PLOS ONE: A Novel Peptide de Tratamento Simultaneamente melhorada do Câncer de Cabeça e Pescoço e Mitigação de Oral Mucositis

Abstract

Temos caracterizado um romance 21 aminoácidos peptídeo derivado de Antrum mucosa Protein (AMP) -18 que medeia a promoção do crescimento das células epiteliais normais cultivadas e diminui a mucosite oral induzida por radiação em modelos animais, com supressão

in vitro

função das células cancerosas. O objetivo deste estudo foi avaliar esses potenciais efeitos terapêuticos duais de peptídeo AMP em um modelo animal clinicamente relevante de câncer de cabeça e pescoço (CCP), avaliando, simultaneamente, o seu efeito sobre o crescimento do tumor e mucosite oral induzida por radiação em um modelo ortotópico de HNC . SCC-25 células HNC bioluminescentes foram injectadas na lingual anterior e tumores que se formaram foram, em seguida, submetido a tratamento de radiação focal. O tamanho do tumor foi avaliada usando um

in vivo

sistema de imagem, ea extensão da mucosite oral foi comparado entre os animais tratados com o peptídeo AMP ou veículo (controles). Sinergismo entre a terapia de péptidos e radiação AMP foi sugerido pela constatação de que tumores na AMP peptídeo /radioterapia coorte demonstrou inibiu o crescimento vs. tumores de terapia somente tratados de radiação, enquanto AMP peptídeo-tratamento atrasou o início e diminui a intensidade da radiação Terapia mucosite oral induzida. Um efeito diferencial na apoptose parece ser um mecanismo pelo qual os AMP-18 pode estimular o crescimento e reparação de células epiteliais da mucosa ferido ao inibir a proliferação de células de HNC. análise de RNA de microarray vias que são diferencialmente alvo de AMP-18 em células não transformadas versus HNC identificado. Estas observações confirmam a noção de que as células normais e as células tumorais podem responder de forma diferente a estímulos biológicos comuns, e que aproveitando esta descoberta no caso de AMP-18, pode proporcionar uma oportunidade clinicamente relevante

citação:. Chen P, Mancini H, Sonis ST, Fernandez-Martinez J, Liu J., Cohen EEW, et ai. (2016) A Novel Peptide de Tratamento Simultaneamente melhorada do Câncer de Cabeça e Pescoço e Mitigação da mucosite oral. PLoS ONE 11 (4): e0152995. doi: 10.1371 /journal.pone.0152995

editor: Craig Murdoch, da Universidade de Sheffield, Reino Unido

Recebido: 01 de outubro de 2015; Aceito: 22 de março de 2016; Publicação: 06 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um subsídio do Instituto Nacional do Câncer (www.cancer.gov): CA 176032 para FGT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Biomodelos, LLC. forneceu apoio sob a forma de salários para os autores MM, STS e JFM, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção Autor Contribuições

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações. Maria Mancini, Stephen T. Sonis e Juan Fernandez-Martinez são empregados por biomodelos, LLC. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Esta não alterou a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha, conforme detalhado on-line no guia para os autores.

Introdução

Apesar de sua frequência, gravidade e sintomático e de impacto económico, não há intervenção eficaz para a mucosite oral (OM) induzida por quimioterapia ou radioterapia regimes (CRT) utilizados no tratamento de cânceres de cabeça e pescoço (CCP) [1-4]. Clinicamente, a OM é caracterizado pela quebra da mucosa, resultando em extensas, ulcerações profundas, dor função de alteração grave, aumento do risco de infecção secundária, bacteremia e sepse, e necessidade expandida para alimentação de gastrostomia e cuidados de suporte ambulatorial e hospitalar. Praticamente todos os pacientes que recebem CRT para o tratamento de HNC desenvolver OM, pelo menos, moderado; mais de dois terços sofrem de formas graves da doença.

terapia padrão atual para mucosite é predominantemente enquanto paliativos focada no controle da dor e manutenção da nutrição. O único tratamento aprovado para mucosite até agora é palifermin (Kepivance®), e sua aplicação é limitada a mucosite em pacientes submetidos a regimes de condicionamento antes do transplante de células tronco hematopoiéticas [5].

A complexidade da mucosite como uma biológica processo só foi recentemente apreciado [6-8]. Tem sido sugerido que a condição representa uma interacção sequencial de células de mucosa oral e tecidos, as espécies de oxigénio reactivas, citocinas pró-inflamatórias, mediadores de apoptose, e factores locais, tais como a saliva e da microbiota oral. Afigura-se que as alterações iniciais associadas a toxicidade da mucosa induzida por radiação ocorrer dentro do endotélio e o tecido conjuntivo da submucosa [6]. Isto resulta em danos e ruptura da barreira epitelial, o passo mais importante no desenvolvimento de mucosite. função de barreira epitelial depende em grande medida as junções intercelulares nas apicais-a maioria dos domínios da membrana plasmática, ou seja, as junções apertadas (TJS) que regulam a permeabilidade paracelular através do epitélio em culturas de células em monocamada e

in vivo

[9 ].

identificaram e caracterizaram um novo péptido de ácido 21-amino derivados a partir de aminoácidos 77-97 da Proteína Antrum mucoso (AMP) -18, também conhecidos como gastrokine-1 (10-12) [GKN1 ], que foi inicialmente descoberto em células epiteliais da mucosa gástrica [10]. Ambos AMP-18 e o péptido de proteger contra e aceleram a recuperação de lesão da mucosa em modelos animais de OM induzida por radiação e /ou quimioterapia como utilizado no tratamento de pacientes com HNC [13, 14]. O péptido pode ser facilmente sintetizado, e apresenta uma estabilidade a longo prazo. Num modelo de rato de OM induzida por uma única dose de radiação para o focinho, péptido AMP administrada uma vez por dia, quatro dias antes da radiação e continuou a 10 dias mais tarde eficazmente evitada a perda completa do epitélio da língua observada em ratinhos irradiados determinado veículo (solução salina) [13 ]. Em modelos OM hamster estabelecidos induzido por uma única dose de radiação, radiação fraccionado, ou radiação fraccionado em conjunto com a cisplatina para simular tratamentos convencionais de HNC, administração subcutânea diária de péptido AMP retardou o aparecimento de eritema das mucosas, reduziram a severidade de ulceração e acelerado por via oral recuperação das mucosas em todos os três modelos, provavelmente, em parte, pelos seus efeitos anti-apoptóticos visto em culturas de células epiteliais e endoteliais [14].

em contraste com outros agentes que aliviam os sintomas ou actualmente trialed agora em uso para tratar mucosite oral, peptídeo AMP e humano recombinante (rh) AMP-18 parecem ter como alvo exclusivamente TJs que conectam células epiteliais adjacentes, aumentando o acúmulo de proteínas TJ, limitando suas perdas durante a lesão, e facilitando a formação de novos TJs após lesão barreira mucosa [12, 15]. Este efeito potenciador da TJ está intimamente associada com o rearranjo de actina perijunctional e formação de complexos de proteína ” polaridade “. AMP-18 parece atingir os seus efeitos terapêuticos por ligação ao receptor de gastrina /colecistocinina B (CCKBR) e activar múltiplas vias de sinalização, tais como MAPK, PI3K /AKT, RhoA, e PKCζ [13, 15, 16].

para continuar o desenvolvimento de péptido AMP como um agente terapêutico eficaz e segura, os seus efeitos sobre o crescimento de células cancerosas na definição de protocolos de terapia de radiação

in vivo

foram estudados num modelo de xenoenxerto utilizando células de carcinoma humano inoculado gerar tumores em ratos nus [14]. Nós relatamos que o tratamento de radiação focal reduziu significativamente o volume do tumor como esperado. Inesperadamente, a administração de péptido AMP adicionado de forma significativa para a inibição do crescimento induzida por radiação, o que demonstra a propriedade supressora de tumores de AMP-18 e outros nós observada anteriormente [11, 17, 18]. Em conjunto, estes resultados sugerem que o AMP tratamento péptido de OM não iria interferir com os efeitos terapêuticos de protocolos de radiação no tratamento de tumores da cabeça e pescoço, ou promover o crescimento de células cancerosas, mas em vez disso poderia sensibilizar as células de tumor à radiação.

neste estudo foram estabelecidos para determinar se AMP-18 poderia sensibilizar células HNC a agentes quimioterápicos, e também demonstram no mesmo animal, os efeitos benéficos de proteção da mucosa oral, juntamente com supressão do crescimento de células tumorais após radioterapia.

Materiais e Métodos

Materiais

quimicamente sintetizados AMP péptido (LDALVKEKKLQGKGPGGPPPK), um péptido codificado (GKPLGQPGKVPKLDGKEPLAK), e humano recombinante (rh) AMP-18 foram preparados por GenScript (Piscataway, NJ) tal como descrito anteriormente [13]. Resumidamente, rhAMP-18 é expressa e purificada como uma sua proteína de fusão

6-tag. A sequência de codificação de comprimento completo para-AMP-18 humano foi clonado num

E

.

coli

vector de expressão, pGSE3, e a proteína expressa foi purificada a partir de 5 L de meio de cultura por cromatografia de coluna de afinidade. peptídeo AMP e rhAMP-18 foram encontrados para ser igualmente eficazes no desencadeamento de respostas celulares conforme relatado anteriormente [13-15]. meio de cultura celular, soro fetal de bovino (FBS), penicilina e estreptomicina foram obtidos a partir de Gibco BRL, Life Technologies (Gaithersburg, MD). factor de necrose tumoral (TNF) -α foi adquirido a partir de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ), e outros reagentes de Sigma-Aldrich a menos que especificado de outra forma.

culturas de células

para investigar os efeitos do tratamento com o péptido de AMP ou de AMP-18 em células cancerosas expostas a cisplatina, duas linhas celulares estabelecidas humanos HNC que foram mostrados em estudos preliminares para exibir sensibilidade diferencial à cisplatina foram usadas: SCC-25 (American Type Culture Collection, ATCC CRL1628) (Manassas, VA), que é mais sensível do que SCC-61 [19]. A linha de células SCC-25 foi mantido no laboratório dos autores por 3 anos; células SCC-61 foram estabelecidas e autenticado pelo Weichselbaum

et al

. [20-22], recebeu como um presente, e mantida por 4 anos. As células foram cultivadas numa mistura 1: 1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco e meio F12 de Ham contendo 1,2 g de bicarbonato /L de sódio, 2,5 mM de L-glutamina, HEPES 15 mM e piruvato de sódio 0,5 mM, e suplementado com 400 ng /ml de hidrocortisona, 10% de FBS, penicilina (50 U /ml) e estreptomicina (50 ug /mL), a 37 ° C numa incubadora humidificada suplementada com 5% de CO

2. SCC-25 e as células SCC-61 (2 × 10

3 /poço) foram cultivadas em placas de 96 poços, durante 24 horas em meio contendo FBS a 1%, e foram, em seguida, deixada sem tratamento, expostas a cisplatina única (2 uM para SCC-25 células, 10 uM para células SCC-61), cisplatina, na presença de 2 ug /ml de péptido AMP, ou rhAMP-18 (dissolvido em solução salina tamponada com fosfato, PBS, veículo) durante 48 h. A viabilidade celular foi ensaiada através de reagente CellTiter-azul, utilizando um leitor de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT). As experiências foram realizadas em quadruplicado. Humano, adulto, (baixa concentração de) de cálcio, a temperatura elevada (HaCaT) queratinócitos da pele, uma linha celular não transformada utilizada para modelar epitélio escamoso estratificado normal da mucosa oral [23], foram obtidos a partir de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) e mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle com FBS, penicilina e estreptomicina como descrito [13] para 5 anos. Oral tert-2 queratinócitos imortalizados foram considerados como um modelo celular para comparar a cancro oral [24], mas a linha de células HaCaT foi escolhido porque ele tem sido mais amplamente utilizado para este fim.

Criação de Modelo de ortotópico HNC em ratinhos nus

Para estudar possíveis efeitos sinérgicos de peptídeo AMP em limitar o crescimento de células cancerosas, protegendo contra OM no mesmo animal, foi utilizado um modelo ortotópico de HNC. Tumores na língua foram gerados, seu tamanho foi avaliada usando um

in vivo

sistema de imagem (IVIS), ea extensão da OM induzida por radiação foi comparado entre os animais tratados com o peptídeo AMP ou veículo (controles). uso de animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care biomodelos ‘e Use Committee (12-1016-01). O Escritório do número de garantia Laboratory Animal Welfare é A4591-01.

Com base preliminares

In vivo

estudos, as células SCC-25 foram marcadas com um bioluminescente dupla lentiviral e vector imagens fluorescentes UBC-GFP -T2A-luciferase (LUC) (Sistema Biosciences, Inc., mountain View, CA), e injectado na lingual anterior para formar tumores. Estas células SCC-25 bioluminescentes, referidos como SCC-25-LUC, ative

seleção in vitro

de células positivas por citometria de fluxo de triagem usando proteína verde fluorescente (GFP) e monitoramento não invasivo da dinâmica celular utilizando um

in vivo

sistema de imagem (IVIS) (Perkin Elmer) para medir o tamanho do tumor. células SCC-25-luc foram classificados 3 vezes por BD FACSAria (BD Biosciences), de modo que as células positivas para GFP foram 95% (dados não mostrados). A sensibilidade e precisão de

in vitro

e

in vivo de monitoramento celular

oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais que necessitem de sacrificar animais e análise histológica. Além disso, correlações histopatológicas das alterações clínicas avaliadas no modelo têm sido amplamente documentadas [13, 25], de modo que a histologia não era parte do estudo atual.

camundongos atímicos (Foxn1

nu ) (idade de 6 a 8 semanas, peso corporal de 29,5 ± 2,0 g) foram adquiridos a Charles River Laboratories. Os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e 1 x 10

6 células SCC-25-luc em suspensão em 30 mL de 1x de HBSS foram injectados directamente no lingual anterior utilizando uma mL seringa 0,1 tuberculina com uma agulha de calibre 30, tal como descrito por Myers

et al

. [26]. Depois de 21 dias para permitir o crescimento do tumor, de um total de 32 ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos (8 murganhos /grupo) com base numa avaliação quantitativa do tamanho do tumor, tal como determinado pelo fluxo total de cada tumor medido por IVIS imagiologia [27].

O dia de randomização foi designado dia 0. Os animais do Grupo 1 não foram tratados, Grupo 2 os ratinhos receberam veículo (PBS), e Grupos 3 e 4 receberam péptido AMP a uma dose de 25 mg /kg uma vez por dia por via subcutânea através (SC) de injecção. No dia de estudo 4, os animais nos grupos 2 e 4 receberam uma dose única aguda de 30 Gy de radiação dirigida para a língua para tratar os tumores e induzir OM. O modelo isola o tecido-alvo (língua) com um escudo de chumbo, evitando assim a toxicidade sistémica. Após a administração da anestesia, os ratos foram irradiados com o uso de uma fonte de potencial de 160 quilovolt (18,75-MA) a uma distância focal de 15 cm, endurecido com um sistema de filtração de 3,0 milímetros al. O tratamento com o péptido de AMP ou veículo foi continuada durante 14 dias.

Foram anestesiados

Animais, as suas línguas suavemente extrudida utilizando uma pinça e fotografias foram obtidas para documentar a progressão do tumor. O crescimento do tumor foi avaliado e comparado nos dias 5, 8, 10 e 14, utilizando IVIS após a injecção de D-luciferina. Depois fotografias foram tiradas, OM foi marcado clinicamente, e os animais foram visualizados utilizando o sistema IVIS. Antes da imagiologia, os ratinhos foram injectados com 0,1 ml /20 g de peso corporal de 15 mg /ml de D-luciferina-K

+ substrato bioluminescente em PBS. Dez minutos após a injecção, os ratinhos foram anestesiados e colocados na IVIS® Lumina a máxima sensibilidade para a exposição não superior a 5 minutos, para detectar a bioluminescência, com um filtro de emissão aberta. imagens guardadas foram carregados no software de análise e cor escalas de estar Image® foram pareados com base no brilho máximo e mínimo (fótons /segundo /cm

2 /esterradiano). regiões idênticas de interesse foram sorteados para cada animal e fluxo total foi determinada em termos de fótons /segundo para cada região de interesse.

Oral A mucosite

O aparecimento e progressão da OM foi marcado clinicamente usando uma escala de seis pontos bem estabelecida: Grau 0, sem alterações. Grau 1, alterações na mucosa ligeiras caracterizada por áreas de eritema leve, mucosa intacta. Grau 2, mucosite leves definidos por áreas de eritema moderado a grave e necrose epiteliais superficiais de tal modo que pode haver formação de crosta suave, mas a base epitelial está intacta. Grau 3, mucosite moderados caracterizadas por formação de úlcera franca. Úlceras normalmente têm áreas de necrose com coloração amarelada associados /cinza com a formação de pseudomembrana. área cumulativa de ulceração ≤ 25% da área de superfície da língua. Grau 4, mucosite grave com formação de úlcera que afecta 25% a 50% da mucosa da língua. eritema marcada e formação pseudomembrana. Perda de flexibilidade. Grau 5, severa formação de mucosite úlcera de praticamente todas as áreas da mucosa em risco. A perda de mobilidade e flexibilidade [25, 28, 29]. Dezenas de 1 e 2 indicam estágios leves de mucosite. mucosite ulcerativa é característica de graus 3-5, com graus 3 e 4 representam estágios graves da doença. Imagens representativas desta escala são definidas na figura 1. Após a pontuação clínica visual, a fotografia foi tirada da mucosa oral de cada animal utilizando uma técnica padronizada. Na conclusão do experimento, as fotografias foram numerados aleatoriamente e marcado por dois observadores independentes, treinados que graduadas as imagens em forma cega utilizando a escala acima descrito (scoring cego). Para cada fotografia, a pontuação real cego baseou-se na média das pontuações dos 2 observadores. Apenas pontuação da avaliação cega, fotográficos foram relatados e utilizado para análises estatísticas.

Imagens representativas de mucosite induzida por radiação utilizada para pontuação são mostrados. Veja mais detalhes nos métodos.

Os animais foram pesados ​​e monitorados para diária geral de saúde. Em adição à dieta padrão, todos os animais receberam comida mole altamente saborosos nas suas gaiolas. mudança de peso grupo foi registada como uma variação percentual média de peso.

Sodium Dodecyl de poliacrilamida eletroforese em gel (SDS-PAGE) e Immunoblotting Ensaio de Caspase 3 Cleavage

Para determinar o papel da apoptose como uma conduta para diferentes efeitos AMP-18 em células epiteliais de cancro e normais HNC, caspase 3 clivada foi utilizada como um índice da apoptose das células e não transformada em comparação HaCaT e SCC-HNC 25 células expostas ao TNF-α utilizando imunotransferência. Para preparar lisados ​​celulares, as culturas foram lavadas e, em seguida, colhidas em PBS gelado por raspagem a monocamada com um levantador de célula. As células destacadas foram sedimentadas a 4 ° C e extraiu-se em gelo durante 30 min em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 1% de Nonidet P-40, 0,25% de desoxicolato de sódio, NaCl 150 mM, NaF 100 mM, 10 % de glicerol, EDTA 10 mM) contendo inibidores de protease e fosfatase (ortovanadato de sódio 2 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 50 ug /mL de antipaina, 1 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de leupeptina, e 1 ug /mL de pepstatina). Os lisados ​​celulares foram clarificados por centrifugação a 14000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA (Pierce).

Para os ensaios immunoblotting, 30 a 50 ug de proteína /pista foi resolvido por SDS-PAGE, transferidos para membranas Immobilon (Millipore, Bedford, MA), seguida de bloqueamento com 5% de albumina de soro bovino em TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20 a pH 7,5), e incubaram-se com anticorpos designados. Depois de incubação com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários, as bandas imunorreactivas foram visualizadas utilizando quimioluminescência (ECL, Amersham Biosciences). Quando sondado, manchas foram primeiro descascada com um tampão contendo Tris-HCl a 50, pH 6,8, SDS a 2%, e M de 2-mercaptoetanol 0,1. As imagens foram analisadas por densitometria. Os imunotransfer�cias mostrados na figura representam um dos pelo menos três experiências.

RNA Análise Microarray Comparando não transformada e células HNC Tratada com AMP-18

Para definir o impacto biológico diferencial e relevância do AMP- 18 sobre o tecido normal e tumoral, e para identificar genes alvos via putativos que podem mediar os efeitos terapêuticos dupla nós comparamos o seu efeito sobre a expressão gênica de não transformada cultivadas (HaCaT) ou células de carcinoma de células escamosas tratado com AMP-18.

Nós [13, 14] e outros [30-34] têm utilizado a pele não transformada humana imortalizada linha de queratinócitos HaCaT [23] para modelar o epitélio da mucosa oral e para comparação com as células cancerígenas escamosas de cabeça e pescoço, enquanto que por via oral imortalizada TERT-2 queratinócitos têm sido utilizados menos frequentemente para modelar a mucosite oral.

o ARN total foi extraído a partir de SCC-61 e células HaCaT, com ou sem tratamento de AMP-18, utilizando o kit RNeasy (Quiagen) de acordo com as especificações do fabricante. a integridade de ARN e concentração foram avaliados usando Agilent Bioanalyzer 2100. O ARN total foi transformado em cRNA biotinilado utilizando o Illumina® TotalPrep ™ -96 Kit de Amplificação de ARN (Ambion, cat no: 4393543). O cRNA foi hibridizada para Illumina matrizes HumanHT12v4 usando Illumina fornecida protocolos e digitalizados usando um Illumina HiScan na Universidade de Chicago laboratórios Genomics Core.

Usando dados de microarranjos de HaCaT e SCC-61 células obtidas em 2 horas e 24 horas após a exposição a AMP-18 (e sem controlos de tratamento), utilizou uma abordagem que otimizado um componente supervisionado inicial com posterior classificação hierárquica estatisticamente conduzido. Genes que eram mais discriminatória entre os dois grupos foram classificados de acordo com seu valor discriminatório, conforme definido pela relação de sua Fisher em que a precisão da previsão dos diferentes conjuntos reduzidos encomendados foram determinados utilizando um algoritmo de eliminação recurso recursiva para trás. Este procedimento eliminado genes redundantes ou irrelevantes para produzir o conjunto mais preciso de genes com o maior valor preditivo. Em seguida, avaliamos os genes mais diferencialmente expressos para atribuição doença, associação caminho, e ontologia gene usando software GeneAnalytics e testadas associações funcionais /fenotípicas usando VarElect [8, 35, 36]. Os 20 melhores genes diferencialmente expressos em SCC-61 e células HaCaT tratadas com AMP-18 para 2 h são apresentados na Tabela S1.

Análises Estatísticas

A mucosite foi marcado usando as fotografias cego, começando no dia 4, e em todos os dias depois disso. As diferenças estatísticas entre os grupos de tratamento foram determinadas usando o teste de Mann-Whitney Rank Sum e análise qui-quadrado com um valor crítico de 0,05. O efeito do tratamento com droga em comparação com mucosite de controlo de veículo foi avaliada de acordo com os seguintes parâmetros: 1. A diferença no número de dias de murganhos em cada grupo tinham mucosite grave (pontuação ≥ 3) foi analisado. Em cada dia, os animais foram pontuados (dia de avaliação), o número de animais com uma pontuação de mucosite cego ≥ 3 em cada grupo de tratamento foi comparado com o grupo de veículo. As diferenças foram analisadas num diário, bem como um modo cumulativo. O sucesso do tratamento foi determinada por um número estatisticamente significativo inferior de ratinhos com esta pontuação num grupo de tratamento com droga, comparativamente ao veículo, conforme determinado por análise de qui-quadrado. 2. Foram determinadas as diferenças soma de classes nas pontuações mucosite diárias em grupos de tratamento versus o grupo veículo. Para cada dia de avaliação as pontuações do grupo tratado com veículo foram comparadas com a dos grupos tratados usando a análise de soma de pontuação de não-paramétrico. O sucesso do tratamento foi determinada por uma diminuição estatisticamente significativa da pontuação no grupo tratado em dois ou mais dias entre o dia 4 ao dia 14. Uma ANOVA one-way ANOVA ou em fileiras foi usada para avaliar a área sob a curva para os pesos dos animais e medições IVIS. Os dados foram analisados ​​com o software Minitab (Minitab, State College, PA). Os grupos foram comparados por bicaudal

t

teste ou, por mais de dois grupos, por análise de variância. Consideramos

P

≤ 0,05 significativo.

Resultados

efeitos inibidores da AMP Peptide e rhAMP-18 em células HNC

Para investigar os efeitos da AMP peptídeo ou AMP-18 em células HNC em cultura, cabeça humana e carcinoma de células escamosas pescoço SCC-25 (Fig 2, painel a) e SCC-61 (painel B) As células foram deixados sem tratamento, expostos a AMP-18 (2 ug /ml), cisplatina (2 | iM para as células SCC-25, 10 uM para células SCC-61), apenas, cisplatina, na presença ou ausência de péptido AMP ou rhAMP-18. A viabilidade celular foi avaliada com os reagentes de ensaio de viabilidade celular CellTiter-Blue® (Promega), utilizando um leitor de microplacas. AMP-18 sozinho inibiu o crescimento de SCC-25 (P = 0,02) e por células de 10-15% SCC-61 (P = 0,04) (Figura 2). Cisplatina crescimento significativamente inibido de ambas as linhas de células: SCC-25 células por 25% e células SCC-61 em 50% em comparação com culturas de controlo (P 0,001). A adição de qualquer dos péptidos AMP ou rhAMP-18 amplificado a citotoxicidade de cisplatina por inibição do crescimento de SCC-25 células por 30% (péptido AMP, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03) e SCC-61 células por 65 % (P 0,05) e 75% (P 0,02)., respectivamente

SCC-25 (a) ou SCC-61 células (B) foram deixados sem tratamento, exposta a AMP-18 (2 ug /ml), cisplatina (2 | iM para as células SCC-25, 10 uM para células SCC-61), apenas, cisplatina, na presença de 2 ug /ml de péptido AMP, ou rhAMP-18 durante 48 h. A viabilidade celular foi ensaiada através de reagente CellTiter-Azul. As experiências foram realizadas em quadruplicado. Os valores são média ± SE. A adição de qualquer dos péptidos AMP ou rhAMP-18 amplificado a citotoxicidade de cisplatina por inibição do crescimento de SCC-25 células por 30% (péptido AMP, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03) e SCC-61 células por 65 % (P 0,05) e 75% (P 0,02), respectivamente

Crescimento Cancer AMP peptídeo tratamento aditiva Inibe com radiação

evidências anteriores de que peptídeo AMP poderia sensibilizar células cancerosas. à radiação num modelo de xenoenxerto [14] e duas linhas de células humanas HNC a cisplatina, em cultura (Figura 2), em conjunto com os nossos estudos em ratinhos e hamsters que o tratamento com o péptido tiveram efeitos clínicos benéficos em por radiação e induzida por cisplatina OM [ ,,,0],13, 14], levou-nos a perguntar se estes efeitos duplos de péptido AMP pode ser demonstrada num modelo ortotópico de HNC, no mesmo animal. Quatro grupos de animais foram estudados: 1. não tratada; 2. PBS (veículo) e radiação; 3. péptido amp; e 4. peptídeo AMP e radiação.

Para determinar o impacto do tratamento com o peptídeo AMP na progressão do tumor com e sem radioterapia, os tumores de todos os animais foram avaliados utilizando o sistema IVIS. Nos ratos não-irradiados, os tumores ortotópicos na língua cresceu progressivamente, e a administração do péptido da AMP não alterou significativamente o tamanho do tumor (Grupos 1 e 3) (figura 3). Nos dias 5 e 8 valores IVIS para não tratada (6,59 × 10

7 ± 9,6 × 10

6) e tratado peptídeo AMP (6,50 × 10

7 ± 8,67 × 10

6) não foram estatisticamente diferente, como também foi o caso nos dias 10 e 14, quando os valores IVIS para não tratada (1,78 × 10

8 ± 2,47 × 10

7) e peptídeo AMP tratado (1,61 × 10

8 ± 2,32 × 10

7) não foi diferente. Em ratos que receberam radiação (30 Gy), o tamanho do tumor, medido como média radiância IVIS, continuaram a crescer com PBS (veículo) tratamento (Grupo 2), mas manteve-se inalterado, com tratamento de péptido AMP entre os dias 5 e 8 e os Dias 10 e 14 ( grupo 4) (Fig 4). O tamanho do tumor (média ± SE) em ratinhos irradiados, dado péptido AMP em comparação com ratinhos que receberam PBS, foi significativamente reduzida (P = 0,03) quando avaliados nos dias 10 e 14 (figura 4). Esta observação sugeriu que o péptido AMP não interferiu com a capacidade de radiação focado para inibir o crescimento celular, mas em vez parado o crescimento das células cancerosas.

Um modelo ortotópico de cancro HNC foi estabelecida por inoculação de bioluminescente SCC-25-LUC células para a língua anterior de ratos nus. O tamanho do tumor nos diferentes grupos foi avaliado e comparado nos dias 5 e 8, bem como os dias 10 e 14 após a injecção utilizando IVIS da D-luciferina. Os ratinhos do Grupo 1 e Grupo 3 não foram irradiados, enquanto que os animais nos grupos 2 e 4 receberam 30 Gy no dia 0 do estudo. O tratamento com PBS (Grupo 2) ou péptido AMP (Grupo 4) foi administrado por injecção s. c. uma vez por dia. Nos murganhos irradiados, o tratamento com o péptido AMP foi associada com muito menor brilho IVIS comparação com o tratamento com PBS, indicando que o péptido AMP reduziu o crescimento do tumor. Imagens representativas IVIS de tumores da língua de 32 ratos são mostrados.

animais irradiados foram tratados com peptídeo AMP ou PBS, e IVIS brilho foi medido nos dias 5 e 8, e, em seguida, nos dias 10 e 14. médias ± sE foram comparados. Em ratinhos que receberam PBS, IVIS radiância pareceu aumentar entre os dias 5 e 8 e 10 e 14, ao passo que radiância em animais tratados com o péptido AMP foi inalterada entre os dias 5 a 14. Nos Dias 10 e 14, o tratamento com o péptido AMP significativamente reduzido o tamanho do tumor comparação com o tratamento com PBS (* P = 0,03). Em camundongos não irradiado, os tumores ortotópicos na língua cresceu progressivamente; administração de peptídeo AMP não se alterou significativamente o tamanho do tumor (não mostrado).

peptídeo AMP não apresentaram quaisquer efeitos adversos sobre o peso corporal. Os ratos em todos os 4 grupos apresentaram perda de peso depois de os tumores foram estabelecidos na língua, que foi mais pronunciado em animais irradiados (dados não mostrados).

Efeitos terapêuticos de péptido na AMP Induzida por Radiação A mucosite oral

de acordo com os resultados de estudos anteriores, o péptido de AMP mitigado mucosite oral desenvolvimento induzido por radiação [14]. Enquanto o controle irradiado (PBS) todos os animais desenvolveram mucosite ulcerativa (Grupo 2) durante o dia 12, apenas 37,5% dos animais tratados com AMP (Grupo 4) foram tão afectadas (P = 0,03), enquanto que no dia 11, ulceração da mucosa apareceu em 62,5 % no Grupo 2, mas nenhum dado péptido AMP (P = 0,003) (Figura 5). Assim, o péptido AMP atrasou o início da mucosite ulcerativa e impactado favoravelmente a sua duração.

A irradiação da língua e da mucosa oral foi seguido de tratamento diário com o péptido de AMP ou de veículo (PBS). mucosite oral ulcerosa que desenvolveu foi marcado como descrito em

Métodos

. A pontuação mucosite de 3,0 (linha tracejada) indica ulceração da mucosa que se correlaciona com a mucosite oral humana significativos. Os animais tratados com o veículo atingiu uma pontuação de 3 no dia 12, enquanto que os ratinhos tratados com o péptido AMP não o fez. A mucosite pontuação foi significativamente menor nos dias 11 (* P = 0,003) e 12 (** P = 0,03), mas não Dia 13 (P = 0,1) em animais tratados com o péptido AMP em comparação com os que receberam o veículo. Os valores são médias ± SE.

AMP-18 inibido apoptose em HaCaT mas não em células HNC

Os recentes resultados de nossos estudos [10-15] e outros [17] sugerem que AMP-18 tem efeitos pleiotrópicos. AMP-18 estimula o crescimento e é anti-apoptótico em células epiteliais, incluindo queratinócitos HaCaT [13]. É também parece funcionar como um supressor de tumores [37], possivelmente por induzir a apoptose [38], a inibição da transição epitelial-mesenquimal (EMT) e migração de células de cancro [39], e /ou induzir a senescência celular [40]. Na verdade, a expressão de AMP-18 é regulada negativamente ou ausente em tecido gástrico câncer [11, 17, 18], e diminui como gastrite crônica progride para atrofia e metaplasia [40, 41].

Para determinar se a apoptose podia

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