Abstract
Introdução
Bio-repositórios são recursos inestimáveis para implementar pesquisa do câncer translacional e programas clínicos. Eles representam uma das ferramentas mais poderosas para os estudos biomoleculares de coortes clinicamente anotados, mas amostras de alta qualidade são necessários para gerar leituras moleculares fiáveis e estudos funcionais. O objetivo do nosso estudo foi definir o impacto do tempo de isquemia tecidual de câncer em RNA e DNA de qualidade e para a geração de xenoenxertos Derivado pelo paciente (PDXs).
Métodos
Cem trinta e cinco amostras de câncer de pulmão foram selecionados entre os nossos
biobanco
amostras institucionais. As associações entre diferentes quente (cirúrgica) e fria (ex-vivo) intervalos de tempo de isquemia e qualidade de RNA ou taxas de enxerto PDXs foram avaliados. qualidade RNA foi determinada por valores de número de integridade do RNA (RINs). fragmentos de tecido viáveis frescos foram implantados subcutaneamente em ratinhos NSG e serialmente transplantado
Resultados
RNAs com um RIN . 7 foram detectados em 51% da amostra (70/135), com valores de RIN significativamente menor (OR 0,08, P = 0,01) em amostras conservadas durante mais de 3 horas antes da criopreservação. Amostras de DNA de qualidade mais elevados tinham um alto RIN concomitante. Sessenta e três tumores primários (41 adenocarcinoma) foram implantados com uma taxa de enxertamento global de 33%. Ambos prolongado quente ( 2 horas) e ex-vivo tempo de isquemia ( 10 horas). Foram associados a uma taxa mais baixa enxerto (OR 0,09 P = 0,01 e OR 0,04 P = 0,008, respectivamente)
conclusão
qualidade RNA e taxa de enxerto PDXs foram prejudicados por vezes isquemia prolongada. coleta de tecido e processamento adequado reduzir a taxa de falha. No geral, NSCLC BioBanking representa uma modalidade inovadora, que pode ser executado com sucesso em ambientes clínicos de rotina, quando rigorosas Procedimentos Operacionais Padrão são adotadas
Citation:. Guerrera F, Tabbò F, Bessone L, Maletta F, Gaudiano M, Ercole E, et al. (2016) a influência do tecido Isquemia Tempo em RNA Integridade e xenoenxertos Derivados do Paciente (PDX) Enxerto Taxa de não-pequenas células Lung Cancer (NSCLC) Biobank. PLoS ONE 11 (1): e0145100. doi: 10.1371 /journal.pone.0145100
editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALY
Recebido: 04 de julho de 2015; Aceito: 28 de novembro de 2015; Publicação: 05 de janeiro de 2016
Direitos de autor: © 2016 Guerrera et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortes por câncer [1]. Não pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) é o subtipo mais comum, eo estadiamento clínico-patológico é considerada o padrão ouro para definir o prognóstico dos pacientes. No entanto, a definição correta de evolução clínica de cada paciente específico ainda é problemática [2]. Mesmo que na última década novas abordagens terapêuticas, incluindo terapias moleculares, foram introduzidas, a caracterização molecular-clínica abrangente para cada indivíduo permanece aplicável apenas a uma fração dos pacientes e limitada às políticas do provedor de seguro de saúde. Por último, mesmo nos melhores configurações, os resultados ainda são muito sombrio.
Existe um acordo avassaladora que para fazer avançar o nosso sucesso clínico, um mapa detalhado dos mecanismos patogênicos condução cancros do pulmão é absolutamente necessário. Para obter específica paciente e impressões digitais abrangentes a integração de várias modalidades de análise (por exemplo, genómica, transcriptomic, proteômica) e as amostras adequadas (por exemplo, amostras de tecido, plasma) [3] é necessária. Em última análise, o conhecimento de que vão surgir deverá ser rapidamente traduzida em protocolos de tratamento personalizado. Públicas bio-repositórios de amostras caracterizadas e clinicamente anotados molecularmente Acredita-se que representam uma ferramenta altamente valiosa para a concepção e execução de tratamentos inovadores e mais bem-sucedidas. Xenoenxertos
Uma vez que os esforços de bio-repositório estão associados ao paciente-derivados, seus valores aumentam enormemente. Na verdade, os modelos PDX representam a vanguarda em pesquisa translacional [4] e, quando associado ao seqüenciamento da próxima geração (NGS) analisa fornecer uma ferramenta inigualável. Uma vez que a taxa de PDX enxerto está ligada a várias variáveis, incluindo a natureza dos tumores, o estágio da doença e a qualidade de amostras de tecido, uma aquisição rápida dos tecidos e um manuseamento correcto de amostras frescas é absolutamente crítica.
Toward neste sentido, a transferência de espécimes cirúrgicos da sala de operações (OR) para o teatro patologia cirúrgica requer uma organização afiada, capaz de implementar Procedimento operacional rigorosa padrão (POP) dentro de uma rede multidisciplinar integrada [5]. Dado que uma transferência oportuna limita o tempo de isquemia ex-vivo, um esforço considerável deve ser dedicado a melhorar esta etapa crítica favorecendo a melhor preservação dos espécimes patológicos. Nosso objetivo foi definir o impacto do tempo de isquemia tecidual de câncer na qualidade das amostras de câncer de pulmão armazenado em nosso bio-repositório e como isso pode influenciar molecular de alto rendimento analisa e o desenvolvimento de novos modelos pré-clínicos in vivo.
Aqui nós descrevemos um protocolo para a recolha de tecido que prevêem a preservação imediata da peça cirúrgica usando um vácuo método de vedação dentro do estabelecimento ou, seguido por transporte de amostras a 4 ° C a patologia cirúrgica.
Métodos
A. Paciente Cohort Descrição
Foram analisados retrospectivamente espécimes de câncer de pulmão coletados de 135 pacientes submetidos à ressecção cirúrgica 2010-2012 com intenção curativa inicial. Os doentes tratados com protocolos pré-operatórios (
i
.
e
. Quimioterapia, radioterapia) foram incluídos. Dentro do biorrepositório combinado tecido pulmonar normal, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC), as amostras de soro e saliva foram adquiridos.
B. Consentimento Informado
Um dedicado consentimento informado, a respeito de armazenamento de amostras humanas, de uso geral na pesquisa e análise molecular foi desenvolvido. Particular ênfase tem sido dada às seguintes questões:
Objetivo do estudo
A participação voluntária
Recolha de dados clínicos e demográficos
privacidade e confidencialidade
Benefícios e riscos da participação
Re-contato para informações de acompanhamento e de pesquisa resultados retornam
a retirada do consentimento
projeto de pesquisa secundária
propriedade de amostra e de propriedade intelectual
bio-amostras e armazenamento de bio-fluido
Para cada paciente inscrito no protocolo biobanking, o consentimento informado por escrito foi coletado no pré-operatório pela assistir cirurgião do Departamento de Cirurgia Torácica e o paciente foi registrada no Registro BioBank. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Azienda Ospedaliera Universitaria, Citta ‘della Salute e della Scienza di Torino.
C. Protocolo de recolha de
As amostras de saliva foram coletadas no pré-operatório com Oragene • DNA (OG-500) para o armazenamento de longo prazo. Amostras de sangue (10 cc) foram peri-operatório adquirida em tubos BD Vacutainer (2 heparinizado e 2 tubos não heparinizado) e processados. PBMC, plasma e soro, foram colhidas e armazenadas adequadamente. A equipe de banco de tecidos foi alertado no dia anterior à cirurgia.
Os espécimes foram preservados e transferidos para o laboratório de patologia utilizando a embalagem a vácuo eo arrefecimento procedimento (VPAC) [6, 7]. Resumidamente, na OR, explantado espécimes cirúrgicos foram imediatamente colocados em beta-ray esterilizado sacos plásticos e vácuo selado usando a máquina TissueSAFE (Mod VAC 10, pela Milestone, Bergamo, Itália;. Www.milestonemedsrl.com), como procedimento padrão na nossa Instituição [8]. As amostras foram, em seguida, preservada e trazida para os laboratórios de patologia, em refrigerados (em C 4 °) caixa de plástico, e ainda armazenado a transformação prévia 4 ° C.
procedimentos histopatológicos de rotina foram integrados com o protocolo BioBanking (S1 FIG). Cada espécime foi orientada, medido e descrito, estando ciente de que a cobrança não afetaria o diagnóstico patológico. Em seguida, as massas tumorais foram excisadas e amostradas. Ao mesmo tempo, o tecido de pulmão normal foi tomada a partir de uma área não envolvido distai (Fig S2). fragmentos de tecido foram armazenados em diferentes meios de comunicação: em outubro (Sukura Finetek, Torrance, CA) para o corte de tecido congelado, RNA
depois
® Solução de Estabilização (Life Technologies) para extração de RNA e snap-congelados e, em seguida, mantida em -80 ° frigorífico. Por fim, os fragmentos de tecido pequena (2x2x2 mm) foram colocados num meio de congelação (59% de RPMI, 30% de FBS, 10% de DMSO, 1% de Pen-STREP) e depois armazenadas em azoto líquido. amostras de diagnóstico representativos foram submetidos a procedimentos de processamento histopatológicos de rotina. informações de pacientes relacionados (tempos de armazenamento e de criopreservação e clínicos, dados demográficos e histopatológicas) foram armazenadas dentro do Registro BioBank.
D. DNA /RNA Extração e avaliação da qualidade
DNA genômico foi extraído com o método de extração de fenol-clorofórmio padrão [9].
As amostras de tecido foram homogeneizados em Trizol e RNA foi extraído, como por instruções do fabricante. Para eliminar qualquer contaminação com ADN genómico, quando presente, as amostras de RNA foram sujeitas a desoxirribonuclease tratamento e re-extraiu-se usando o método de fenol-clorofórmio [10].
O ADN total e ARN foram quantificados com 2000c NanoDrop (Thermoscientific) instrumento e os razão de absorvância a 260 nm /280 nm e 260 nm /230 nm foram registadas. Os ARNs totais (1 ul) foram analisadas num Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) utilizando ARN Nano LabChips (Caliper Technologies Corporation, Hopkinton, MA). valores de integridade de RNA numéricas (RIN) foram estabelecidas como medidas empíricas de integridade do RNA.
E. Síntese de ADNc e qRT-PCR
O ARN total foi transcrito reverso antes em tempo real a amplificação por PCR. 1 ng de ARN total foi tratada com DNAseI recombinante,-RNase livre (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e sujeitos a transcrição reversa utilizando o sistema de síntese Superscript First-Strand para o kit de RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. RT-qPCR foi realizado com um iCycler Thermal (Bio-Rad), utilizando o iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) de acordo com as instruções do fabricante. As condições dos ciclos de PCR foram como se segue: 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 10 segundos, em seguida, 60 ° C ou 62 ° C durante 30 segundos. Para confirmar a especificidade de amplificação, os produtos de PCR foram sujeitos a análise de curva de fusão, a linearidade, e declive da curva padrão usando o software CFX (Bio-Rad). Todos os ensaios de PCR foram realizadas em triplicado
os níveis de expressão de ARNm foram avaliados por 3 diferentes genes de manutenção:. GAPDH, actina e HUPO. Os conjuntos de iniciadores foram projetados usando Primer3 (S1 Tabela).
F. Multiplex PCR
a integridade do ADN foi estimada por um PCR multiplex com um conjunto de 5 pares de oligoprimers desenhados para amplificar alvos de ADN diferentes (100, 200, 300, 400 e 600 pb) (Tabela S2) [11]. Os iniciadores foram adicionados em 1: 1: 1: relação de 2 para se obter os produtos de PCR com a mesma intensidade, após separação em gel de agarose. A amplificação de ADN foi realizada como se segue: pré-activação 7 min a 95 ° C (1 ciclo) seguido de 40 ciclos de: desnaturação de 45 segundos a 95 ° C, emparelhamento 50 s a 60 ° C, extensão de 1,30 min a 72 ° C com o ciclo de extensão final de 15 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de agarose (2% de agarose em tampão TBE a 1%).
L. Paciente xenoenxertos Derivados (PDX)
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ (NSG) ratos foram gentilmente cedidas por L. Shultz do The Jackson Laboratory e criados dentro do (MBC) Recursos Animais Molecular Biotechnology Center, sob rigorosa patógeno específico e oportunista livres (SOPF) condições.
o protocolo de animais para este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê animal da Universidade de Turim.
PDXs Resumidamente foram estabelecidos utilizando frescos ou congelados fragmentos de tecidos patológicos, somente quando material suficiente estava disponível para as análises de diagnóstico e moleculares de rotina. amostras de tumor-enxerto foram cortados em vários pedaços mm 2x2x2 (várias peças /amostra) em meio completo. De seis a oito semanas de idade foram anestesiados NSG primeiro (Rompun 0.05μl /g e Zoletil 1.6μg /g i.m.), e sua região dorsal foi esterilizado (70% de etanol). A incisão na pele (0,3 cm) Posteriormente, foi feito ao longo da região retronuchal dorsal linha média e uma pequena bolsa foi criada por dissecção romba. Vários fragmentos de tecido de tumor-enxerto (2-4) foram transferidos para cada bolsa subcutânea usando uma pinça sem corte-terminado. As bordas cortadas foram seladas com um clipe de metal único. Camundongos foram verificados regularmente até que se tornaram vigília. animais implantados foram alojados em grupos do mesmo sexo. crescimento dos implantes foi avaliada por palpação e massas tumorais quando necessários foram colhidas ( 1,5 cm
3). animais receptores foram verificadas regularmente e sacrificados em sinal precoce de aflição. Na colheita, os ratos foram sacrificados numa câmara de CO2 e tumorgrafts foram coletadas para avaliação histológica, os estudos moleculares, re-enxertia, ou snap-congelados em nitrogênio líquido.
H. Estudo resultados e Análise Estatística
Os dados categóricos são apresentados como número (percentagem,%), dados contínuos são apresentados pela sua mediana (intervalo interquartil, IQR).
O RIN foi calculado em todos os espécimes como substituto de preservação do tecido. A RIN de ≥7 foi definido como ponto de corte para executar RNA matrizes expressão microarray e analisa RNA-Seq.
PDX enxerto foi considerada bem sucedida quando massas tumorais foram gerados após pelo menos duas passagens e suas características patológicas foram confirmados por histologia e imuno-histoquímica. Pearson teste do qui-quadrado e exato de Fisher, quando apropriado, foram utilizados para avaliar as diferenças entre os grupos enxertados e não enxertados: dimensão do tumor, histologia, classificação do tumor, estágio TNM patológica, estado ressecção, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) , foram determinados presença de invasão microvascular e duração cirúrgica.
a influência dos tempos de isquemia tecidual na qualidade RIN e PDX sucesso enxerto foram os pontos finais primários do estudo. O
isquemia quente
tempo foi concebido como a duração total de cirurgia e
ex-vivo (frio) tempo de isquemia
foi definido como o intervalo de tempo entre a aquisição de espécimes no teatro cirúrgico ea momento da sua criopreservação
Como um segundo ponto final, avaliamos os níveis de expressão de RNA e integridade do DNA genômico em um subconjunto escolhido aleatoriamente de espécimes (
amostra
comando no STATA.): foram selecionados 3 amostras com baixa qualidade RIN e 3, com alta qualidade RIN entre cada isquemia aulas em tempo. resultados de expressão genética foram avaliadas como expressão absoluta em termos de ciclos de quantificação (CQ dizer). As diferenças entre os grupos foram investigados por meio do teste de Wilcoxon-Mann-Whitney. O ano de aquisição foi também analisada
Para efeitos de nossa pesquisa, agrupados casos em quatro classes de acordo com a ex-vivo tempos de isquemia:. ≤1 horas, 1-2 horas, 3-5 horas, 6 -9 horas e ≥ 10 horas.
A associação entre a qualidade do RNA (RIN de ≥7) ou taxas de enxerto PDX e grupos individualizados foi avaliada utilizando o modelo de regressão logística. Para evitar possíveis influências de confusão, foi realizado um modelo de logística multivariada ajustada de regressão incluindo as seguintes variáveis cirúrgicas e patológicas: subtipos histológicos (adenocarcinoma como referência), classificação tumoral (G1 como referência), patológica estágio TNM (Fase I como referência) e duração da cirurgia (horas, como contínua).
odds ratio (OR) e os intervalos de confiança de 95% (IC95%) foram fornecidas para cada modelo. Todas as análises estatísticas foram avaliadas usando STATA (versão 12.1).
Resultados
A. Aspectos clínicos e patológicos
Um total de 135 amostras de câncer de pulmão foram investigados. A tabela 1 resume suas características clínicas, cirúrgicas e patológicas. A idade média no momento da cirurgia foi de 69 anos (IQR 64-75), os pacientes foram mais freqüentemente do sexo masculino (92, 68%) e fumantes (106, 81%). A duração mediana cirúrgico (IQR 1-3) e tempo de isquemia mediana ex-vivo (IQR 1-6) foram de 2 horas. o tamanho médio do tumor foi de 3 cm (IQR 2-5) e as fases TNM tumor patológica foram como se segue: Estágio IA 32 (23%), IB 13 (10%), II-21 (15%), IIB 13 (10%), III-37 (27%) III-B 1 (1%), IV 18 (13%). Adenocarcinoma foi o subtipo mais comum histológica (89, 66%), seguido pelo carcinoma de células escamosas (31, 23%), carcinoma de grandes células (7, 5%), carcinóide (4, 3%), sarcomatoide (2, 2%) , adenoescamoso (1, 1%) e de células pequenas (1, 1%). De acordo com a classificação Travis adenocarcinoma [12], observou-se 44 adenocarcinoma (55%) acinar, 21 (26%) de sólido, 10 papilar, 3 mucinoso, 2 e 9 lepídico NOS. Noventa e cinco (70%) pacientes foram submetidos a lobectomia, 14 (10%) para bilobectomia, 13 (10%) à pneumonectomia e 13 à ressecção sub-lobar; margens de ressecção positivos foram observados em 13 casos (10%, 10 R1 e R2) 3.
B. RIN Qualidade
Um RIN ≥7 foi observado em 51% da amostra (70/135): a percentagem de amostras com uma elevada qualidade de ARN de acordo com o tempo diferente ex-vivo de isquemia é ilustrado na Fig 1A. eletroferogramas representativos mostram as medidas de integridade de RNA de 12 amostras representativas (Fig 2, painel inferior) obtidos a partir de amostras de cancro do pulmão fresco congelado inclinadas.
A- Percentagem de amostras adequadas para arrays de expressão gênica (número de integridade do RNA [RIN ] de ≥7) em diferentes momentos ex-vivo de aquisição (tempo desde a remoção cirúrgica à criopreservação) para ≤1 horas, 1-2 horas, 3-4 horas, 5-9 horas e ≥ 10 horas. Relação entre B- vezes ex-vivo de aquisição ( 1 e 1-2 horas, de excisão à criopreservação) e adequação para arrays de expressão gênica (número de integridade do RNA [RIN] de ≥7) e períodos de 2010, 2011, e 2012 .
eletroferogramas representante (Agilent 2100 Bioanalyzer) mostram integridade do RNA medido pelo número de integridade do RNA (RIN) de 12 amostras representativas (em baixo).
Usando um modelo ajustado multivariada que mostrou que as amostras armazenadas após intervalos diferentes exibir uma queda de valor RIN logo após 2 horas de ex-vivo de isquemia fria (isquemia): 3-4 horas (ou 0,08, p = 0,044), 5-9 horas (ou 0,15, P = 0,011) e ≥10 horas (ou 0,25, p = 0,022) (Tabela 2). Ao contrário, o tempo cirúrgico (isquemia quente) não influenciou a qualidade RNA.
Análise de regressão logística
multivariada em 135 amostras de NSCLC.
Não há diferença na proporção de amostras com RNA de alta qualidade foi demonstrada de acordo com o ano de armazenamento, histologia e grau do tumor: Fig 1B mostra a percentagem de amostras tumorais com RIN de ≥7 eo tempo de aquisição ex-vivo, de acordo com contratos biobancos. Inversamente, um estágio de alta pTNM foi associada com valores RIN baixos ( 7, P 0,05).
C. mRNA Expression Nível
Vinte e oito casos foram selecionados aleatoriamente para avaliar a qualidade mRNA, avaliando os níveis de genes de limpeza de expressão. Como mostrado na Fig 3A, os valores obtidos são Cq entre 18 e 37. Cq com mais de 25 ciclos foram observados nas amostras com RIN 4, enquanto que nas amostras com valores RIN dentro 4-10, estes genes podem eficientemente detectada com menos ciclos de (20 a 25 ciclos). As amostras com expressões mais baixas foram preferencialmente observado no grupo com ≥ 3 horas de tempo de ex-vivo isquemia.
A- Cq níveis de genes de limpeza em selecionados aleatoriamente 28 amostras representativas de todas as categorias de tempo de expressão. eletroforese B- Gel de 28 de DNA genómico amplificado com multiplex amplificação PCR em diferentes números de paires base (100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 600 pb).
D. Alto Peso Molecular (HMW) de ADN genómico de Integridade
As mesmas 28 amostras utilizadas para a determinação de ARN, também foram avaliados quanto à sua integridade do DNA genómico (Fig 3B). A presença de bandas em cada tamanho foi usada como um substituto da qualidade do ADN, considerando-se a amplificação por meio de 600 pb como o valor mais elevado do DNA qualidade. As amostras com menor RIN para cada grupo horizonte temporal teve também a má qualidade do DNA. qualidade do DNA observada parece ser semelhante em todos os intervalos de tempo de isquemia ex-vivo.
E. PDX Enxerto
Sessenta e três tumores primários (41 adenocarcinoma, 18 de carcinoma de células escamosas, 3 carcinoma de células grandes e 1 carcinoma sarcomatóide) foram implantados, com uma taxa global total de enxerto de 33% (21/63).
Os tumores com dimensões maiores ( 3 cm; 23/25 vs 16/38, P 0,001) e um estágio patológico maior (III-IV; 15/25 vs 13/38, p = 0,048) foram mais freqüentemente implantado. carcinoma de células escamosas (12/25 vs 6/38, P = 0,017) e tumor com o envolvimento margens de ressecção (R1-R2; 4/25 vs. 1/38, P = 0,064), também com mais frequência em vós implantada. Entre adenocarcinoma, histologia sólido foi associada com o enxerto bem sucedido (6/11 versus 7/27, P = 0,09). Por outro lado, a alta classificação do tumor (G3; 12/25 vs 15/38), positivo TIL (16/17 versus 30/34) e presença de invasão microvascular (4/23 vs. 13/38) teve freqüência similar na enxertada e grupos não-enxertada.
multivariada modelo ajustado mostrou a correlação entre ambos isquemia prolongada ex-vivo (isquemia fria por mais de 10 horas), tempo cirúrgico prolongado (isquemia quente mais de 2 horas) com um enxerto menor taxa (P = 0,047 e P = 0,008, respectivamente, Tabela 3)
análise de regressão logística
multivariada em 63 casos NSCLC
Ao contrário, histologia de células escamosas (OR 8,55;.. P = M 0,01) e estágio de alta tumor foram associados com o sucesso enxerto (OR 8,06; P = 0,053)
Nós investigado amostras de tumores congelados PDX taxa de enxerto.. Das 21 linhas PDX gerados, escolhemos 8 tumores e implantou as amostras congeladas primárias correspondentes colhidas no momento da cirurgia. Quatro dos oito amostras (50%) de forma eficiente cresceu, gerando uma linha PDX comparável com a recém-derivado.
Discussão
O objetivo do nosso estudo foi avaliar a qualidade global do tecido de espécimes de câncer de pulmão armazenado em nosso bio-repositório. Nós também teve como objetivo delinear a influência do tempo de isquemia em amostras de câncer de pulmão e como isquemia poderia influenciar molecular de alto rendimento análises e a realização de modelos pré-clínicos in vivo.
Os resultados do nosso estudo sugerem que (1) o valor RIN é significativamente influenciada pelo tempo de isquemia ex-vivo, classificação do tumor e estágio pTNM; (2) Derivados do Paciente taxa de enxerto xenoenxertos sucesso também está associada com baixo ex-vivo de isquemia-tempo, baixo tempo cirúrgico (tempo de isquemia quente) e histologia de células escamosas; (3) os níveis de mRNA housekeeping genes de expressão e de alto peso molecular (HMW) a integridade do DNA genômico estão relacionados com RIN marcar e podem ser usados como biomarcadores reprodutíveis para preservação de tecido.
Com a implementação de procedimentos operacionais padronizados (POPs) fomos capazes de criopreservação de 135 primárias espécimes câncer pulmonar com o objetivo de gerar um grande biorrepositório de alta qualidade, e sem comprometer o diagnóstico histopatológico. Cada passo neste processo é crítica: a lançar luz sobre o papel que é desempenhado por uma equipa organizada e uma avaliação de triagem correta da amostra no quarto Patologia. O sistema VPAC, já comprovadas para preservar a integridade de amostras, foi adoptado como um procedimento padrão de ouro, a fim de obter tecidos viáveis [6-8]. No entanto, enquanto no cancro da mama tecidos RNA, DNA e proteínas podem ser perfeitamente preservado para 24h [7, 13], nós aqui mostrou que os tecidos do pulmão são muito mais sensíveis a esse tempo. . Isto pode sugerir que a isquemia ex vivo podem influenciar a viabilidade celular e os resultados moleculares, dependendo da origem dos tecidos
Há um consenso geral sobre a importância da utilização de ARN intacto na análise da expressão do gene e de RIN 7 é considerado aceitável como valor de corte para amostras adequação [14,15]. Em nosso repositório, 51% das amostras demonstraram RIN 7, com uma tendência favorável ao longo dos anos. Este resultado encontra-se entre os relatados para o cancro da próstata (60-81% [16]), cancro do cólon (80% [17]) e os descritos no cancro pancreático (40% [14]). As explicações possíveis para estas diferenças podem ser devidas à heterogeneidade do conteúdo celular, degradação diferente de diferentes tecidos, a variabilidade inter-operador, etc. Embora vários factores podem afectar a degradação de ARN aumentada, a suposição de que o ex-vivo de isquemia-tempo está estritamente ligada com grau de degradação do RNA parece ser razoável. Aqui, uma diminuição na qualidade do ARN foi observado a partir de 3 horas após a ressecção cirúrgica. Este resultado está em linha com um relatório anterior sobre a degradação naturalmente no tecido pulmonar: os autores encontraram diminuição da estabilidade do ácido nucleico a partir de 5 horas após a cirurgia [18]. Da mesma forma, limitado tempo de isquemia ex-vivo parecia correlacionar-se com a integridade óptima RNA no câncer de cólon (6-16 horas) [17], o cancro da mama (3 horas) [19], o cancro da próstata (2 horas) [16, 20] e em tecido de cancro do pâncreas. tempo cirúrgico Long não afecta a integridade de ARN, como seria esperado se a isquemia do tecido era a única explicação do RIN diminuição. Além disso, os níveis de expressão de mRNA e integridade do DNA genômico HMW parecia estar parcialmente associado com pontuação RIN, mas mostrou qualidade redução menor quando correlacionada com a ex-vivo tempo de isquemia. Isto pode resgatar uma grande parte dos 49% de amostras com RIN inferior ( 7%), uma vez que pode ser utilizada para técnicas moleculares clássicos. Em nosso estudo, estágios de alta pTNM também foram associados com uma pontuação RIN reduzida. Uma possível explicação poderia ser a manipulação cirúrgica ea liberação RNase subsequente como forma postulada Bertilsson e Harveer sobre o câncer de próstata [20].
xenopatients derivadas de pacientes são considerados, atualmente, altamente confiáveis modelos pré-clínicos de rato. A criação desta ferramenta requer instalações de pesquisa sofisticados e apresenta desafios técnicos e logísticos, e foi recentemente avaliada como uma fonte fundamental de material biológico e informações terapeuticamente relevantes [21, 22]. O uso de amostras de tumor primário frescos e congelados derivados de um
Biobank
recurso demonstraram a viabilidade desta abordagem, particularmente quando diferentes esforços são colocados juntos em uma rede bem integrada. O nosso grupo aproveita implante direto em camundongos, por via subcutânea, de fragmentos de tecidos frescos ou congelados derivados de pacientes cirurgicamente ressecados. A taxa de enxerto de 33%, ainda substancialmente comparáveis com os já atestada (25% -35%) por outros grupos em um ambiente subcutâneo [23-25], resultou ligeiramente menor do que o esperado, considerando a maior propensão de modelo para o enxerto NSG. No entanto, observou-se uma percentagem bastante elevada (29%) de adenocarcinomas enxertados que geralmente resultam menos propenso a implantação em comparação com tumores de células escamosas. Isquemia influência do tempo na taxa de enxerto demonstrou que um cirúrgica período (quente) isquemia prolongada está negativamente associado ao sucesso do enxerto [25], em vez de tempo total (quente e frio). Outras características influenciam a taxa de enxertamento: dimensão do tumor ( 3 centímetros), fase patológica (III-IV) e histologia de células escamosas têm um impacto sobre a taxa de enxerto, o que sugere que as propriedades biológicas também intrínsecas do tumor desempenham um papel na determinação da PDX sucesso geração. O mesmo vale para a geração de PDX a partir de amostras de tumores congelados. A capacidade de re-gerar 50% da linha de PDX a partir de matérias criopreservados sugere que os diferentes elementos podem influenciar a biologia do tecido; no entanto destacar a possibilidade de voltar retrospectivamente no biobanco tecido e escolher tumores moleculares definidos específicas a fim de gerar linha PDX apropriada útil para
ad hoc
exames pré-clínicos.
Até o momento, nenhum estudo foram realizados comparando diferentes métodos de tecido preservação. No entanto, considerando a sua capacidade para preservar a morfologia celular, a integridade e a estabilidade epitopo ácidos nucleicos, foi utilizado o sistema de armazenamento de tecido para VPAC, especulando também uma influência positiva na taxa de enxertamento de PDX.
Tomados em conjunto estes dados indicam que a geração de um biorrepositório câncer de pulmão é uma abordagem viável e requer esforços de rede complexos que integrem diferentes competências de biologia médica. Assim, os protocolos bem desenhados são fundamentais para o bom e eficiente
Biobanks
. Patologistas, oncologistas, cirurgiões torácicos, enfermeiros, biólogos, técnicos, epidemiológicos e estatísticos médicos devem colaborar em um fluxo de trabalho operativa comum de assegurar não só exemplares de alta qualidade, mas também o protocolo de tratamento apropriado, correto armazenamento, coleta de dados epidemiológicos analisa em projectos de eficiência coordenados .
a nossa abordagem fornece a biorrepositório de uma preciosa coleção de amostras para investigação abrangente sobre NSCLC. Em particular, RNA de alta qualidade e DNA pode ser usado para técnicas de sequenciamento de próxima geração, tais como RNA-Seq, Whole exome Sequenciamento e Whole Genome Sequencing, mas também ácidos nucleicos com menor qualidade podem ser resgatados para as técnicas de expressão gênica padrão (ou seja, quantitativa transcriptase reversa reacções em cadeia da polimerase). Finalmente, a disponibilidade de amostras de tumores frescos e congelados representam um recurso inestimável para gerar xenotransplantes Paciente-Derived linhas (PDX) [26].
Conclusão
A estratificação molecular de NSCLC na recente era de “medicina de precisão” pôs em evidência a importância de manter a série de amostras de alta qualidade integrados com dados clínico-patológicas. Estes repositórios podem ser investigados por Next-Generation Sequencing e são obrigatórias para a geração de modelos pré-clínicos estáveis.
Aqui nós relatamos uma abordagem reprodutível e confiável para gerar um banco de tecidos para NSCLC, e nós fornecemos evidências sobre o valor crítico da qualidade dos espécimes para estudos posteriores. Na verdade, a qualidade do RNA e taxa de enxerto PDX foram prejudicados por tempo de isquemia prolongado, e assim, de forma correcta, monitorado e coleta de tecido bem orquestrada pode reduzir a taxa de falha.
No geral, NSCLC BioBanking representa uma modalidade inovadora que pode ser executado com sucesso em um ambiente clínico de rotina dentro de todas as instituições, mas requer validado Procedimentos operacionais Padrão.