriscos indicam significância estatística. barras de escala representam 1 mm. células Panc1 (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) foram lentivirally infectados com o vírus controlo ou vírus para a expressão de NIK constitutivamente activo (NIK.T559D mutante) e submetidos a ensaios de formação de colónia de agar mole: B. Antes de semear uma fracção das células foram lisadas e analisadas quanto expresso de NIK activo utilizando Western blot e anticorpos dirigidos contra NIK.T559D marcado com FLAG (anti-FLAG) ou β-actina (anti-β-actina) como um controlo de carga. O asterisco indica a significância estatística. barras de escala representam 1 mm. células Panc1 (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) expressando estavelmente controle (mexidos) shRNA, NIK-shRNA1 ou NIK-shRNA2 (linha superior), ou células lentivirally infectados com o vírus controlo ou NIK.T559D mutante: C (linha de fundo) foram semeadas em cultura 3D Matrigel. Nos dias 10 (células shRNA) ou 14 (células que expressam NIK.T559D) após o crescimento da colônia semeadura foi analisada por ImagePro. A barra representa 500 mm.

TRAF2 /NIK sinalização regula a proliferação celular PDAC

A seguir, testamos se NIK afeta a proliferação, motilidade e chemoresistance de células PDAC. Por isso utilizamos nossas linhas celulares expressando Panc1 e MiaPaCa2-NIK ou shRNA controlo scrambled shRNA e ensaios de proliferação realizada em tempo real durante um período de tempo de 30 horas. Em células Panc1, knockdown da NIK com duas sequências shRNA diferentes diminuiu substancialmente a proliferação de células para 62 – /+ 1,1 por cento para a sequência de 1 e 51 – /+ 1 por cento para a sequência de dois em relação ao controlo (100%) no ponto final de análise. Em células MiaPaCa2, knockdown da NIK diminuição da proliferação celular para 49 – /+ 0,7 por cento para a sequência 1 e 63 – /+ 1,7 por cento para a sequência 2 no ponto final da análise (Fig 5A.). Além disso, as linhas celulares que expressam MiaPaCa2 Panc1 e o mutante constitutivamente NIK.T559D-activo mostraram um aumento da proliferação celular a 138 – /+ 3,7 por cento (Panc1) e 166 – /+ 2,7 por cento (MiaPaCa2) relativamente ao controlo (100%) a o ponto final da análise (Fig. 5B). Não se observou aumento da sensibilidade à morte celular quando as células foram transfectadas de forma estável com o NIK-shRNA (não mostrado). Além disso, o knockdown da NIK não sensibilizar linhagens de células PDAC a morte celular induzida por agentes quimioterapêuticos. Para testar isto foram comparadas linhas celulares para a sua capacidade de resposta a Gemcitabine- e 5-fluorouracilo (5-FU) (Fig. S3). No entanto, quando comparado com o controlo não tratado, as linhas de células mostraram um sinal de knockdown diminuiu em MTT, devido ao seu potencial de diminuição de proliferar. Finalmente, testamos se o potencial para migrar ou invadir é alterada pela expressão NIK, mas não encontraram nenhuma diferença significativa na migração celular ou invasão em células empobrecido da NIK ou células com superexpressão NIK ativa (Fig. S4). Isto indica que a atividade basal de NIK em células PDAC afeta exclusivamente a proliferação

A:. Panc1 ou células MiaPaCa2 (5 × 10

5 células, seis centímetros prato) expressando estavelmente controle (mexidos) shRNA ou NIK-shRNA (duas sequências diferentes, NIK-shRNA1 ou NIK-shRNA2) foram semeadas em e-placas e depois de proliferação celular anexo foi continuamente monitorada em tempo real para os tempos indicados utilizando um instrumento xCELLigence RTCA DP. As barras de erro (cinzento) representam três experiências. análise de controlo de knockdown da NIK para ambas as linhas de células é mostrada na Figura 4A. B: Panc1 ou células MiaPaCa2 (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) foram lentivirally infectados com o vírus controlo ou vírus para a expressão de NIK constitutivamente activo (NIK.T559D mutante). A próxima media dia foi mudado e após 48 horas as células foram semeadas em E-placas e depois de proliferação celular anexo foi continuamente monitorada em tempo real para os tempos indicados utilizando um instrumento xCELLigence RTCA DP. As barras de erro (cinzento) representam três experiências. Uma fracção das células transfectadas foram lisadas e analisadas quanto expresso de NIK activo utilizando Western blot e anticorpos dirigidos contra marcado com FLAG NIK.T559D (anti-FLAG) ou β-actina (anti-β-actina) como um controlo de carga (mostrado por MiaPaCa2). As membranas de controlo para a linha de células de Panc-1 são apresentados na Fig. 4B.

Uma vez que os nossos dados anteriores indicam que a estabilidade e a actividade de NIK em linhas celulares PDAC são alcançados por regulação negativa proteossómica de TRAF2, que próximo testado se a re-expressão de TRAF2 pode diminuir a proliferação celular. A expressão ectópica de TRAF2 diminuição da proliferação celular de células Panc1, MiaPaCa2 e BxPC3. Dependendo da linhagem de células, proliferação de células foi reduzida para 68 – /+ 1 por cento (Panc1), 82 – /+ 1 por cento (MiaPaCa2), ou 48 – /+ 0,5 por cento (BxPC3) na extremidade de análise (30 horas) . Finalmente, testou-se a activação da via alternativa do NF-κB2 pode mediar a proliferação celular de células do ducto pancreático normais. Portanto, as células infectadas normais HPDE com NF-κB2 /P100 e analisados ​​proliferação por medição em tempo real. Após a expressão de NF-κB2 /p100, foi detectada a sua P52 produto activo em células de HPDE, correlacionando-se com um ligeiro aumento da proliferação de células de 107 – /+ 1,2 por cento em relação ao controlo (100%) no ponto final de análise (Fig. 6D) .

A-C: linhas celulares indicadas (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) foram infectados com o controle ou adenovírus TRAF2. Após as células 48 horas foram semeadas em E-Pratos e depois de proliferação celular anexo foi continuamente monitorada em tempo real, durante 30 horas, utilizando um instrumento xCELLigence RTCA DP. As barras de erro (cinzento) representam três experiências. Uma fracção das células transfectadas foram lisadas e analisadas por transferência de Western para a TRAF2 ou β-actina (controlo de carga). células HPDE (5 × 10

5 células, 6 cm pratos) foram infectados com o controle ou NF-κB2 /p100 adenovírus: D. Após as células 48 horas foram semeadas em E-Pratos e depois de proliferação celular anexo foi continuamente monitorada em tempo real, durante 20 horas, utilizando um instrumento xCELLigence RTCA DP. As barras de erro (cinzento) representam três experiências. Uma fracção das células transfectadas foram lisadas e analisadas por transferência de Western para processado, activa NF-κB2 utilizando anticorpos dirigidos contra a p52 (anti-p52) ou β-actina (anti-β-actina) como um controlo de carga.

correlação de

in vitro

de dados com os dados clínicos

em seguida, determinou se uma correlação inversa entre a expressão semelhante NIK e a atividade e downregulation TRAF2 ocorre em amostras humanas de adenocarcinoma do pâncreas. De 55 amostras PDAC humanos analisados, 69% apresentaram diminuição da expressão TRAF2 correlacionando-se com o aumento dos níveis NIK e aumento da atividade NIK (Fig. 7A, as amostras # 58, # 27 e # 44 em quadro vermelho e Fig. 7B gráfico de pizza superior área vermelha) . No entanto, 18% das amostras mostraram regulação positiva dos níveis de TRAF2 e NIK, mas nenhuma ou muito pouca actividade de NIK (Fig. 7A, a amostra # 30 e a Fig. 7B torta gráfico de área verde). Adicionais 13% de todas as amostras mostraram regulação positiva de todas as três moléculas (Fig. 7A, amostras # 35 e a Fig. 7B gráfico da torta área azul). Nenhuma correlação de TRAF2 /níveis NIK com qualquer idade, sexo, estágio de tumor ou TNM estado foram observadas No entanto, houve uma correlação entre o grau do tumor e os níveis de TRAF2 /NIK. tumores bem diferenciados de grau 1 não mostraram a alta TRAF 2 e níveis NIK e baixa pT559-NIK, ou teve todos os três regulada. Tumores deste Grau parecem normais e não estão crescendo rapidamente. Em contraste, mais de 70% de grau 2 tumores (moderadamente diferenciadas) e mais de 80% de grau 3 tumores (fracamente diferenciadas) demonstrou a regulação negativa de TRAF2 correlacionando-se com o aumento dos níveis e da actividade da NIK. As células tumorais destas notas parecem anormais e tendem a crescer e se espalhar de forma mais agressiva, correlacionando-se com a nossa

in vitro

dados que mostram que TRAF2 acima descrito /NIK mecanismo de sinalização pode mediar a proliferação de células de tumor pancreático.

a: Tissue microarrays (TMAs) incluindo 10 amostras de tecido pancreático normais e 55 pancreático adenocarinoma ductal foram H e manchado ou analisadas para a expressão de TRAF2 (anti-TRAF2), NIK (anti-NIK) ou NIK activo (anti-pT559- NIK). representativos de imagens de tecidos de tumor são descritos. Os números indicam a posição do tecido sobre a TMA. A barra indica 50 um. B: Análise de correlação de TRAF2, NIK, e pT559-NIK em n = 55 amostras humanas para addnocarcinoma pancreático. gráfico de pizza superior mostra porcentagem de células com baixa expressão TRAF2 e alta expressão de NIK e pT559-NIK em vermelho, porcentagem de células com alta TRAF2 e expressão NIK e baixa expressão de pT559-NIK em verde, eo percentual de células com alta TRAF2, expressão NIK e pT559-NIK em azul. gráficos de barras de fundo mostrar percentagem destes grupos na grade1, grau 2 e grau 3 tumores.

Discussão

O aumento da atividade de NF-kB basal foi detectada em amostras de câncer pancreático humano, como bem como linhas celulares PDAC [11]. NIK tem sido identificada como um regulador chave do NF-kB em muitos cancros [17]. No presente trabalho nós mostramos que NIK ativa é expresso em tecido do paciente de câncer pancreático e linhas celulares PDAC (Fig. 1). Identificamos a regulação negativa de TRAF2 através de ubiquitinação como um mecanismo pelo qual isto é conseguido (Fig. 2). Em células PDAC aumento da estabilidade e a actividade de NIK relés para o aumento da activação da via NF-kB alternativa (NF-κB2; P52 /RelB). Este medeia a proliferação celular e o crescimento independente de ancoragem (Figs. 4, 5, 6), todas as marcas do cancro do pâncreas. Os nossos dados são suportadas por um trabalho anterior de Schneider et ai., Que mostra que o /RelB complexo NF-kB p52 pode regular G1 para progressão da fase S em linhas celulares PDAC [18].

em muitos cancros NF -κB activação em células malignas ocorre em resposta a citoquinas inflamatórias [19]. Por exemplo, a activação induzida por TNFa do canónica via NF-kB tem sido implicado como causa potencial de aumento quimiorresistência [2]. No entanto, há exemplos de cancros em que a estabilização da NIK e activação resultante de NF-kB é conseguida por mutações intrínsecas. Em aproximadamente 20% de múltiplos casos de mieloma mutações de perda de função para a TRAF2, TRAF3 e cIAP1 /2 foram identificadas em pacientes, o que leva a activação de ambos os caminhos de NF-kB canónicos e alternativas para regular o crescimento e sobrevivência celular NIK-induzida [20], [21].

na via alternativa de activação de NF-kB, na ausência de um estímulo, associados NIK com o complexo TRAF3 /TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 que tem como alvo-lo para a degradação. Após a estimulação do receptor a /TRAF3 /cIAP1 complexo TRAF2 /cIAP2 é agrupado no receptor e activação leva a TRAF2 cIAP1 /2 e /ou degradação TRAF3 [6]. Isto estabiliza citosólica NIK e permite que a sinalização a jusante para activar IKKα e NF-κB2 /p100 [6], [10]. Mas NIK também podem ser estabilizadas por outros mecanismos. Por exemplo, TWEAK, um conhecido indutor da via alternativa do NF-kB desencadeia a degradação de cIAP1 /2 e isto resulta na estabilização NIK e NF-κB2 /p100 [7] processamento. Aqui, descrevemos um mecanismo de activação adicional e diferente que ocorre em linhas celulares PDAC. Os nossos dados sugerem a regulação negativa da proteína TRAF2 permanente em linhas celulares PDAC sob condições de crescimento normais, levando a uma estabilização da expressão NIK e a activação da via alternativa do NF-kB

.

Fora de nove linhas celulares PDAC testados, sete eram negativo para a expressão da proteína TRAF2 e TRAF2 expressa dois em um peso molecular invulgar de cerca de 65 kDa em vez de 53 kDa (Fig. 2A). É possível que esta proteína TRAF2 maior representa uma forma de união ou uma proteína de fusão. No entanto, o aumento de tamanho não parecem influenciar a função TRAF2 em direcção NIK uma vez que em ambas as linhas celulares, semelhante ao HPDE células de controlo, a expressão da proteína NIK era baixa (Fig. 1B). A natureza e função desta isoforma TRAF2 vai precisar de mais investigação aprofundada em trabalhos futuros. Também será interessante determinar se a proteína TRAF2 de peso molecular aumentado existir em pacientes.

Verificou-se que a perda de expressão TRAF2 é mediada através de ubiquitinação da proteína (Figs. 2c, 2d). Não ocorreram alterações significativas na expressão de cIAP1 /2 ou TRAF3 foram detectados (Fig. 2A). Foi demonstrado anteriormente que os ubiquitina ligases cIAP1 e cIAP2 promover a degradação proteossómica de seus parceiros de ligação a TRAF2 e TRAF3 [8], [9]. Assim perda observada de expressão de TRAF2 podia ser devido à presença de cIAP1 /2. Neste ponto, não está claro porque, a fim de ativar a via alternativa NF-kB na PDAC, a regulação negativa de TRAF2 é preferível a regulação negativa da TRAF3 ou CIAPS vez. Uma explicação para esta regulação pode ser que CIAPS anteriormente demonstraram ser de importância para a sobrevivência de células de tumor [22]. Regulação negativa da TRAF2 pode evitar a degradação dependente do estímulo da cIAP1 /2 [6], portanto, permitindo a sobrevivência constitutiva sinalização através IAPs. Além disso, a TRAF2 é um importante ligação entre CIAPS andaimes e NIK e perda de TRAF2 na maioria das linhas celulares testadas PDAC, podem desacoplar cIAP1 /2 sobrevivência mediada sinalização da sua função para destruir as células da NIK. Assim, com este mecanismo de células PDAC pode manter tanto a alta capacidade de sobrevivência, bem como elevadas taxas de proliferação (Fig. 8).

O mecanismo proposto como actividade de NIK é mantida em linhas celulares PDAC. Em células do ducto pancreático normais TRAF2 é expressa e forma um complexo de degradação para a NIK com TRAF3, cIAP1 /2. Isto leva a ubiquitinação e degradação da NIK. Em células PDAC, a TRAF2 é degradado por ubiquitinação. Isto evita a formação de um complexo de degradação NIK NIK e permanece expresso. NIK sinaliza para o complexo IKK não-canônico e IKKα medeia a activação de NF-κB2 e formação de dímeros RelB /P52. Efeito líquido de tal sinalização é um aumento na proliferação de células de câncer pancreático.

Para reforçar nossos mecanicistas

in vitro

análise, foram analisadas 55 amostras humanas de PDAC (graus 1-3) e descobriram que aproximadamente 69% mostrou a diminuição da expressão de TRAF2 e aumento dos níveis de NIK e pT559-NIK (Fig. 7) semelhante como se tinha observado que em linhas celulares do cancro do pâncreas (Figs. 1 e 2). No entanto, aproximadamente 31% das amostras analisadas apresentou a alta expressão de TRAF2 semelhante ao anteriormente descrito por Trauzold

et ai.

[23]. Importante, em todas estas amostras, a NIK expressão foi também regulada positivamente. É possível que este subconjunto de amostras de pacientes expressar a variante mais elevado peso molecular de TRAF2 que tínhamos observado que ocorre em algumas linhas celulares PDAC (i.e. HPAFII). Isso vai precisar de mais refinamento em estudos futuros. Ao separar tumores por grau, descobrimos que os tumores com alta TRAF 2 níveis eram tumores bem diferenciados de grau 1. Tumores deste grau não estão crescendo rapidamente, ao passo que os tumores de graus 2 e 3 são moderadas ou pouco diferenciados, respectivamente, e tendem a crescer e se espalhar de forma mais agressiva. Este aumento no crescimento agressivo e diminuição da expressão TRAF2 no grau 2 e 3 tumores correlaciona-se com a nossa

in vitro

dados que mostram que acima descrito TRAF2 /NIK mecanismo de sinalização pode mediar a proliferação de células de tumor pancreático.

resumo, os nossos resultados identificam downregulation proteossómica de TRAF2 como um mecanismo de como a estabilidade NIK pode ser regulada em PDAC. Segmentação esta via para diminuir a proliferação de células cancerosas pode representar uma nova estratégia para a terapia em PDAC. Por exemplo, a via alternativa da activação de NF-kB é sensível ao inibidor de proteassoma bortezomibe [20], [21]. Por isso, uma potencial abordagem terapêutica combinada seria combinar bortezomib com inibidores CIAP e /ou medicamentos indutores de apoptose, tais como gemcitabina.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

TMAs