Abstract

O câncer de próstata é a neoplasia maligna visceral mais comum em homens ocidentais e uma das principais causas de morte por câncer . O aumento da activação de NFkB os AKT e vias ter sido identificado como passos críticos na iniciação e progressão do cancro da próstata. GGAP2 (GTP de ligação e de GTPase proteína de activação 2) é uma proteína de múltiplos domínios, que contém um domínio N-terminal de Ras homologia (GTPase), seguido por um domínio PH, um domínio C-terminal de GAP e de um domínio de repetição anquirina. GGAP2 pode activar directamente a sinalização através de ambas as vias de AKT e NFkB e actua como um nó de diafonia entre estas vias. Aumento da expressão GGAP2 está presente em três quartos dos cancros da próstata. Mutações de GGAP2 têm sido relatados em linhas de células de outros tumores malignos. Nós, portanto, analisados ​​84 tecidos de câncer de próstata e 43 tecidos benignas da próstata para mutações somáticas no GGAP2 por sequenciação directa dos clones individuais derivados dos domínios GAP e GTPase de tecido normal e tumoral. Em geral, metade dos cancros continha clones mutantes de domínio GAP e em 20% dos cancros, 30% ou mais dos clones eram mutantes no domínio GAP. Surpreendentemente, as mutações foram heterogêneos e nonclonal, com múltiplas mutações diferentes estar presente em muitos tumores. Descobertas similares foram observados na análise do domínio GTPase. GGAP2 proteínas mutantes tinham significativamente mais elevada actividade de transcrição AP-1 utilizando repórter sensível construções, quando comparado com a proteína de tipo selvagem. Além disso, a presença destas mutações foi associado com o comportamento clínico agressivo. A presença de alta frequência de mutações nonclonal de um único gene é novo e representa um novo modo de alteração genética, que pode promover a progressão do tumor. Análise de mutações no cancro tem sido usado para prever o resultado e orientar a identificação do alvo terapêutico, mas essa análise centrou-se sobre mutações clonais. Nossos estudos indicam que, em alguns casos mutações nonclonal alta frequência pode precisar de ser avaliada, bem

Citation:. Cai Y, Wang J, Ren C, Ittmann M (2012) Frequent heterogêneo missense mutações de GGAP2 no cancro da próstata : Implicações para a biologia do tumor, clonalidade e Análise de Mutantes. PLoS ONE 7 (2): e32708. doi: 10.1371 /journal.pone.0032708

editor: Sharon A. Glynn, da Universidade Nacional da Irlanda Galway, Irlanda |

Recebido: 01 de dezembro de 2011; Aceite: 31 de janeiro de 2012; Publicado: 28 de fevereiro, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento: Apoio a MI foi tornada possível através do Departamento de Cancer Research Program Defesa Próstata (W81XWH-07-1-0023; http: //. CDMRP .army.mil), o Instituto Nacional do Câncer para o Dan L. Duncan Cancer Center (P30CA125123; www.nih.gov) e pelo uso das instalações do Michael DeBakey Department of Veterans Affairs Medical Center (www.houston .va.gov). Suporte para YC foi tornada possível através de programa do Departamento de Defesa Prostate Cancer Research (W81 WH-07-01-0220; https://cdmrp.army.mil). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma variedade de alterações genéticas e ambientais têm sido descrita em cancro da próstata. Numerosos estudos descobriram padrões consistentes de alterações no número de cópias, tais como perda de 8p e 13q14 e ganho de 8q24 em cânceres de próstata clinicamente localizado e avançados [1], [2]. alterações epigenéticas, como metilação também são comuns no câncer de próstata. Em contraste, a maioria dos estudos até agora mostraram mutações pontuais clonais única pouco frequentes em cancro da próstata clinicamente localizado [2], [3]. Nos cancros da próstata mais avançada, mutações pontuais clonais de genes supressores de tumor, tais como PTEN [4] e p53 [3] são mais comuns, em contraste com a baixa frequência de mutação destes genes em cancro localizado [5], [6], mas ainda não são comuns em comparação com a maioria das doenças malignas. A activação de mutações em oncogenes clonais, tais como RAS, não são comuns no cancro da próstata em os EUA [3], em contraste com a mutação mais frequente observada em outros cancros humanos comuns tais como cancro do cólon e do pulmão. mutações do receptor de androgénio clonal são vistos no cancro da próstata resistentes à castração e parecem ser seleccionado para que um mecanismo pelo qual as células de cancro da próstata pode sobreviver no ambiente de baixo androgénio [3]. Assim, os dados disponíveis indicam que mutações pontuais clonais, em particular de oncogenes, são raras no cancro da próstata clinicamente localizado.

GGAP2 (também conhecido como Pike-A) é uma proteína G que tem uma actividade de GTPase forte, tal como esperado a partir do seu domínio de homologia RAS. Ele também contém um domínio GAP pode ativar a atividade GTPase, quer através de interacção intramolecular ou intermolecular. GGAP2 se liga a AKT activado e melhora fortemente a sua actividade e esta interacção é promovido por GTP [7] de ligação. Mostrámos que a AKT activada se pode ligar e fosforilar GGAP2 na serina 629, o que aumenta a ligação de GTP por GGAP2 e activação AKT [8]. Fosforilada GGAP2 também pode vincular a subunidade p50 de NFkB e aumenta a atividade transcricional NFkB. O aumento da activação das 3-fosfatidil-inositol-quinase /AKT e vias de NFkB ambos foram identificados como vias críticos na iniciação e progressão do cancro em uma variedade de malignidades humanas, incluindo cancro da próstata. Nós demonstramos significativamente aumentada GGAP2 expressão na maioria dos cancros da próstata humanos [8]. Quando GGAP2 é expresso em células de cancro da próstata que aumenta a proliferação, a formação de focos em progressão tumoral in vitro e in vivo. Assim, o aumento da expressão GGAP2, que está presente em três quartos dos cancros da próstata humanos, pode ativar dois caminhos críticos que têm sido associados ao início e progressão do cancro da próstata e podem aumentar a progressão do tumor in vivo.

Hu et al identificaram formas mutantes de GGAP2 no sarcoma, neuroblastoma e glioblastoma linhas celulares [9]. Estudos in vitro mostram essas formas mutantes têm reforçado a atividade GTPase e ativar mais fortemente AKT que o tipo selvagem GGAP2. Consistente com estas observações, os mutantes GGAP2 promover o crescimento de células de glioblastoma e transformação de células NIH3T3 [10]. Por isso, procurou-se identificar mutações de GGAP2 em amostras de câncer de próstata humanas. Foram encontradas altas frequências de mutações missense GGAP2 no cancro da próstata humana clinicamente localizado. Surpreendentemente, as mutações são heterogêneos e nonclonal, com múltiplas mutações diferentes estar presente em muitos tumores. A presença destas mutações foi associado com o comportamento clínico agressivo e aumento da AP-1 a actividade de transcrição. Assim, GGAP2 é o oncogene mais comumente mutado no cancro da próstata humana até agora, mas as mutações são heterogêneos em vez de clonal, o que implica a heterogeneidade clonal marcados em cancros da próstata humanos clinicamente localizados. A presença de alta freqüência de mutações nonclonal de um único gene é novo e representa um novo modo de alteração genética que pode promover a progressão do tumor.

Resultados

A análise da mutação do domínio GAP de GGAP2

Para determinar se GGAP2 é mutado no cancro da próstata inicialmente focada no domínio GAP, uma vez que esta região é um importante regulador negativo da atividade GGAP2. Analisamos cDNAs a partir de 15 tipos de câncer e 9 tecidos benignas da próstata a partir de amostras de prostatectomia radical. O domínio GAP foi amplificado e clones individuais foram isolados e seqüenciados. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Doze dos quinze casos de cancro tinham pelo menos um clone com uma missense GGAP2 e /ou parar mutações enquanto que apenas dois de nove casos benignos teve tais mutações. Os casos benignos tinha apenas um único clone mutante cada enquanto que até 42 por cento dos clones nos casos de câncer foram mutado. No geral 38 de 206 clones a partir dos tecidos de câncer foram mutante versus 2 de 137 em benigna. Esta diferença foi estatisticamente altamente significativa (p 0,001, qui-quadrado). Para descartar um artefato devido à transcrição reversa ou a possibilidade de que as transcrições mutantes podem ser transcritos preferencialmente ou tenham maior estabilidade analisamos diretamente o domínio GAP em DNAs genômicos de 46 tipos de câncer e 22 tecidos benignos. Como mostrado na Tabela 1, de 20 de 46 tecidos de cancro continha pelo menos um clone de mutante e tecidos nos 12 de 46 cancro mais do que 30% dos clones continham missense parar ou mutações. Apenas um único clone mutante foi identificado a partir dos tecidos benignos. Em geral, 52 de 334 clones a partir dos tecidos de cancro foram mutante versus 1 de 167 a partir dos tecidos benignos (p 0,001, qui-quadrado). Combinando cDNA e análise genômica, 32 de 61 casos de câncer continha clones com mutações no domínio GAP e em 14 casos 30% ou mais dos clones foram mutante.

Surpreendentemente, descobrimos que as mutações missense foram altamente heterogêneo . Não houve mutações missense recorrentes que envolvem mais de dois tumores. Em tecidos com vários clones mutantes havia apenas dois casos com dois clones mutantes idênticos. Existe variabilidade na distribuição das mutações de sentido trocado com as regiões entre os aminoácidos 640-660 e 700-710 com mutações relativamente mais frequentes mutações enquanto eram raros a partir de aminoácidos 540-570, mas não foi estatisticamente significativas “pontos quentes”. Em vários clones que encontramos 2 mutações no mesmo clone. Isto é semelhante à observação de Hu et [9] al, que encontraram múltiplas mutações em vários cDNAs GGAP2 mutantes isolados a partir de linhas celulares de sarcoma e glioblastoma. Em adição às múltiplas mutações missense, observou-se 3 mutações de paragem, todos na porção carboxilo terminal do domínio GAP (aa 703-709), que está localizado para o terminal carboxilo da proteína e GGAP2 iria resultar numa proteína truncada. De nota, Hu et al [9] encontraram uma truncagem no aminoácido 756 no cDNA GGAP2 da CRL-2098 células de osteossarcoma.

Dada essa heterogeneidade surpreendente considerou-se a possibilidade de que isso pode representar uma má incorporação artefato PCR. No entanto, encontramos apenas 3 mutações silenciosas entre 540 clones de tecidos de câncer (contra 90 missense ou stop), enquanto nos tecidos benignos encontramos 2 mutações silenciosas entre 304 clones (contra 3 mutações missense). A proporção de missense e parar contra mutação silenciosa foi muito maior no tecido canceroso do que no tecido benigno ea diferença foi estatisticamente significativa (p = 0,02, teste exato de Fisher). Isto é inconsistente com uma má incorporação aleatória. Para examinar melhor este ponto, determinou-se sistematicamente as conseqüências de mutações de transição na sequência de aminoácidos para todos os nucleótidos no domínio GAP. Nós só examinados transições desde 82% das mutações observadas eram mutações de transição (dados não mostrados). mutação de transição sistemática de cada nucleotídeo no domínio GAP renderia 273 missense, 15 mutações de parada e 162 mutações silenciosas. A diferença nas proporções de missense e parar contra mutações silenciosas observamos (90 e 3) em relação à distribuição previsto (288 e 167) foi altamente significativa estatisticamente (p 0,001, qui quadrado). Finalmente, considerámos a possibilidade de que os tecidos de cancro tiveram uma taxa de aumento da mutação alvo as primeira e segunda bases de cada codão, resultando em mutação sem sentido aleatória em todos os genes. Estudámos, portanto, 5 câncer e 5 tecidos benignos para mutações em β-actina. Não foram encontradas mutações em 32 clones de tecido de câncer e 36 clones de tecidos benignos. A proporção de missense e parar de clones em GGAP2 foi estatisticamente significativamente mais elevada do que em β-actina (p = 0,02, qui quadrado). Assim, as mutações heterogéneas observadas no domínio GAP de GGAP2 são realmente genuíno.

A análise da mutação do domínio GTPase de GGAP2

O domínio GTPase também é um regulador chave da atividade GGAP2. Estudámos, portanto, cDNAs de 23 tipos de câncer e 12 tecidos benignos para mutações no domínio GTPase. Os resultados foram muito semelhantes aos observados com o domínio GAP (Tabela 2). Quinze de 23 cancros continha mutações missense versus 1 de 12 tecidos benignos. Em quatro casos de cancro, de 40% ou mais de clones foram mutante, enquanto que apenas um único clone mutante foi observada no tecido benigno. No geral, de 28 188 clones a partir dos tecidos de cancro foram mutado versus 1 de 88 em tecido benigno (p 0,001, qui quadrado). O padrão global de mutações no tecido de cancro foi semelhante ao domínio GAP em que as mutações eram altamente heterogénea, tanto dentro de um único tecido de cancro e entre tecidos de cancro. Encontramos um clone mutante duplo, similar ao domínio GAP. De nota, não foram observadas mutações de parada. Dada a localização do terminal amino do domínio de GTPase, quaisquer mutações de paragem quase certamente produzir proteína inactiva uma vez que falta o domínio PH. Encontramos apenas 2 mutações silenciosas, uma em um câncer e um de tecido benigno. Em nove tecidos de 35 analisados ​​(26%) foram detectados vários clones contendo um polimorfismo anteriormente descrito silenciosa (Rs17852479) em L246, que não resultam em qualquer alteração de aminoácidos. Este polimorfismo ocorre em aproximadamente 28% dos indivíduos em populações previamente estudadas, semelhante à nossa descoberta. Um resumo da análise de mutação de GGAP2 é mostrada na Tabela 3.

GAP mutações no domínio Aumentar AP-1 transcricional Atividade

Nós mostramos que NFkB pode aumentar a expressão de FOS em células de cancro da próstata e, assim, a actividade de AP-1 [11]. Para testar se GGAP2 e GGAP2 mutante impactado transcrição AP-1 utilizou-se mutagénese dirigida ao local para conceber construções de expressão contendo 9 GGAP2 diferentes mutações missense. Estas construções mutantes ou de tipo selvagem ou os controlos vector vazio foram co-transfectadas com um repórter AP-1 em células 293T construir e a actividade da luciferase normalizada medidos. Como mostrado na Figura 1, tipo selvagem GGAP2 aumenta modestamente a transcrição AP-1 conduzido. Vários clones mutantes demonstraram melhoria acentuada de transcrição AP-1 no promotor de células transfectadas com o mutante quando comparado com o tipo selvagem GGAP2 (Fig. 1).

Os asteriscos indicam aumento estatisticamente significativa relativamente ao tipo selvagem (WT) GGAP2 por ANOVA (p 0,05). A média +/- SEM. Mutação e número de transfecções são mostrados.

Associação de mutações no domínio lacuna com parâmetros clínicos e patológicos da doença agressiva

Para determinar se a presença de missense ou parar mutações no domínio GAP foram associados com doença agressiva examinámos na proporção de tais clones mutantes em cancros da próstata com vários parâmetros clínicos e patológicos associadas com doença agressiva (Figura 2). recorrência PSA início após a prostatectomia radical está associada com morte por doença [12]. Cancros com recidiva precoce do PSA tinha 49 mutações entre 172 clones analisados, enquanto os casos sem recorrência PSA primitiva tinha apenas 34 mutações em 234 clones. Esta diferença foi estatisticamente significativa (p 0,001, qui quadrado). Coerente com isso, encontramos também aumentou significativamente proporções de mutações GAP em casos com metástases em linfonodos pélvicos (p = 0,027, qui quadrado), invasão de vesículas seminais (p = 0,027, qui quadrado), extensão extracapsular (p = 0,015, qui sq ) e maior pontuação Gleason (Gleason 5/6 Versus 7-10, p = 0,002, sq chi). Estes resultados suportam fortemente o conceito de que mutações no domínio GAP em GGAP2 pode promover a progressão do câncer de próstata.

A fração de clones contendo missense ou parar mutações para os casos com cada um indicado parâmetro clínico ou patológico é mostrado. Todas as diferenças entre as variáveis ​​patológicas e clínicas foram estatisticamente significativas. Especificamente: a recidiva precoce do PSA ( 2 anos pós-cirúrgico) versus nenhum ou recorrência tardia (p 0,001, qui quadrado); extensão extracapsular (ECE) versus sem ECE (p = 0,015, qui quadrado); vesícula seminal invasão (SVI) versus não SVI (p = 0,027, qui quadrado); pélvica metástase ganglionar (LN) versus sem metástases (p = 0,027, qui quadrado); Gleason 5/6 contra 7-10 (p = 0,002, qui quadrado).

Discussão

mutações clonais no câncer de próstata clinicamente localizado são genes supressores de tumores raros e geralmente envolvem (revisto em [3]). As mutações em oncogenes, como RAS são incomuns em homens americanos com câncer de próstata, embora mutações RAS foram identificados mais comumente em cânceres de próstata de homens japoneses [3]. Nós identificamos mutações frequentes de GGAP2 em câncer de próstata localizado. Em geral, metade dos cancros continha pelo menos um clone de mutante de domínio GAP e em 20% dos cancros, 30% ou mais dos clones eram mutantes no domínio GAP. Surpreendentemente, enquanto havia 10 mutações recorrentes diferentes estes só retornou 2-3 vezes cada um, em geral as mutações no domínio GAP foram heterogêneos e nonclonal. Descobertas similares foram observados na análise do domínio GTPase. Várias linhas de evidência argumentam que estes achado não é um artefato incluindo: a raridade da mutação em tecidos benignas da próstata; o domínio de mutações missense nos tecidos de câncer; a escassez de mutações silenciosas em tecidos de câncer ea ausência de mutações em β-actina

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Embora ambos superexpressão e mutação nonclonal de GGAP2 são comuns no cancro da próstata a relação entre estas duas alterações não é clara. Ambos podem potencialmente activar as actividades de siganaling GGAP2 no cancro da próstata, apesar de estudos detalhados seriam necessários para discernir se estas actividades são os mesmos para as diferentes mutações específicas. Em alguns casos, a sobre-expressão pode potencialmente aumentar as actividades biológicas associadas com mutação embora também seja possível que a mutação pode compensar a falta de sobre-expressão. Serão necessários estudos detalhados de expressão GGAP2, mutação nonclonal e marcadores de ativação da via em grande número de tumores para entender o impacto dessas alterações distintas no câncer de próstata.

heterogeneidade genética intratumoral envolvendo mutações pontuais de genes, como p53 ou K-RAS em diferentes regiões de tumores macroscópicos individuais foi observado no câncer, como câncer de cólon [13] e gliomas [14]. Deve notar-se que nos casos de todos os tumores representam um foco de tumor e 6 milímetros único, assim, cancros nossos foram todos de um foco de tumor único e é, assim, a heterogeneidade observamos é distinta desta heterogeneidade genética geográfica. No nosso caso, a heterogeneidade observada reflete a heterogeneidade no nível celular dentro de um foco de tumor único.

são os mutações observamos significativa? A frequência de mutação missense observada no domínio GAP em tecidos de câncer foi de 370 × 10

-6 por pb sequenciados e para o domínio GTPase 298 × 10

-6 por bp. Bielas et al [15] mostraram que a frequência da mutação aleatória em tecidos de câncer é de aproximadamente 2.1 × 10

-6 por bp em vários tipos de câncer. Assim, a frequência observada para a mutação sem sentido na GGAP2 é 100 vezes mais elevada do que a taxa de mutação de fundo, o que implica fortemente vantagem de crescimento selectivo para os clones mutantes. Nós também encontraram uma associação significativa entre a freqüência de mutação no domínio GAP e parâmetros clínicos e patológicos associados com doença agressiva, indicando que eles são clinicamente significativas. Deve notar-se que em 20% dos casos analisados ​​que mais de 30% dos clones de cancro foram mutante no domínio GAP. Dado que os tecidos analisados ​​eram aproximadamente 80% do cancro, em média, pelo menos 75% das células cancerosas que contêm um alelo mutante (assumindo que uma mutação por célula) em tais casos. Este é um valor mínimo, uma vez que não incluem mutações no domínio de GTPase e potenciais mutações em outras regiões de GGAP2, que foram relatados [9]. Assim, as mutações heterogéneas observada alta frequência pode contribuir directamente para o crescimento local do tumor em muitos casos. Além disso, as mutações mais potente pode promover metástases de clones celulares específicos. Há evidências que apoiam o conceito de que as mutações da p53 em cancros da próstata nonclonal primários pode dar origem a lesões metastáticas [16]. A alta frequência de diversas mutações nonclonal em GGAP2 pode proporcionar inúmeros clones potencial metastático.

A maioria dos estudos de mutações no câncer têm justificadamente focada em mutações clonais uma vez que é mais fácil ver o significado de tais mutações. mutações nonclonal heterogêneos não serão detectados por vários métodos analíticos ou não são ainda analisados, uma vez que não está claro se eles podem ser artefatos de PCR ou simplesmente mutações de passageiros. Os nossos resultados indicam que, em alguns casos de alta frequência de mutações heterogéneas nonclonal pode ocorrer e pode ser clinicamente importante. Resta ser determinada a frequência com que este é o caso com outros genes de supressão tumoral e oncogenes. Em alguns casos, os grupos foram analisadas cancros da próstata primários para a presença de mutação utilizando ensaios de polimorfismo de conformação de cadeia simples, seguida de sequenciação de bandas que migram anormalmente e encontrou taxas relativamente elevadas de mutação em alguns genes. Por exemplo, utilizando esta abordagem, as mutações em em plexina-B1 foram identificadas em 46% dos cancros da próstata primários [17], mas é difícil de determinar a percentagem exacta de células tumorais num tumor com que a mutação. Dado que as mutações são suficientemente frequentes para se obter uma banda distinta em ensaios de polimorfismo de conformação de cadeia simples que tem de ser bastante frequente embora não clonal. Isto está em contraste com as nossas descobertas em GGAP2 em que as mutações são muito heterogéneas. Assim, níveis variáveis ​​de mutações nonclonal, desde altamente heterogêneo para oligoclonais pode existir em câncer de próstata. Por outro lado, utilizando uma abordagem semelhante à nossa, Steinkamp et al [18] sequenciado mRNAs do receptor de androgénio a partir resistente castração metástase do câncer de próstata. Eles descobriram altos níveis de heterogeneidade nos mutações com muitas mutações estar presente em apenas 5-10% dos clones. Este achado é semelhante ao que observamos em GGAP2. O receptor de androgénio desempenha um papel central na patogénese e sobrevivência do cancro da próstata de modo existe uma forte pressão selectiva para reter as mutações que conduzem a actividade em face de terapias anti-andrógenos. Mostrámos que GGAP2 é frequentemente sobre-expressa no cancro da próstata e pode activar dois caminhos principais na progressão do cancro da próstata ou seja, a NFkB e vias AKT. Além disso, ele tem uma relativamente grande domínio de regulação negativa que podem ser susceptíveis a ruptura, o que pode torná-lo muito mais fácil de activar que alguns oncogenes tais como RAS que requerem mutações pontuais específicas. Análises adicionais serão necessários para determinar a extensão em que outros genes, incluindo genes supressores de tumores e outros oncogenes, têm alta frequência missense não-clonal ou parar mutações.

O potencial de alta frequência de mutação nonclonal acrescenta outra camada de complexidade à paisagem mutacional complexo de cancros comuns que tem sido revelado pelo [20], [21] em grande escala seqüenciamento [19],. É de notar, tem sido mostrado que mutações nonclonal em K-ras no cancro do pulmão tratadas com inibidores de tirosina-quinase impactar significativamente a sobrevivência [22]. Assim, será importante para determinar a extensão em que as mutações nonclonal ocorrer através da ampla gama de genes na próstata e outros tipos de câncer e se eles impactar a sobrevivência e resposta à terapia.

Materiais e Métodos

amostras de tecidos humanos

tecidos zona e câncer periféricos normais foram coletadas com consentimento informado por escrito dos homens submetidos à prostatectomia radical pelo Baylor College of Medicine Tissue Programa do cancro da próstata Banco e congeladas rapidamente, como descrito anteriormente [23]. Os pacientes tinham idades compreendidas entre 43-73 anos de idade e eram predominantemente caucasiana. Em todos os casos imagem pré-operatória e exame clínico revelou doença clinicamente localizada. estadiamento patológico dos espécimes de prostatectomia radical e linfonodos pélvicos mostrou aproximadamente 30% Stage 2 (T2N0); 50% Stage 3 (T3N0) e 20% Estágio 4 (Qualquer T, N1). Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito de doar tecidos para a investigação e os estudos foram aprovados pelo Baylor College of Medicine Institutional Review Board. tecidos benignos foram confirmadas como sendo livre de tecidos de cancro e de cancro contidos, pelo menos, 70% do carcinoma. Os ADN e ARN foram extraídos tal como descrito anteriormente [24], [25]. PSA recorrência foi definida como soro PSA . 0,2 ng /ml, com recidiva precoce sendo reincidência no prazo de 2 anos de cirurgia

A análise da mutação

O domínio GTPase N-terminal e do GAP C-terminal domínio do gene GGAP2 foram amplificados através de PCR e clonados no vector PCR TOPO 2.1 utilizando kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen). A PCR foi realizada utilizando Platinum Taq (Invitrogen) para minimizar a incorporação errada. Os iniciadores utilizados para a clonagem foram: para o domínio GTPase Forward: CCGCTCCATTCCTGAACTG; Reverso: GTTGCTGCTTGCGCAAG para o domínio GAP: Atacante: CACAGACAGCCAAAGCGA; Reverso: CCAAAAGCAGGAGAACGGTAG. DNAs foram sequenciados em ambas as direções e todas as alterações de pares de bases chamados pela máquina de ler da sequência foram confirmados por exame visual de vestígios de sequenciamento. Os clones com vestígios de sequenciamento de má qualidade não foram analisados. Não há novas variantes da linha germinal reportáveis ​​foram detectados.

mutagênese sítio dirigida

mutagénese de nucleotídeo único foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Stratagene). Resumidamente, os iniciadores com as mutações alvo foram utilizados em PCR para gerar as construções de expressão contendo 9 GGAP2 diferentes mutações missense. Os iniciadores utilizados são mostrados na Tabela 4. Dpn1enzyme foi adicionada a produtos de PCR durante 1 h a 37 ° C para digerir o ADN plasmídico molde antes da transformação. Os clones foram sequenciados para verificar as mutações.

luciferase ensaios repórter transcricional

luciferase ensaios de repórter de transcrição foram realizados como descrito anteriormente [11], utilizando células 293T. Tanto o AP-1 e vector repórter de luciferase de Renilla luciferase vector pRL foram obtidos da Stratagene (Cat # 219077 e # E2810). Os PRL repórter luciferase de Renilla vectores são destinados a utilização como repórteres de controlo interno, em conjunto com AP-1 para co-transfectar células 293T. transfecção transiente foi realizado em triplicado, em placas de 24 poços. A actividade de luciferase foi determinada e normalizada para a luciferase de Renilla sinal para cada amostra. ensaios independentes foram realizadas a partir de 3-9 vezes.

A análise estatística

Para comparar as taxas de mutação entre os grupos quadrados chi ou análise exato de Fisher foi realizado. A actividade da luciferase de clones mutantes foi comparado pela análise de variância (ANOVA). Para todos os testes p 0,05 foi considerado significativo

Reconhecimentos

A assistência de Patricia Castro é reconhecido agradecimento

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