Abstract

Fundo e visa

GLI1, como um fator de transcrição indispensável da via de sinalização Hedgehog, desempenha um importante papel no desenvolvimento do cancro do pâncreas (PC). ADN metiltransferases (DNMTs) mediam a metilação da quantidade de genes relacionados com o tumor. Nosso estudo teve como objetivo explorar a relação entre GLI1 e DNMTs.

Métodos

As manifestações de GLI1 e DNMTs foram detectados em tumores e tecidos normais adjacentes dos pacientes com PC por imuno-histoquímica (IHQ). células PANC-1 foram tratados por ciclopamina e GLI1 siRNA, enquanto que as células BxPC-3 foram transfectadas com superexpressão-GLI1 vector lentiviral. Em seguida, a expressão GLI1 DNMTs e foram analisados ​​por qRT-PCR e Western Blot (WB). Em seguida, levou imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para demonstrar se ligam GLI1 para DNMT1. Finalmente, MSP aninhada foi feita para avaliar os níveis de metilação do APC e hMLH1, quando a expressão GLI1 alterada.

Resultados

resultado IHC sugeriu as expressões de GLI1, DNMT1 e DNMT3a em tecidos de PC foram todos maior do que os tecidos normais adjacentes (p 0,05). Após expressão GLI1 reprimido por ciclopamina em ARNm e o nível de proteína (a sub-regulação de 88,1 ± 2,2%, 86,4 ± 2,2%, respectivamente), DNMT1 e ARNm DNMT3a e nível de proteína diminuiu de 91,6% ± 2,2% e 83,8 ± 4,8%, 87,4 ± 2,7% e 84,4 ± 1,3%, respectivamente. Quando ainda derrubou a expressão de GLI1 por siRNA

(

mRNA diminuiu 88,6 ± 2,1%, proteína diminuiu 63,5 ± 4,5%), DNMT1 e DNMT3a mRNA diminuiu 80,9 ± 2,3% e 78,6 ± 3,8% e proteína diminuiu de 64,8 ± 2,8% e 67,5 ± 5,6%, respectivamente. A sobre-expressão de GLI1 por transfecção do gene GLI1 (ARNm aumentou 655,5 ± 85,9%, e proteína aumentaram 272,3 ± 14,4%.), DNMT1 e ARNm DNMT3a e proteína aumentaram 293,0 ± 14,8% e 578,3 ± 58,5%, 143,5 ± 17,4 % e 214,0 ± 18,9%, respectivamente. ensaios ChIP mostrou proteína GLI1 obrigado a DNMT1 mas não para DNMT3a. Resultados do MSP aninhada demonstrou expressão GLI1 afetou o nível de metilação do DNA da APC, mas não hMLH1 no PC.

Conclusão

DNMT1 e DNMT3a são regulados por GLI1 no PC, e DNMT1 é seu gene alvo direto .

Citation: Ele S, Wang F, Yang L, Guo C, Wan R, Ke A, ​​et al. (2011) Expressão de DNMT1 e DNMT3a são regulados por GLI1 em Câncer pancreático humano. PLoS ONE 6 (11): e27684. doi: 10.1371 /journal.pone.0027684

editor: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 05 de julho de 2011; Aceito: 21 de outubro de 2011; Publicação: 14 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nacional Natural Science Foundation da China (81072005, 81172312) e Shanghai Science and Technology Committee (08411963000, 09JC1412200). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma doença altamente letal, que geralmente é diagnosticada em estado avançado para os quais existem poucos ou nenhum tratamento eficaz. Ele tem o pior prognóstico de qualquer grande malignidade (3% sobrevida em 5 anos) e é a quarta causa mais comum de morte por câncer anualmente em vários países. Apesar dos avanços na terapia cirúrgica e médica, pouco efeito tem sido feita sobre a taxa de mortalidade desta doença. Uma das principais características do câncer de pâncreas é a sua extensa invasão local do tumor e disseminação sistêmica precoce. Assim, é uma necessidade urgente para revelar os mecanismos subjacentes pelo qual as células de cancro do pâncreas se tornam invasivas e metastáticas.

cascata de sinalização Hedgehog é activado de forma aberrante numa variedade de tumores humanos incluindo cancro do pâncreas (PC) [1]. A activação da via de Hh requer a ligação de ligandos de Hh, tais como Shh, Ihh e Dhh, a receptor de Hh Patched (Ptch), libertando assim Hh molécula de sinalização Smoothened (Smo) a partir da inibição induzida por Ptch. Smo por sua vez, inicia a libertação do factor de transcrio GLI do citoesqueleto por um complexo de proteínas, facilitando assim a sua translocação nuclear, activadores GLI, em seguida, se ligam ao motivo GACCACCCA, como para a regulação da transcrição de genes alvo de Hedgehog, que estão envolvidos na regulação da proliferação celular, a determinação da célula-destino, sobrevivência celular, e epitelial para mesenquimal (EMT) e etc. Uma membrana glicoproteína humana Hedgehog proteína de interação (HHIP) pode ligar-se a todos os três ligandos e as funções de Hh para regular negativamente a actividade de hh via de sinalização [2], [3].

mudança de metilação do DNA é um dos principais contribuintes para a oncogênese humano [4]. Em células de cancro humanas, o padrão somática normal da metilação do DNA é alterado. Estas alterações incluem aumento da ilha CpG metilação, que medeia gene supressor de tumor silenciamento [4], e a hipometilação de ADN genómico, o que pode conduzir a instabilidade genómica [5], [6]. metilação do DNA citosina é catalisada e regulamentada por uma pequena família de metiltransferases de DNA (DNMTs), incluindo DNMT1, DNMT3a, DNMT3B e DNMT3L [7]. Embora as mutações específicas do cancro de DNMTs não têm sido relatados, diversos estudos sugerem que os genes DNMT são sobre-expressos em cancro humano e durante a transformação celular [8] – [11]. Diversos mecanismos parecem responsáveis ​​por DNMTs sobre-expressão, incluindo o controle do ciclo celular aberrante, aumentou mRNA e estabilidade da proteína, e DNMTs E2F-mediadas promotor de ativação [11] – [14].

Embora as evidências acima indicam que DNMTs e via de sinalização Hh ativa estão ambos envolvidos no desenvolvimento do câncer de pâncreas, pouco se sabe sobre a correlação entre DNMTs e membros da via de Hh. Aqui, este estudo foi realizado para investigar a expressão de GLI1 e DNMTs, ea correlação entre eles em câncer pancreático humano.

declaração Materiais e Métodos

Ética

Tecidos de câncer de pâncreas e pâncreas correspondentes não-cancerosas foram obtidos a partir Hospital Shanghai Décima Popular, onde obtivemos a aprovação ética do Comitê de ética Medicina e Ciências da vida.

As culturas de células e tratamento da toxicodependência

câncer pancreático humano a linha celular PANC-1 e BxPC-3 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), estreptomicina 100 ug /mL, e penicilina 100 U /ml a 37 ° C em 5% de CO2 e 95% de ar incubadora -humidified. células BxPC-3 foram cultivadas para transfecção lentiviral da superexpressão-GLI1 lentiviral vector. células PANC-1 foram plaqueadas a uma densidade de 4 x 10

4 células /cm

2 numa placa de seis poços, ciclopamina (Sigma, St. Louis, MO) foi dissolvido em etanol a 100% e depois diluiu fresco no dia do teste para as experiências de cultura de células. células PANC-1 foram tratadas com a concentração final de ciclopamina a 10 uM durante 24 horas.

A imuno-histoquímica (IHC)

Vinte pares de PC e correspondentes tecidos não-cancerosas pâncreas foram obtidos a partir de Xangai Hospital Popular décimo. secções de tumores de doentes pancreáticos foram de-paraffinised, re-hidratadas, tratou-se com tampão de citrato 10 mM a 95 ° C para recuperar antigénios, bloqueadas com BSA a 5%, e incubadas com anti-ratinho GLI1 (1:100), de coelho anti-DNMT1 ( anticorpo 1:100) ou coelho anti-DNMT3a (1:100; tudo a partir de Santa Cruz Biotech) durante a noite. As secções de tecido foram então incubadas com anticorpos secundários e reagente DAB (Gene Tech, Xangai, China). As secções foram então contrastadas com hematoxilina, em seguida, foram desidratados e visualizados com 3,3-diaminobenzidina (Gene Tech, Xangai, China). Os controlos negativos foram realizados em cada caso, por substituição do anticorpo primário com PBS.

RT-PCR quantitativo e PCR em tempo real (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de células PANC-1 usando Trizol reagente (Invitrogen, California, EUA), 1 ug de RNA foi transcrito reversamente em ADNc utilizando RT PrimeScript kit de reagente (Takara Bio, Shiga, Japão). Para determinar a quantidade de ARNm, o ADNc foi amplificado por PCR em tempo real SYBR com kit de Premix Ex Taq RT-PCR (Takara Bio, Shiga, Japão), e o gene de manutenção β-actina foi utilizada como controlo interno. Os ensaios de SYBR Green foram realizadas em triplicado num instrumento em tempo real 7900HT (Applied Biosystems, CA, USA). Os iniciadores utilizados para qRT-PCR foram listados (Tabela 1). Os níveis de expressão relativa foram calculados utilizando a 2

-ΔΔCT

método.

Western Blot (WB)

ligado celular total foi preparado em um 1 tampão de sulfato de dodecilo de sódio ×. As proteínas presentes na mesma quantidade foram separadas por 6% de SDS-PAGE e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após a incubação com anticorpos específicos para DNMT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou DNMT3a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou GLI1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou β-actina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), as membranas foram incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho ou anti-anticorpo secundário de murganho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e visualizados com quimioluminiscência aumentada.

inibição mediada pequeno ARN interferente de expressão GLI1

discrição pequeno RNA de interferência (siRNA) sequências para GLI1 foram concebidos e sintetizados por GenePharma alvo mRNA GLI1. A cadeia de codificação para GLI1 siARN foi 5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3 ‘. Uma sequência não relacionada siARN foi utilizada como um controlo. Nesta experiência, as células foram incubadas durante 12 h e foram transfectadas, a aproximadamente 60% de confluência com 50 nm ARNic em cadeia dupla utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os experimentos foram realizados 72 horas após a transfecção.

Lentivirus transfecção de superexpressão-GLI1 Lentivirus Vector

transfecção de Lentivirus da superexpressão-GLI1 lentiviral vector PGC-FU-GLI1 foram realizados como já relatado anteriormente [ ,,,0],15]. GLI1 ADNc humano foi adquirido a Abrir-Biosystem (EUA). A sequência de cDNA completa de GLI1 foi gerado por PCR, e inserido no PGC-FU-3FLAG vetorial (GeneChem Company, Xangai, China), que foi linearizado com

Age I

e

Nhe I

( Fig. S1, S2). O fragmento de 3320 pb resultante foi confirmada por sequenciação (Fig. S3). Lentiviral vector foram produzidos por co-transfectados para células 293T com construção auxiliar. Títulos de 2-5 × 10

7 TU /ml eram rotineiramente alcançado. células BxPC-3 foram transfectadas com o vector de expressão e GLI1 lentiviral foi criada por PCR em tempo real e análise de western blot.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP)

complexos imunes DNA-GLI1-proteína foram preparated como relatado anteriormente [15], após reticulado inversa, o DNA foi extraído com fenol /clorofórmio e precipitado. A presença do domínio do promotor DNMT1 e DNMT3a contendo motivos GLI1 em ADN imunoprecipitado foi identificada por PCR utilizando iniciadores (tabela 2). As condições de PCR para a região do promotor e DNMT1 DNMT3a foram: desnaturação de 30 segundos a 94 ° C, emparelhamento 30 s de alongamento, uma hora a 72 ° C. As temperaturas de recozimento foram listados na tabela 2. A amplificação da região do promotor e DNMT1 DNMT3a foi analisada após 40 ciclos. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

preparação de ADN

DNA foram extraídos por TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen, Beijing, China). Aproximadamente 500 ng extraído DNA foram bisulfite conversou e por EZ DNA metilação-Gold ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA, EUA) para fazer amostra de 10 mL. Purificado em coluna

Nested MSP

estado de metilação de ADN nas regiões promotoras do APC (adenomatous polyposis coli) e hMLH1 (mutL homólogo humano 1) foram determinados pelo método de MSP adicionalmente modificado como uma abordagem integrada em duas fases com os iniciadores descritos anteriormente [16], [17 ]. No passo um do MSP aninhada, os iniciadores foram concebidos para amplificar ambas as regiões genómicas metilados e não metilados. Os produtos foram igualmente diluídos 1:100 e sujeito ao passo de dois dos MSP aninhada com os iniciadores concebidos para reconhecer diferenças de sequência induzida pelo bissulfito entre regiões genómicas metilados e não metilados. As condições de PCR para o primeiro passo, foram as seguintes: 95 ° C ‘Hot Start × 5 min, em seguida 40 ciclos repetitivos de desnaturação (95 ° C x 30 s), emparelhamento (56 ° C x 30 s), a extensão (72 ° C × 30 s), seguido por uma extensão final de 5 min a 72 ° C. E que para o Passo dois eram: 95 ° C ‘Hot Start × 5 min, em seguida 30 ciclos repetitivos de desnaturação (95 ° C x 30 s), emparelhamento (59 ° C x 30 s para a APC, 60 ° C x 30 s para hMLH1 ), a extensão (72 ° C x 30 s), seguido por uma extensão final de 5 min a 72 ° C. produtos MSP foram separados por electroforese em géis de agarose a 2%.

Análise Estatística

Os dados quantitativos foram expressos como a média ± desvio padrão (SD). Dados em tempo real PCR foi analisado de acordo com as diferenças de expressão do gene alvo por parte do teste t pareado e foram 2

-ΔΔCT

transformado antes da análise. dados IHC foram analisados ​​utilizando o teste do qui-quadrado. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

GLI1, DNMT1 e DNMT3a foram regulados positivamente em tecidos de câncer pancreático humano

Para confirmar a papéis de GLI1 e DNMTs no desenvolvimento de cancro pancreático humano, primeiro analisou se as suas expressões foram alteradas em tecidos de câncer. Portanto, estudamos GLI1, DNMT1 e expressão DNMT3a em 20 tecidos de biópsia emparelhados dos pacientes com PC por IHC. Descobrimos que GLI1, DNMT1 e expressão DNMT3a foram maiores na maioria PC em comparação com os tecidos normais (14/20 contra 5/20, p = 0,004; 15/20 contra 6/20, p = 0,004; 13/20 contra 5 /20, p = 0,011; respectivamente; Figura 1). 14 de 20 casos de PC teve maior expressão de proteína GLI1, entre os quais 12 casos expressaram níveis elevados de proteína DNMT1 (p = 0,004) e 11 casos expressaram níveis elevados de proteína DNMT3a (p = 0,012).

O exame imunoistoquímico para GLI1, DNMT1, proteína DNMT3a foram realizadas em 20 pares de PC e tecidos normais adjacentes. imagens representativas são mostrados. tecidos normais adjacentes ou não exibiram coloração fraca para GLI1, DNMT1 DNMT3a e, no entanto, a incidência de todas as três proteínas imunorreactividade nuclear era muito mais elevado em tecidos de PC. Todas as fotomicrografias foram obtidas no × 200 ampliação.

ciclopamina e GLI1 siRNA tanto DNMT1 inibida e DNMT3a expressão

Para determinar se a atividade Hh afetou a expressão de DNMTs, usamos cyclopamine, um inibidor da via clássica de sinalização de Hh, para diminuir a expressão de GLI1. células PANC-1, que foram previamente relatados para expressar um elevado nível de GLI1 [15], foram tratadas com 10? M ciclopamina durante 24 h. Depois, qRT-PCR e WB foram tomados para analisar a expressão de GLI1 e DNMTs. DNMT1 e ARNm DNMT3a diminuiu 91.6.0 ± 2,2% e 83,8 ± 4,8%, respectivamente, quando GLI1 ARNm diminuiu de 88,1 ± 2,2%. DNMT1 e proteína DNMT3a diminuiu em 87,4 ± 2,7% e 84,4 ± 1,3%, quando a proteína GLI1 diminuiu em 86,4 ± 2,2% (Figura 2).

células PANC-1 foram tratadas com 10? M ciclopamina durante 24 horas, em seguida expressão relativa de GLI1, DNMT1 e ARNm DNMT3a foi avaliada por qRT-PCR (a, B, C), enquanto a expressão de GLI1, DNMT1 e proteína DNMT3a foi analisada por Western blot (D). A inserção mostra uma diminuição substancial na GLI1, DNMT1 e expressão DNMT3a. Os resultados foram normalizados para que a expressão de β-actina. Todos os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

Nós ainda desenhados e sintetizados GLI1 siRNA, então transfectado em linha celular PANC-1. PANC-1 transfectadas com uma sequência não relacionada siARN foi utilizado como um controlo negativo [18], e PANC-1 que aqueles tratados com Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado apenas como controlo em branco. 72 horas após a transfecção, qRT-PCR e WB foram tiradas para determinar a expressão de GLI1 e DNMTs. DNMT1 e ARNm DNMT3a diminuiu em 80,9 ± 2,3% e 78,6 ± 3,8%, respectivamente, quando GLI1 ARNm diminuiu de 88,6 ± 2,1%. DNMT1 e proteína DNMT3a diminuiu em 64,8 ± 2,8% e 67,5 ± 5,6%, quando a proteína GLI1 diminuiu em 63,5 ± 4,5% (Figura 3).

células PANC-1 foram transfectadas com ARNsi GLI1, 72 horas após a transfecção, expressão relativa de GLI1, DNMT1 e ARNm DNMT3a foi avaliada por qRT-PCR (a, B, C), enquanto a expressão de GLI1, DNMT1 e proteína DNMT3a foi analisada por Western blot (D). A inserção mostra uma diminuição substancial na expressão DNMT3a DNMT1 e após a interferência GLI1. Os resultados foram normalizados para que a expressão de β-actina. Todos os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

A expressão de DNMT1 e DNMT3a foram upregulated com GLI1 superexpressão

Para confirmar ainda mais a regulação da DNMT1 e DNMT3a por GLI1, que concebido e construído um vector de lentivírus que sobre-expressa GLI1, e transfectada em que BxPC-3 com a expressão GLI1 menor em linhas de células PC como relatado anterior [15]. As células transfectadas com vector vazio lentivírus foram utilizados como controlos negativos, enquanto que as células sem transfecção foram utilizadas como controlos em branco. 48 horas após a transfecção, qRT-PCR e WB foram tiradas para determinar a expressão de GLI1 e DNMTs nas três linhas celulares. DNMT1 e ARNm DNMT3a aumentou 293,0 ± 14,8% e 578,3 ± 58,5%, respectivamente, quando GLI1 ARNm aumentou 655,5 ± 85,9%. DNMT1 e proteína aumentaram DNMT3a 143,5 ± 17,4% e 214,0 ± 18,9%, respectivamente, quando a proteína GLI1 aumentou 272,3 ± 14,4% (Figura 4).

BxPC-3 foram transfectadas com PGC-FU-GLI1 , a expressão relativa de GLI1, DNMT1 e ARNm DNMT3a foi avaliada por qRT-PCR (a, B, C), enquanto a expressão de GLI1, DNMT1 e proteína DNMT3a foi analisada por Western blot (D). A inserção mostrou um aumento substancial na expressão DNMT3a DNMT1 e depois GLI1 sobre-expressão. Os resultados foram normalizados para que a expressão de β-actina. Todos os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

Confirmação de proteína GLI1 obrigado a região promotora do gene DNMT1

Temos, até agora, provou o papel de GLI1 em DNMT1 e DNMT3 expressão. No entanto, o mecanismo subjacente à regulação continua por ser elucidado. Para explorar se DNMTs estão diretamente regulada por GLI1 ou não, nós procurou o DNMT1 e promotor DNMT3a para os potenciais locais de ligação GLI1 à sequência de ADN de consenso 5′-GACCACCCA-3 ‘[19] ou 5′-TGGGTGGTC-3′ [20] e cinco locais de alta pontuação candidatos de alvos GLI1 foram encontrados no promotor de DNMT1 e seis em DNMT3a de. Cada local tem apenas duas diferenças de nucleótidos em comparação com 5’-GACCACCCA-3 ‘ou 5′-TGGGTGGTC-3’ (Figura 5). Chip foi levado para confirmar a relação entre a proteína delimitadora GLI e gene /3a DNMT1. DNA extraído a partir de células PANC-1 foram sonicadas para 100-1000 pb (Fig. S4) e como o modelo de ChIP-PCR. O resultado da electroforese de ADN revelou a banda de ADN prevista em ENTRADA, GLI1-Ab, e os grupos de controlo postive usando DNMT1 humano iniciador-C, e não na IgG e grupos de controlo negativo (Figura 6). Apenas de entrada e o controlo positivo mostrou a banda prevista utilizando humano DNMT1 iniciador-A, C-E e DNMT3a iniciador A-E, mas não em GLI-Ab, IgG, e grupos negativos (dados não mostrados). Como produto positivo amplificado por DNMT1 iniciador-C contém candidato GLI1 local de ligação 2 e 3 (Tabela 2 e Figura 5), ​​enquanto que o produto amplificado por DNMT1 iniciador-B contém candidato GLI1 local de ligação 2 foi negativo, e os resultados da análise da sequência mostrou que o sequências foram as mesmas que a do promotor do gene DNMT1 do sítio 3 (Fig. S5), sugeriu que GLI1 foi ligado ao promotor do gene DNMT1 do sítio 3 (GGCCTCCCA).

Duas linhas paralelas na parte superior do figura representada DNMT1 ou DNA DNMT3a, respectivamente (A, B), dentro do qual exons molduras cinzentas representados, quadros brancos representavam íntrons, e quadros pretos promotor representados. No promotor, quadros pequenos cinza marcadas com o número de 1 a 5 (A) ou 1 a 6 (B) representa o potencial de locais de ligação GLI1, que tem apenas dois nucleótidos diferença (sublinhado) a partir da sequência de consenso de ligação GLI1, GACCACCCA. Os iniciadores foram concebidos para amplificar a DNMT1 (A) ou a região do promotor DNMT3a (B) contendo o local GLI1 putativo de ligação. A posição eo comprimento dos produtos amplificated por cada um dos iniciadores foram mostrados.

Os lisados ​​a partir de células PANC-1 foram submetidos a cromatina imunoprecipitação pelo anticorpo anti-GLI1. cromatina sonicado foi utilizado como controle DNA de entrada (entrada). ARN polimerase II foi utilizado como controlo positivo (PC). IgG foi usada como um controlo aleatório (IgG) e β-actina AB foi usado como controlo negativo (CN). foram mostrados a banda de Chip-PCR produtos amplificados por DNMT1 Primer-C (i) e pela DNMT1 Primer-B (ii).

Os níveis de metilação do DNA de APC, mas não regiões promotoras hMLH1 mudou com GLI1 expressão

Quantidade de genes relacionados ao tumor foram encontrados para ser silenciado por metilação do DNA no PC, incluindo APC (polipose adenomatosa coli) e hMLH1 (mutl humano homólogo 1). Para aceder a se inibir ou aumentar a expressão de GLI1 também poderia levar a uma hipoglicemia ou hiper-metilação da APC e hMLH1 em PC, usamos MSP aninhada para avaliar o estado de metilação de PANC-1 com ou sem knockdown GLI1 e BxPC-3 com GLI1 ou sem sobre-expressão, respectivamente. Os resultados mostraram que o nível de metilação do DNA em células APC aumento BxPC-3 transfectadas com A sobreexpressão-GLI1 vector lentiviral em comparação com o controlo negativo, e foi inibida em células PANC-1 transfectadas com ARNsi GLI1 em comparação com o controlo negativo. No entanto, o nível de metilação do ADN da região promotora hMLH1 não foi significativamente alterado após a transfecção (Figura 7). Isso provavelmente porque a metilação do DNA é coordenado por uma família de DNMTs compreendendo DNMT1, 3a, -3b e -3L, talvez a mudança de apenas DNMT1 e 3a regulada por GLI1 expressão não foi suficiente para afetar os níveis de metilação do DNA de cada tumor- genes relacionados [21].

Os resultados do MSP aninhada de APC e hMLH1 em seis tipos de células PC, respectivamente, foram mostrados. B representado BxPC-3 células; B-G + representada BxPC-3 transfectadas com PGC-FU-GLI1 para fazer GLI1 sobre-expressão, e B-NC representou seu controle negativo; P representado PANC-1; P-G-si representada PANC-1 transfectadas com GLI1-siRNA e P-NC representou seu controle negativo. bandas positivas sob M e L representou o DNA metilado e não metilado dos genes correspondentes no painel direito, respectivamente.

Discussão

Neste estudo, descobrimos que GLI1, DNMT1 e DNMT3a são sobre-expressos em tecidos de PC em comparação com os tecidos do pâncreas não cancerosos correspondentes, então nós mostramos que DNMT1 e expressão DNMT3a alterada de acordo com a expressão GLI1 em linhas celulares PANC-1 e BxPC-3 por interferência GLI1 específico e transfecção de genes, , bem como método farmacológico

in vivo

. Mais importante, nós provou além de qualquer dúvida razoável de que GLI1 foi capaz de se ligar ao promotor do gene DNMT1 do sítio 3 (GGCCTCCCA) pelas experiências Chip. Finalmente, usamos MSP aninhada para demonstrar que a expressão GLI1 afetou o nível de metilação do DNA da APC, mas não hMLH1 no PC. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório demonstrou GLI1 como um fator de transcrição que regulava DNMT1 e expressão 3a, bem como o nível de metilação APC no PC, e DNMT1 é seu gene alvo direto.

GLI1, como um factor de transcrição da via de sinalização de Hh, é regulada positivamente na maioria dos tumores digestivos, incluindo PC [22], [23]. Até agora, apenas alguns alvos a jusante de GLI1 foram identificados [24]. Recentemente, relatou-se a ser envolvidas na invasão e metástase de PC, e tornou-se um novo alvo para o tratamento [25], [26]. No entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo real implícita na sua promoção de invasão e metástase no PC. Além disso, nós focada na acumulação de provas que demonstram que o carcinoma em vários órgãos, incluindo pâncreas, está associada com a metilação de ADN aberrante, em que DNMTs é o catalisador chave significativamente correlacionado com a acumulação de metilação de genes relacionados com o tumor, entre as quais algumas foram associados withcell proliferação, tais como APC, alguns estavam relacionadas com a reparação de danos no DNA, como hMLH1, alguns eram invasion- ou relacionados com a metástase, como TIMP-3, faísca, e CDH1, ou morte celular relacionados com tais como DAPK-1, assim desempenha um papel importante na carcinogénese multifásico da pâncreas de estágios precoces pré-cancerosas a progressão maligna [27]. Recentemente, verificou-se que a carga tumoral é significativamente reduzida com a diminuição dos níveis DNMT1

in vivo

, sugerindo que DNMTs mediadas por metilação do DNA está envolvido na carcinogénese pancreático [28]. Com base neste estudo e relatórios anteriores acima, é possível que GLI1-DNMTs cascata ajuda à invasão ou metástase através da promoção da metilação de alguns genes invasion- ou relacionada com metástase, e pode facilitar o crescimento do tumor, promovendo a metilação de alguma célula morte relacionada com o genes.

O nosso estudo mostrou que a expressão DNMT3a é regulada por GLI1 em câncer pancreático humano. No entanto, o mecanismo real na regulação da DNMT3a por GLI1 ainda é desconhecida. Nos últimos anos, muitos manuscritos têm sido relatado que algumas famílias de microRNA poderia alvo DNMTs em uma diversidade de cancros humanos [29] – [32]. Por outro lado, foi relatado que alguns microARN tais como microARN-29 famílias, foi suprimida por transcrição de c-Myc, hedgehog e NF-kappaB [33]. Com base nas evidências acima, é possível que HH-GLI pode regular DNMT3a através de alguns determinados microRNAs, que permanece para ser explorado.

Em nosso estudo, ensaios ChIP mostrou ligamento GLI1 para DNMT1 mas não DNMT3a. Notamos também que GLI1 elevado dnmt3a mais dobras de DNMT1. Nós pensamos que houve alguns possíveis mecanismos subjacentes da seguinte forma: Em primeiro lugar, GLI1 pode não regular DNMT3a diretamente, mas através de um determinado gene, o que pode ser uma quinase ou activina, e através de amplificação em cascata, de modo a levar uma maior eficiência regulador da DNMT3a por GLI1. Em segundo lugar, Hedghog-GLI1 pode regular directa ou indirectamente vários genes envolvidos em diferentes vias de sinalização, e dois ou mais destes genes também regulam DNMT3a e tem efeitos sinergéticos, de modo que, apesar GLI1 pode não regular DNMT3a directamente, mas elevaria DNMT3a mais dobras quando -o sobre-expressa. Para resolver esta questão, é necessário explorar mais genes alvo de Hedgehog-GLI1, e a sondar o crosstalk entre as várias vias de sinalização. Nós pensamos que a relação entre regulador HH-GLI1 e DNMTs não seria tão simples como já confirmado. Também são necessários mais estudos para analisar se o comportamento biológico de GLI1 no PC pode ser obtida por DNMTs reguladores.

O GLI1 recém-identificado /DNMTs eixo do conjunto de uma ponte entre a via de sinalização Hh e epigenética, o que ajudaria a elucidar o mecanismo molecular subalterno no desenvolvimento de PC, e pode fornecer novos alvos terapêuticos ou biomarcadores para o diagnóstico precoce.

Informações de Apoio

Figura S1.

identificaton de produtos de clones positivos em sobreexpressão-GLI1 construção vector lentiviral. Os produtos de ADNc foram inseridos GLI1 vector linearizado PGC-FU-3FLAG para construir PGC-FU-GLI1 plasmídeo depois de amplificado e purificado, em seguida, transformados em células competentes. Os transformantes foram identificados por PCR e electroforese em gel de agarose a 1,5%, os transformantes-1 e -4 foram mostrou como uma banda de 731 pb, que demonstrou ser clone positivo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s001

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Figura S2.

Identificação de expressão GLI1 no clone PGC-FU-GLI1 pela WB. PGC-FU-GLI1 é construído como um vector de expresso GLI1 lentivírus, que foi co-expressa com FLAG. (1) WB Peso Molecular Marker, com etiqueta 3-FLAG, fundido com o gene GFP (48 kDa). (5-8) da amostra depois de células 293T transfectadas PGC-FU-Gli1. (7) proteína de fusão GLI1-FLAG (122 KDa + 2 KDa = 124 kDa), expressão GLI1 certificado no plasmídeo PGC-FU-GLI1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s002

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Figura S3.

A análise da sequência de produtos de clones positivos em GLI1-superexpressão construção lentiviral vector. O fragmento de 3320 pb resultante foi confirmada por sequenciação que é o mesmo com a sequência da região expressão do gene GLI1 no GenBank (NM_005269.2)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s003

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Figura S4.

Electropheretogram de solução de cromatina sonicado. solução da cromatina sonicado em condições diferentes (100 W, 80 W e 60 W, respectivamente) foram submetidos a electroforese em 1,5% gel de agarose contendo etídio bromied

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s004

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Figura S5.

A análise da sequência de produtos de chip que amplificados por DNMT1 iniciador-C. O resultado mostrou que a sequência amplificada com iniciadores DNMT1-C é a mesma que a região promotora do gene DNMT1 contendo o sítio de ligação GLI1-2 e 3.

doi: 10.1371 /journal.pone.0027684.s005

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