Abstract

A mTOR é aberrante estimuladas em muitas células cancerosas, incluindo pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC), e, portanto, é um alvo potencial para a terapia. No entanto, o eixo /S6K mTORC1 também medeia loops de feedback negativo que atenuem sinalização através do receptor de insulina /IGF e outros receptores de tirosina-quinase. Supressão destes laços feed-back libera o excesso de ativação de vias a montante que potencialmente contrabalançar os efeitos antiproliferativos de inibidores de mTOR. Aqui, demonstramos que o tratamento de PANC-1 ou MiaPaCa-2 células de cancro do pâncreas com inibidores de mTOR, quer de rapamicina ou local activo suprimida S6K e S6 fosforilação induzida pela insulina e o agonista de GPCR neurotensina. Rapamicina causou um aumento marcante na fosforilação de Akt em Ser

473, enquanto os inibidores-sítio ativo da mTOR (KU63794 e PP242) anulou completamente a fosforilação de Akt neste site. Por outro lado, os inibidores do local activo de mTOR causar um aumento acentuado na activação de ERK enquanto que a rapamicina não tem qualquer efeito estimulador sobre a activação de ERK. Os resultados implicam que a primeira e segunda geração de inibidores de mTOR promover a sobre-activação de diferentes vias pró-oncogénicos em células PDAC, sugerindo que a supressão de lacetes de re-alimentação deve ser uma consideração importante no uso destes inibidores para a terapia PDAC. Em contraste, a metformina aboliu a ativação mTORC1, sem excesso de estimular a fosforilação de Akt em Ser

473 e impediu a ativação ERK estimulados por mitógeno em células PDAC. A metformina induziu uma inibição mais pronunciada da proliferação do que um ou outro ou KU63794 enquanto a rapamicina, o inibidor de mTOR do local activo foi mais eficaz do que a rapamicina. Assim, os efeitos da metformina sobre Akt ea ativação ERK são notavelmente diferente de alostéricos ou ativo do local inibidores de mTOR em células PDAC, embora todos esses agentes fortemente inibida o eixo /S6K mTORC1

Citation:. Soares HP, Ni Y, Kisfalvi K, Sinnett-Smith J, Rozengurt e (2013) diferentes padrões de Akt e ativação comentários ERK em resposta à rapamicina, o Active-site mTOR inibidores e metformina em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (2): e57289. doi: 10.1371 /journal.pone.0057289

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de agosto de 2012; Aceito: 20 de janeiro de 2013; Publicação: 21 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Soares et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants P30DK41301, P01CA163200 e R01DK55003, Departamento de veteranos Caso Grant 1I01BX001473 e fundos do dotado Ronald S. Hirshberg presidente de pesquisa do cancro do pâncreas todos ER. (https://www.nih.gov/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é uma proteína-quinase altamente conservado evolutivamente que desempenha um papel fundamental na integração do factor de crescimento, nutrientes e estado de energia das células [1]. funções de mTOR como uma subunidade catalítica em dois complexos multiproteicos distintos, mTOR complexo 1 (mTORC1) e mTORC2. mTORC1, caracterizado por a subunidade reguladora de rapina, controla, pelo menos, dois reguladores da síntese de proteínas, as subunidade 40S proteína ribossómica S6 quinase (S6K) e o factor de iniciação da tradução eucariótica 4E (eIF4E) liga�o ao proteína 1, referidos como 4E-BP1 [1 ], [2]. O heterodímero da TSC2 supressor de tumor (tuberina) e TSC1 (hamartina) reprime sinalização mTORC1 actuando como a proteína de GTPase-activador para a proteína G pequena Rheb (homólogo de Ras enriquecido no cérebro), um potente activador da mTORC1 sinalização na sua GTP estado ligado [3], [4]. Fosforilação de TSC2 por Akt e /ou ERK /p90RSK suprime a sua actividade de activação de GTPase em direção Rheb, levando à activação mTORC1 [5]. mTORC1 é aguda e alostericamente inibida por rapamicina através da ligação a FKBP12. mTORC2, caracterizado por Rictor, não é inibida por tratamento a curto prazo com esse agente e fosforila várias proteínas quinases, incluindo Akt AGC em Sor

473 [6], [7]. A via mTORC1 desempenha um papel chave no receptor de insulina /IGF sinalização [8], [9] e é activada de forma aberrante em muitos tipos de cancro, incluindo o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), uma das doenças humanas mais fatais. Deste modo, as células expressam receptores PDAC insulina e IGF-1 e sobre-express de IRS-1 e IRS-2 [10] – [12] e PDAC (mas não normal) visor tecido activada (fosforilada) IGF-1R [13]. variações genéticas no sistema de sinalização IGF-1 têm sido associados a pior sobrevida em pacientes com PDAC [14]. A inactivação de p53, como pode ser visto durante a progressão de 50-70% de PDAC,-se-regula a via insulina /IGF-1 /mTORC1 [15]. A diafonia entre /IGF-1 dos receptores de insulina e receptor acoplado a proteína G (GPCR) sistemas de sinalização potentemente mTORC1 estimular, a síntese de DNA e proliferação celular num painel de células PDAC [16] – [20]. mTORC1 sinalização desempenha um papel fulcral na proliferação e sobrevivência de células PDAC [21] e é activado em tecidos de cancro pancreático [20], [22] – [24]. Consequentemente, mTORC1 emergiu como um alvo terapêutico atraente em PDAC e outros tumores malignos comuns.

Além de sinalização de promoção do crescimento, mTORC1 /S6K também medeia retroalimentação negativa que restringem a sinalização através do receptor de insulina /IGF e outras tirosina receptores de quinase através da fosforilação e da repressão transcricional do IRS-1 [25] – [30] e a fosforilação de GRB10 [31], [32]. Por conseguinte, a supressão da actividade mTORC1 por rapamicina impede inibitórios do IRS-1 fosforilações e degradação, aumentando assim a via PI3K /Akt activação em vários tipos de células de cancro [30], [33] – [35]. Estes estudos implicam que o potencial de actividade anti-cancro de rapamicina (ou análogos) podem ser contrabalançadas pela libertação de inibição do feedback de activação da via PI3K /Akt [25], [30], [33] – [35]. Além disso, a rapamicina inibe incompletamente 4E-BP-1 fosforilação [36] – [40]. Por conseguinte, a actividade anti-tumoral clínico de rapamicina e os seus análogos (rapalogs) tem sido bastante limitada em muitos tipos de cancro [41], [42], incluindo PDAC [43], [44]. Num esforço para atingir o mTOR mais eficazmente, novos inibidores de mTOR que actuam no catalítica local activo (active-site de inibidores de mTOR) foram identificados, incluindo PP242 [37], Torin [45], KU63794 [38] e os seus analógico AZD8055 [46]. Estes compostos inibem 4E-BP-1 fosforilação em locais rapamicina-resistente (por exemplo Thr

37/46) e bloquear a fosforilação de Akt em Ser

473 através da inibição da mTORC2. No entanto, os inibidores de mTOR do local activo também eliminar laços de realimentação que inibem a activação de PI3K [25] e, consequentemente, a sua eficácia terapêutica também pode ser diminuída pela activação de vias de montante que se opõem seus efeitos anti-proliferativos.

é também mTORC1 regulada negativamente pela metformina, o medicamento mais utilizado no tratamento da diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Metformina está emergindo como um potencial agente romance em quimioprevenção do câncer. Estudos epidemiológicos recentes ligada administração de metformina para a redução da incidência, a recorrência e mortalidade de uma variedade de cancros em doentes DM2 [20], [47] – [56], incluindo PDAC [54], [56]. Ao nível celular, estimula indirectamente a metformina (AMPK) activação ativada por AMP proteína quinase [57], embora outros mecanismos de acção têm sido propostos em concentrações muito elevadas deste biguanida. AMPK inibe a activação mTORC1 através da estimulação da função TSC2 [58] – [60], que conduz à acumulação de Rheb-PIB (a forma inactiva) e pela fosforilação directa de rapina, o que perturba a sua associação com mTOR, levando a dissociação do complexo mTORC1 [61]. A consequência precisa de supressão de laços de realimentação negativos mediados pelo eixo mTORC1 /S6K em resposta a metformina permanece mal definida e, em particular, não se sabe se a rapamicina, activa-site de inibidores de mTOR e chumbo metformina para sobre-activação de montante semelhante vias em células PDAC.

Aqui, demonstramos que o tratamento de PANC-1 ou MiaPaCa-2 células de cancro do pâncreas com inibidores de mTOR, quer de rapamicina ou local activo suprimida S6K e S6 fosforilação induzida por insulina, uma combinação de insulina e a neurotensina agonista de GPCR ou soro. Rapamicina causou um aumento marcante da fosforilação de Akt em Ser

473, enquanto os inibidores do local activo mTOR KU63794 e PP242 revogada completamente Akt fosforilação neste local. Uma característica saliente dos resultados aqui apresentados é que os inibidores do local activo de mTOR, em contraste com a rapamicina, causar um aumento acentuado na activação de ERK em células PDAC. Os resultados sugerem que os inibidores de mTOR primeira e segunda geração promover a sobre-activação de diferentes vias pró-oncogénicos em células PDAC, nomeadamente Akt e ERK. A metformina também aboliu a ativação mTORC1 mas sem excesso de estimular a fosforilação de Akt em Ser

473. Além disso, a metformina impediu a ativação ERK em resposta a agonistas de cross-falando em células PDAC. Nossos resultados demonstram que os efeitos da metformina sobre Akt ea ativação ERK são muito diferentes daqueles provocada por inibidores de mTOR alostéricos ou ativo do local, apesar de todos esses agentes fortemente inibida o eixo /S6K mTORC1.

Materiais e Métodos

cultura celular

as linhas celulares de cancro pancreático humano PANC-1 e MiaPaCa-2 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Estas linhas celulares abrigam mutações ativadoras no

KRAS

oncogene. As células foram cultivadas em Dulbecco Eagle Médium modificado (DMEM) com 2 mM de glutamina, 1 mM de Na-piruvato, 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° C numa atmosfera humidificada atmosfera contendo 10% de CO

2.

Western blot análise

culturas confluentes de PACA-2 células PANC-1 ou MIA cultivadas em 3 cm placas foram lavadas e depois incubadas durante 24 hr com DMEM contendo glucose 5 mM e FBS a 1%. As células foram lavadas duas vezes com DMEM contendo glucose 5 mM e incubou-se em meio isento de soro, durante 4 h e depois tratou-se como descrito nas experiências individuais. As culturas foram então directamente lisadas em 2 x tampão de SDS-PAGE da amostra [Tris-HCl 200 (pH 6,8), 2 mM de EDTA, 0,1 M de Na

3VO

4, 6% de SDS, 10% glicerol, e 4% de 2-mercaptoetanol], seguida por SDS-PAGE em géis de 10% e transferência para membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). As transferências de Western foram então realizadas em membranas incubadas durante a noite com os anticorpos indicados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de Tween-20. As bandas imunorreactivas foram detectadas com reagentes ECL (quimiluminescência melhorada) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Os anticorpos utilizados detectado o estado fosforilada da S6K em Thr

389, S6 pelo Ser

235/236, 4E-BP1 em Thr

37/46 e Tre

70, Akt em Ser

473 e Thr

308 e ERK1 /2 em Thr

202 e Tyr

204 ou os níveis totais destas proteínas.

Anchorage dependente de proliferação celular.

PANC -1 células (10

5) foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 35 mm em meio DMEM contendo 10% de FBS. Após 24 h de incubação a 37 ° C, os grupos de culturas foram incubadas com neurotensina e insulina, com ou sem metformina em DMEM contendo 0,25% de FBS ou rapamicina, ou metformina KU63794 em DMEM contendo 2,5% de FBS. As culturas foram então incubadas durante 4 d, e a contagem total de células foi determinado a partir de um mínimo de seis poços por condição usando um contador Coulter, após aglomerados de células foram desagregados por passagem da suspensão de células de 10 vezes por meio de um calibre 19, e, subsequentemente, uma agulha de calibre 21.

Materiais

DMEM foi obtida a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensina e insulina foram obtidas de Sigma Chemical (St. Louis, MO). A rapamicina, KU63794 e PP242 eram de R D Systems, Inc. Minneapolis. Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Rábano anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase e IgG anti-ratinho eram de GE Healthcare Bio-Sciences Corp. (Piscataway, NJ). Todos os outros reagentes foram da mais alta qualidade disponível.

Resultados

Estimulação da p70S6K e fosforilação S6 em resposta à insulina e neurotensina em células PDAC é completamente abolida pela rapamicina ou KU63794

Inicialmente, determinou-se a influência de rapamicina e KU63794 na fosforilação mediada por mTORC1 de S6K em células PDAC. A rapamicina é um inibidor alostérico de mTORC1 que actua através de FKBP-12 ao passo que KU63794 é um inibidor de ATP-competitivo altamente específico de mTOR que inibe tanto mTORC1 e mTORC2. As culturas de PANC-1 (Fig. 1) ou MiaPaCa-2 (Fig. 2), as células foram incubadas durante 2 h na ausência ou na presença de rapamicina (a 10 ou 100 nM) ou KU63794 (em 1 ou 5 uM). Em seguida, as culturas foram estimuladas com uma combinação de insulina (10 ng /ml) e a neurotensina agonista de GPCR (5 nM) durante 2 horas para induzir diafonia positivo [18], [20]. Fosforilação de S6K em Thr

389, um alvo direto de mTORC1, e fosforilação de S6 (Ser

235/236), um substrato de S6K, foi monitorado usando anticorpos específicos que detectam o estado fosforilada desses resíduos. A estimulação de ambos PANC-1 ou MiaPaCa-2 células com insulina e neurotensina induzida fosforilação robusto de S6K em Thr

389 e S6 (fig. 1 e 2). A exposição a qualquer rapamicina ou KU63794 completamente impedido o aumento da fosforilação destas proteínas em resposta à estimulação pela insulina e neurotensina tanto em células PANC-1 (Fig. 1) ou MiaPaCa-2 (Fig. 2). Verificou-se que os níveis totais de S6K S6 e não se alterou em resposta aos tratamentos. Os resultados indicam que os inibidores alostéricos ou local activo de mTOR potentemente bloqueou o eixo mTORC1 /S6K nas concentrações utilizadas nas células PDAC

culturas de células PANC-1, foram incubadas na ausência. (-) Ou na presença de KU63794 (Ku) a 1 uM ou 5 uM ou rapamicina (RAP) em 10 ou 100 nM durante 2 horas em DMEM contendo glucose a 5 mM, tal como indicado. Em seguida, as células foram estimuladas durante 2 h com 5 nM neurotensina (NT) e insulina 10 ng /ml (Ins) e lisadas com tampão de amostra 2 × SDS-PAGE. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos que detectam o estado fosforilado de S6K na Thr

389, S6 em Sor

235/236, 4E-BP1 em Thr

37/46 e Thr

70, Akt em Ser

473 e Thr

308 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. Imunotransferência com anticorpos que reconhecem S6K totais, S6, 4E-BP1, Akt e ERK foi usada para verificar que os tratamentos com células não alterou o nível total destas proteínas e confirmar carga igual de gel. Dobre aumento da ERK fosforilação foi quantificada utilizando V3.0 multi calibre e plotados como barras. Foram obtidos resultados similares em 3 ensaios independentes

As culturas de células de MiaPaCa-2 foram incubadas na ausência. (-) ou na presença de KU63794 (Ku) a 1 uM ou 5 uM ou rapamicina ( rAP) em 10 ou 100 nM durante 2 horas em DMEM contendo glucose a 5 mM, tal como indicado. Em seguida, as células foram estimuladas durante 2 h com 5 nM neurotensina (NT) e insulina 10 ng /ml (Ins) e lisadas com tampão de amostra 2 × SDS-PAGE. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos que detectam o estado fosforilado de S6K na Thr

389 (pS6K), S6 em Sor

235/236 (PS6), 4E-BP1 em Thr

37/46 e Tre

70, Akt em Ser

473 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. Imunotransferência com anticorpos que reconhecem S6K totais, S6, 4E-BP1, Akt e ERK foi usada para verificar que os tratamentos com células não alterou o nível total destas proteínas e confirmar carga igual de gel. Dobre aumento da ERK fosforilação foi quantificada utilizando V3.0 multi calibre e plotados como barras. Foram obtidos resultados similares em 3 ensaios independentes.

regulamento

Diferencial de sítios de fosforilação 4EBP1 em resposta a estimulação mitogénica, rapamicina e KU63794 em células PDAC

A fosforilação de 4EBP1 foi também monitorada pelos utilizando anticorpos 4E-BP1 site-specific que detectam p-Tre

37/46 ou P-Thr

70 em lysayes de PANC-1 (Fig. 1) ou MiaPaCa-2 (Fig. 2) células. Estas células apresentaram um elevado nível basal de 4E-BP1 em fosforilação Thr

37/46 que não foi ainda aumentada pela estimulação com insulina e neurotensina. No entanto, a estimulação de células reduziu a mobilidade de 4E-BP1 em SDS /PAGE, uma resposta sugestivo de aumento da fosforilação em outros locais. Na verdade, o tratamento de PANC-1 ou MiaPaCa-2 células com neurotensina e insulina acentuadamente estimulada 4E-BP1phosphorylation em Thr

70. A fosforilação constituve de 4E-BP1 em Thr

37/46 foi abolida por tratamento com KU63794 mas não foi afetada pela rapamicina a 10 ou 100 nM, de acordo com relatos de que a rapamicina e seus análogos não inibem 4E-BP1 fosforilação nestes locais em outros tipos de células. Em contraste, o sinal de fosforilação responsiva de 4E-BP1 em Thr

70 foi impedida por tratamento com quer KU63794 ou rapamicina a 100 nM. Verificou-se que os níveis totais de 4E-BP1 não se alterou em resposta aos resultados treatments.These revelou uma regulação da fosforilação pouco apreciado 4E-BP1 em resíduos diferentes em resposta aos sinais externos e demonstram que a rapamicina inibe indutível mas não constitutiva 4E-BP1 fosforilação em células PDAC enquanto que do local activo inibidores de mTOR suprimir a fosforilação de 4E-BP1 em todos os locais.

a rapamicina e KU63794 induzir excesso de estimulação de diferentes percursos de upstream em células PDAC estimuladas com insulina e neurotensina ou insulina isolada

a fim de determinar se os inibidores de mTOR alostéricos e local activo eliminar laços de realimentação que inibem a actividade de vias de sinalização a montante em células PDAC, examinou-se o efeito destes inibidores sobre a fosforilação de Akt em resposta à sinalização mitogénica em PANC células-1 e Mia PaCa-2. A estimulação destas células com insulina e neurotensina induziu um aumento acentuado na fosforilação de Akt em Ser

473 (Figs. 1 e Fig. 2). O tratamento com 10 nM ou 100 nM rapamicina promovido excesso de estimulação da fosforilação de Akt em Ser

473, consistente com a supressão do feedback do eixo mTORC1 /S6K laços. Em contraste, a exposição prévia ao local activo KU63794 inibidor de mTOR, que inibe tanto mTORC1 e mTORC2, bloqueou a fosforilação de Akt em Ser

473 em PANC-1 (Fig. 1) e células de MiaPaCa-2 (Fig. 2), em consonância com a noção de que mTORC2 é a principal proteína quinase que fosforila Akt em Ser

473 em células PDAC. KU63794 não impediu a fosforilação de Akt em Thr

308.

A via ERK /RSK, que desempenha um papel fundamental na proliferação de células PDAC também leva à ativação mTORC1 [5], [62]. Em células da mama e cancro da bexiga, a inibição do eixo mTORC1 /S6K por rapamicina activação de feedback induzido de ERK [63]. Consequentemente, foram examinados os efeitos de rapamicina e KU63794 sobre a activação de ERK em células PDAC. De acordo com estudos anteriores [16], [64], [65], a estimulação de qualquer PANC-1 ou MiaPaCa-2 células com insulina e neurotensina marcadamente activada ERK (ERK fosforilada em Thr

202 e Tyr

204 ), tal como ilustrado nas Figs. 1 e 2. Em contraste com os resultados obtidos em outros tipos de células [63], o tratamento com 10 ou 100 nM de rapamicina durante 2 h não alteram o nível basal ou estimulada a fosforilação de ERK em PANC-1 e células MiaPaCa-2 . Resultados semelhantes foram obtidos quando estas células foram tratadas com PDAC rapamicina durante 4 ou 24 h (resultados não mostrados). Em contraste, a exposição a KU63794 (1-5? M) aumentou o nível basal de ERK fosforilação e notavelmente melhorada a estimulação da fosforilação de ERK induzida por insulina e neurotensina tanto em células PANC-1 ou MiaPaCa-2. A quantificação dos resultados com ERK está ilustrada nos painéis inferiores das Figs. 1 e 2 (barras). Estes resultados demonstram que a rapamicina, um inibidor alostérico de mTORC1, e KU63794, um inibidor de local activo de mTOR, conduzir a sobre-activação de diferentes vias pró-oncogénicos em células a montante PDAC

Estimulação da PANC-1. células ou MiaPaCa-2 com insulina isolada induzida aumento robusto na PI3K /Akt /mTORC1 mas não induz aumento significativo da ERK fosforilada em Thr

202 e Tyr

204 (Fig. 3). Consequentemente, determinou-se os efeitos diferenciais de rapamicina e KU63794 representado na PDAC estimuladas com a combinação de insulina e neurotensina (Figs. 1 e 2) também podem ser produzidos quando as células PANC-1 e MiaPaCa-2 são desafiados com insulina sozinha. As culturas destas células foram incubadas durante 2 h na ausência ou na presença de rapamicina (10-100 nM) ou KU63794 (1-5? M) e, em seguida estimulado com insulina (10 ng /ml). Foram monitoradas fosforilação de S6K em Thr

389, S6 em Ser

235/236, Akt em Ser

473 e Thr

308 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. A exposição prévia a qualquer rapamicina ou KU63794 aboliu o aumento da fosforilação de S6K e S6, em resposta à insulina em células quer PANC-1 ou MiaPaCa-2 (Fig. 3). A exposição a rapamicina sobre-activada enquanto o tratamento com KU63794 abolida fosforilação de Akt em Ser

473 nas células PDAC estimulada por insulina. Rapamicina não produziu qualquer efeito detectável na ativação ERK em células un-estimulado ou tratados com insulina. Uma característica saliente dos resultados mostrados na Fig. 3 é que a exposição a KU63794 induziu um aumento acentuado na fosforilação de ERK em Thr

202 e Tyr

204. Estes resultados confirmaram que o inibidor alostérico de mTORC1 e o local activo inibidor do centro de mTOR promover a sobre-activação de diferentes vias de montante em células PDAC desafiados com insulina ou insulina e neurotensina, uma combinação que provoca a interferência entre os sistemas de sinalização de insulina /IGF e GPCR .

as culturas de PANC-1 (painéis superiores) e MiaPaCa-2 (painéis inferiores) foram incubadas na ausência (-) ou na presença de KU63794 (Ku) a 1 uM ou 5 uM ou rapamicina (RAP) em 10 ou 100 nM durante 2 horas em DMEM contendo glucose a 5 mM, tal como indicado. Em seguida, as células foram estimuladas durante 2 h com 10 ng de insulina /ml e lisadas com tampão de amostra 2 × SDS-PAGE. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e immunoblotting com anticorpos que detectam o estado fosforilada da S6K em Thr

389, S6 pelo Ser

235/236, Akt em Ser

473 e Thr

308 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. Immunoblotting com S6K total, o S6, Akt e ERK foi utilizado para verificar o carregamento igual gel. Dobre aumento da ERK fosforilação foi quantificada utilizando V3.0 multi calibre e plotados como barras. Resultados semelhantes foram obtidos em 3 experimentos independentes.

PP242, como KU63794, aumenta a ativação de ERK em células PANC-1 estimuladas com insulina e neurotensina

Em seguida, determinou-se o marcante sobre -activation de ERK pela local activo da mTOR KU63794 inibidor pode também ser produzido por um local activo inibidor de mTOR estruturalmente não relacionados. As culturas de PANC-1 foram incubadas durante 2 h na ausência ou na presença de PP242 (1-5? M), recentemente identificado um local activo inibidor de mTOR [37], e estimuladas por 2 h com insulina e neurotensina. Foram monitoradas fosforilação de S6K em Thr

389, S6 em Ser

235/236, 4EBP1 em Thr

37/46, Akt em Ser

473 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. Como mostrado na Fig. 4 A, a exposição prévia a PP242 aboliu a fosforilação de S6K, S6, 4EBP1 e Akt em células PANC-1. A característica chave dos resultados é que PP242, como KU63794, induziu um aumento acentuado na fosforilação de ERK em Thr

202 e Tyr

204 (Fig. 4A e quantificação na Fig. 4B). Porque PP242 é um inibidor de mTOR menos selectivas [66], determinou-se as concentrações de PP242 que promoveram a activação de ERK coincidem com aqueles que inibem a actividade mTORC1. Como mostrado na Fig. 4C, PP242 reforçada activação de ERK e S6 inibiu a fosforilação em concentrações quase idênticos

Um

, culturas de células PANC-1, foram incubadas na ausência. (-) Ou na presença de pelo PP242 1 uM ou 5 uM durante 2 h em DMEM contendo glucose a 5 mM, tal como indicado. Em seguida, as células foram estimuladas durante 2 h com 5 nM neurotensina (NT) e insulina 10 ng /ml (Ins) e lisadas com tampão de amostra 2 × SDS-PAGE. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos que detectam o estado fosforilado de S6K na Thr

389, S6 em Sor

235/236, 4E-BP1 em Thr

37/46, Akt em Ser

473 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. Imunotransferência com anticorpos que reconhecem S6K totais, S6, 4E-BP1, Akt e ERK foi usada para verificar que os tratamentos com células não alterou o nível total destas proteínas e confirmar carga igual de gel. Foram obtidos resultados similares em 3 ensaios independentes.

B

, As barras representam o aumento da ERK fosforilação induzida por insulina (Ins) e neurotensina (NT) em células com ou sem exposição prévia a PP242. A quantificação foi realizada usando V3.0 calibre multi

C,

culturas de células PANC-1 foram incubadas como no painel A, mas na presença de concentrações crescentes de PP242. As amostras foram analisadas para detectar o estado fosforilada da S6 pelo Ser

235/236 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. Immunoblotting com um total de ERK e S6 (não mostrado) foi utilizada para verificar a carga equivalente do gel. A quantificação foi realizada utilizando V3.0 multi Gauge.

D

, culturas de células PANC-1, foram incubadas na ausência (-) ou na presença de qualquer um KU63794 (Ku) ou PP242 a 5? M durante 2 h. Em seguida, as células foram estimuladas durante 2 h com 5 nM neurotensina (NT) e insulina 10 ng /ml (Ins) e lisadas com tampão de amostra 2 × SDS-PAGE. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos que detectam o estado fosforilado de ERK em Thr

202 e Tyr

204, Akt em Ser

473 e Thr

308. Immunoblotting com Akt total e ERK foi utilizado para verificar o carregamento igual gel.

Verificou-se que os inibidores de mTOR site-ativa KU63794 e PP242, em concentrações que marcadamente maior ativação ERK e fosforilação Akt inibida em Ser

473 não impediu a fosforilação de Akt em Thr

308 em células PDAC (Fig. 4D). Na verdade, o KU63794 inibidor de mTOR específica ligeiramente reforçada fosforilação de Akt em Thr

308, consistente com a supressão de loops de feedback que restringir a atividade PI3K (Fig. 4D). PP242 foi menos eficaz do que KU63794 no reforço da fosforilação de Akt em Thr

308, reflectindo muito provavelmente a inibição fora do alvo de PI3K [66]. Assim, os inibidores de mTOR site específicos do sítio ativo KU63794 e PP242 suprimiu a fosforilação de Akt em Ser

473, não diminuiu Akt fosforilação em Thr

308 e estimulou o excesso de ativação de ERK fosforilação em Thr

202 e Tyr

204 em células PDAC.

O mecanismo pelo qual os inibidores do local activo melhorar a ativação ERK não é bem compreendido. Nossos resultados não suportam a existência em células PDAC de um putativo mTORC1 /S6K /PI3K laço /feedback ERK, proposto em outros tipos de células [63], uma vez que a inibição potente do eixo /S6K mTORC1 por qualquer rapamicina ou everolimus não produziu overstimulation de ERK em células PDAC. Para fundamentar esta conclusão, células PANC-1 foram tratados com KU63794 ou PP242 e estimuladas com insulina e neurotensina, na ausência ou presença de A66 [67], um inibidor selectivo da subunidade catalítica 110α de PI3K. Como mostrado na Fig. 4D, a exposição a A66 não impediu aumento da activação de ERK em resposta à exposição a qualquer um ou KU63794 PP242. Nós corroborada que A66, na concentração utilizada, de forma potente PI3K inibida nas células PANC-1, uma vez que impediu fosforilação de Akt induzida por insulina em Thr

308, o resíduo chave na ansa de activação de Akt fosforilada por PDK1 dependente de PI3K.

a fim de obter mais conhecimento do mecanismo pelo qual o tratamento com KU63794 induz sobre-activação de ERK também determinado o efeito deste local activo inibidor de mTOR na activação de MEK, a quinase a montante, que fosforila ERK. activação MEK foi marcado por avaliar a fosforilação de Ser

217 e Ser

221 em sua alça de ativação. Como mostrado na Fig. S1, o tratamento de PANC-1 ou MiaPaCa-2 com células KU63794 marcadamente melhorada em MEK fosforilação induzida pela insulina e neurotensina. Coletivamente, os resultados demonstram que os inibidores de mTOR do local activo levou a MEK /ERK hiper-ativação através de um /loop de feedback independente de S6K PI3K em células PDAC.

padrões diferenciais de Akt e ativação ERK em resposta à rapamicina, everolimus, KU63794 e PP242 em células PANC-1 estimuladas com soro

Os resultados anteriores foram obtidos com células PDAC estimulados com mitógenos definidos que atuam através de receptores específicos. Para prolongar estas descobertas Também testámos se os padrões diferenciais de Akt e ERK activação são produzidos quando as células são estimuladas com soro fetal de bovino. As culturas de células PANC-1 foram incubadas durante 2 h na ausência ou na presença de rapamicina (100 nM), everolimus (100 nM), KU63794 (1 uM) ou PP242 (1 uM) e estimuladas com meio contendo soro fetal de bovino. Foram monitoradas fosforilação de S6 em Ser

235/236, Akt em Ser

473 e ERK em Thr

202 e Tyr

204. A exposição prévia a rapamicina, everolimus, ou KU63794 PP242 aboliu o aumento da fosforilação de S6 em resposta a soro (Fig. 5). A exposição a rapamicina ou everolimus sobre-activada enquanto o tratamento com KU63794 ou PP242 abolida fosforilação de Akt em Ser

473 em células PDAC estimulados com soro. A rapamicina ou everolimus não produziu qualquer efeito detectável sobre a activação de ERK ao passo que a exposição à KU63794 ou PP242 induziu um aumento acentuado na fosforilação de ERK em Thr

202 e Tyr

204 em células tratadas com soro (Fig. 5). Estes resultados corroboram que alostérico e inibidores do sítio do sítio activo de mTOR promover a sobre-activação de diferentes vias de montante em células PDAC sob uma variedade de condições experimentais, incluindo células desafiadas com insulina, a insulina e o agonista neurotensina GPCR ou com soro fetal de bovino fresco.

as culturas foram incubadas na ausência (-) ou na presença de 5 uM KU63794 (Ku), 5 uM PP242, 100 nM de rapamicina (RAP) ou 100 nM everolimus durante 2 h, em DMEM contendo 5 mM glicose, tal como indicado. Em seguida, as células foram estimuladas durante 2 h com de bovino fetal a uma diluição final de 2% (soro) e lisadas com tampão de amostra 2 × SDS-PAGE. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos que detectam o estado fosforilado de Akt em Ser

473, S6 em Sor

235/236, e ERK em Thr

202 e Tyr

204 . Como mostrado na Fig. Como pode ser visto na Fig.