Abstract
Fundo
Os perfis de expressão gênica global de células-tronco da próstata murino fetal adulto e foram determinado a definir os reguladores comuns e únicos cujos misexpression pode desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer de próstata.
Metodologia /Principais achados
um núcleo distintivo de reguladores de transcrição comum a ambos fetal e adulto próstata primitiva As células foram identificados, bem como moléculas que são exclusivas para cada população. Os elementos comuns às células progenitoras fetais e próstata adulto incluem perfis de expressão de Wnt, Shh e outras vias identificadas em células estaminais de outros órgãos, as assinaturas do receptor de aril-hidrocarboneto, e a sobre-regulação dos componentes do eixo do receptor de aldeído desidrogenase /ácido retinóico . Há também uma assinatura significativo metabolismo lipídico, caracterizado por sobre-expressão de enzimas que metabolizam os lípidos e a presença do motivo de ligação para SREBP1. A população de células estaminais fetal, caracterizada pela proliferação mais rápida e a auto-renovação, expressa reguladores do ciclo celular, tais como E2f, Nfy, Tead2 e Ap2, em níveis elevados, enquanto que as células estaminais adultas mostram uma assinatura na qual o TGF-β possui um papel proeminente. Finalmente, a comparação das assinaturas de células da próstata primitivos com perfis previamente descritos de tumores de próstata humanas identificadas moléculas de células-tronco e caminhos com expressão desregulada em tumores de próstata, incluindo modificadores de cromatina e do oncogene, Erg.
Conclusões /Significado
nossos dados indicam que estaminais ou progenitoras de células adultas da próstata pode adquirir características das células da próstata fetais primitivas auto-renovação durante a oncogénese e sugerem que a activação aberrante de componentes de vias de células estaminais da próstata pode contribuir para o desenvolvimento de tumores da próstata.
Citation: Blum R, Gupta R, Burger PE, Ontiveros CS, Salm SN, Xiong X, et al. (2009) Molecular Assinaturas de Células Estaminais da próstata Revelar Novas vias de sinalização e fornecer insights sobre o cancro da próstata. PLoS ONE 4 (5): e5722. doi: 10.1371 /journal.pone.0005722
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 13 de fevereiro de 2009; Aceito: 03 de abril de 2009; Publicado em: 29 de maio de 2009 |
Direitos de autor: © 2009 Blum et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, CA132641 (EBP), CA 90593 (DM), National Award Research Service (NRSA) dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e renais, 5F32DK071468 (CSO), Amgen Inc. ea Helen L e Martin S Centro Kimmel para Stem Cell Biology na NYU School of Medicine. cientistas da Amgen teve um papel neste estudo, participando na análise de dados e na preparação do RNA utilizado nos experimentos mircroarray. Não há outros financiadores não tiveram um papel neste estudo
Conflito de interesses:. Entre outros apoios este trabalho também foi apoiado por uma bolsa de investigação da Amgen Inc. (Não há nenhum número para o presente concessão). Um número de nossos colegas Amgen também foram colaboradores neste projeto. Estes colaboradores participou na análise dos dados de microarray e na preparação do ARN utilizado nas experiências de microarray. O papel específico de cada autor é detalhado na seção apropriada dedicada aos papéis dos autores.
Introdução
É provável que a proliferação anormal de células-tronco da próstata (PSC) e /ou seus progenitores contribui para a patologia da próstata. Determinou-se as assinaturas de PSC fetal e adulto (FPSC e APSC) de expressão de genes para obter insights sobre as vias de sinalização que caracterizam estas populações de células estaminais normais de dois (SC) e estes perfis comparados com os das células de tumor da próstata. Delineando estas vias reguladoras podem fornecer informações sobre os mecanismos que convertem células adultas da próstata quiescentes em um compartimento proliferando que dá origem a hiperplasia prostática benigna e carcinoma permitindo assim o direcionamento de vias específicas para tratar essas doenças.
Nós mostramos que as células epiteliais com características SC são concentradas na região proximal ductal, adjacente à uretra [1] – [3]. Estas características incluem a quiescência, um elevado potencial proliferativo e a capacidade das células individuais para dar origem a estruturas ductais que contêm células luminais basal e [2] – [4]. Nós isolamos anteriormente, com base na expressão de [2] Sca-1, duas populações de células que são capazes de regenerar tecido prostático em uma
In vivo
ensaio de reconstituição da próstata. A primeira população, células estaminais, possui considerável potencial de crescimento, não necessita de androgénio para a sobrevivência, expressa elevados níveis de murganhos Sca-1 e reside na região proximal das condutas. Quase todas as células Sca-1
Hi também expressam integrina α6, um antigénio expresso em células da próstata primitivas [2] – [4]. A segunda população, células-amplificação de trânsito, tem um potencial de crescimento mais limitado, expressa níveis mais baixos de Sca-1, requer androgénio para a sobrevivência e é encontrado em todas as regiões ductal [2], [3]. Uma terceira população, as células estaminais da próstata fetais, existe no seio urogenital a partir do qual a próstata desenvolve [5]. A camada interna de células epiteliais do seio urogenital murino começa a invadir a camada exterior do mesênquima para formar os canais da glândula da próstata após E16. Antes deste evento, o epitélio seio urogenital (UGE) contendo células da próstata fetais primitivas pode ser isolada facilmente a partir do seio urogenital.
A fim de identificar moléculas e caminhos que estão ativos em populações de próstata primitivos que determinaram a transcrição perfis de quatro populações de células: (i) UGE, enriquecida em FPSC, (ii) Sca-1
Oi, as células que expressam altos níveis de Sca-1, enriquecidos em APSC [2], [6], (iii ) Sca-1
Lo, as células que expressam médio a baixos níveis de Sca-1 e são enriquecidas em células-amplificação de trânsito [2], e (iv) Sca-1
Neg, células sem Sca-1 expressão, que representam a população mais madura e quase não têm potencial regenerativo [2]. Para obter insights sobre as camadas de regulamentação de redes de transcrição ativos em células da próstata primitivos, foi realizada uma tela computacional de motivos promotor cis-regulação [7] para revelar aqueles que são significativamente enriquecida entre os genes PSC. Foram também identificadas categorias de genes funcionais que são enriquecidos em células primitivas.
As populações SC fetal e adulto expressa numerosos genes relacionados com SC conhecidas. Nossa análise revelou enriquecimento significativo de vários fatores de transcrição (TF) motivos do site liga�o ao nos promotores de genes expressos. Os dados indicam que FPSC e APSC têm programas de transcrição únicos e comuns e identificar algumas das principais características que permitem a manutenção e auto-renovação do estado indiferenciado. Um certo número de genes relacionados com células estaminais identificamos também pode participar no desenvolvimento de tumores da próstata, o que indica que estas moléculas podem delinear um subconjunto de tumores com um mais primitivo e, possivelmente, um fenótipo mais agressivo.
Materiais e métodos
preparação celular, anticorpos e análise FACS
Ética comunicado.
Todos os cuidados e procedimentos com animais foram realizados em conformidade com os requisitos de revisão institucional da Universidade de Nova Iorque.
a região proximal da ductos prostáticos (ou seja, a porção das condutas mais próxima da uretra), de 6 semanas de idade C57BL /6 foram digeridos e as células foram examinadas quanto à expressão de antigénio (Tabela S1) [1], [2]. células marcadas Sca-1-foram classificadas por FACS usando um classificador de DakoCyomation MoFlo 3 em populações de acordo com a intensidade de fluorescência média (IFM) de murganhos Sca-1 expressão [2]. As células (10,000-50,000) com a maior IMF (25%; Sca-1
Hi), médio /baixo MFI (40%; Sca-1
Lo) e aqueles que não possuem Sca-1 expressão (25%; Sca-1
Neg) foram coletadas em TRIzol (Invitrogen). UGE foi isolado a partir do seio urogenital de embriões de 16 dias de idade C57BL /6 de murino [8] e adicionou-se Trizol. Os níveis de ALDH de expressão foram determinados por análise de FACS após coloração com o kit de reagente Aldefluor (StemCell Technologies).
PCR em Tempo Real
Um? G de RNA total foi transcrito reverso a 52 ° C durante 1 hora utilizando o Thermoscript sistema de RT-PCR (Invitrogen). 20 ng de cDNA resultante foi utilizado numa reacção de Q-PCR utilizando um iCycler (Biorad) e pré-concebidos ensaios de gene TaqMan expressão (Applied Biosystems). valores limiares do ciclo de três amostras de ARN foram separadas em média; quantidades de alvo foram interpolados a partir de curvas padrão e normalizados para hipoxantina-guanina.
isolamento do RNA e microarray de hibridização
Nós estabelecemos perfis de transcrição para UGE, Sca-1
Oi, Sca- 1
Lo, e por células diferenciadas do Sca-1
Neg. Três repetições de UGE (FPSC) e Sca-1
Hi (APSC) amostras e quatro repetições de Sca-1
Lo e Sca-1 foram analisadas amostras
Neg. O ARN foi isolado por procedimentos convencionais e a sua qualidade foi avaliada usando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). As amostras com um RNA Integridade Number (RIN) 7,0 foram considerados adequados para rotulagem e 20 ng foram marcadas usando o GeneChip de dois ciclos kit rotulagem alvo (Affymetrix). Dez microgramas de ARNc marcado e fragmentadas foram então hibridado com o genoma do rato MOE430 matriz 2.0 (Affymetrix), que interroga ~45,000 transcritos. dados de expressão Raw (arquivos CEL) foram gerados utilizando GCOS 1.4 (Affymetrix). Os dados discutidos nesta publicação foram depositados em Omnibus Gene Expression do NCBI e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE15580 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15580) .
Análise de dados de expressão de genes
Utilizando ArrayAssist (Stratagene), arquivos Affymetrix CEL brutos foram processados pela aplicação do algoritmo MAS5, para atribuir chamadas de detecção (Present /Marginal /ausente) para cada sonda conjunto que foram posteriormente utilizados em filtragem de dados downstream. Para gerar os níveis de expressão normalizados, utilizou-se PLIER algoritmo (sonda logarítmica erro intensidade), a, multi-array estimador de sinal baseado em modelo que produz valores de sinal set-sonda mais precisas [9]. A combinação dessas métricas acima foi usado para dados de filtragem para obter 33.967 “
genes válidos
“, representando transcritos (sondas de genes) com sinais 20 e detectado como presente em pelo menos uma amostra. Para obter um subconjunto de genes variáveis, calculou-se o coeficiente de variação (CV) para cada transcrito e gerado um conjunto de 5095 “
genes activos
” contendo os transcritos com o mais alto (15% do total) CV pontuações. Para focar os genes que foram alteradas de forma estatisticamente significativa, as amostras foram agrupadas de acordo com tipo de célula (UGE, Sca-1
Oi, Sca-1
Lo, Sca-1
Neg), intensidades de
gene ativo
transcrições foram e submetidas a mais análises estatísticas utilizando dois testes diferentes transformou-log2: (a) one-way ANOVA usando uma correção Benjamini-Hochberg (
p Art 0,05) e (análise b) a significância dos microarrays método (SAM), com uma taxa de detecção falsa de 5%. Isto rendeu uma lista de 3137 “
genes significativos
“, representando transcrições que atendiam aos critérios de ambos os testes estatísticos. Uma análise princípio componentes (PCA) (média centrado) calculado pela ArrayAssist, mostrou uma reprodutibilidade e separação adequada dentro dos diferentes tipos de células (Figura S1). Para definir as características distintivas da UGE, Sca-1
Hi e Sca-1
populações Lo, comparou-se a intensidade de expressão do gene lê (amostras agrupadas) de cada uma dessas populações com o das células adultas mais diferenciadas (Sca-1
Neg), utilizando um teste T não pareado (Benjamini-Hochberg corrigido
p Art 0,05). Três subconjuntos de genes (UGE, Sca-1
Hi e
Lo Sca-1) que contêm transcrições cuja expressão aumentada ( 1,75 vezes) em relação à sua expressão em Sca-1
células Neg foram gerados .
Análise de categorias funcionais
Nós utilizamos as anotações funcionais de genes de murino fornecidos pelo murino Genome Informatics, que usa o vocabulário padrão introduzido pelo consórcio Gene Ontology (GO). categorias funcionais enriquecidos (
p
≤0.01, após a correção para testes de múltipla) foram identificados em cada um dos três grupos (
UGE-only
,
UGE + Sca-1
Hi
,
Sca-1
Hi-only
) usando expansor, em que o cálculo hypergeometric é usado para determinar sobre-representados GO categorias funcionais de uma meta estabelecida em relação a um conjunto de fundo (a inteira recolha de genes putativos de murinos) [7]. Para evitar preconceitos, genes representados por vários conjuntos de sonda foram contadas apenas uma vez.
análise computacional de elementos cis-reguladora do promotor
Para a análise promotor aplicamos EXPANDER [7] para detectar promotor cis-regulação elementos que controlam as alterações observadas na transcrição os aglomerados expressão do gene. Dada conjuntos de alvos e de fundo de promotores, EXPANDER realiza testes estatísticos para identificar TFs cujas assinaturas local de ligação são significativamente sobre-representados na meta estabelecida em relação ao fundo (enriquecimento TF é indicada por
p
-valor) [7 ]. Ambos os fios de cada promotor foram verificados quanto a sítios de ligação putativos (que mede o local de início da transcrição a partir de 1000 pb a montante de 200 pb a jusante). Os enriquecimentos identificados neste estudo foram robustos, como eles manteve-se estável ao longo de um grande intervalo de valores de limite.
Comparação de dados para SC-perfis conhecidos
Entrez Gene IDs e UniGene identificadores únicos foram utilizados para combinar os genes representados em diferentes plataformas de microarray. Marcámos o número de genes que eram comumente-regulada nos perfis de expressão gênica e em pelo menos um outro perfil de SC.
Resultados e Discussão
Profiling da expressão do gene em três haste de próstata /populações enriquecidas de células progenitoras
RNA foi isolado a partir dos quatro populações de células descritos acima (UGE, Sca-1
Oi, Sca-1
Lo e Sca-1
Neg), preparado para hibridação de microarranjos e analisados como descrito em Materiais e Métodos. Três subconjuntos de genes (UGE, Sca-1
Oi, Sca-1
Lo) foram gerados constituído por transcrições cuja expressão foi estatisticamente elevado em cada uma das populações em relação à sua expressão na mais diferenciada Sca-1
Neg população de células (Figura 1, Tabela S2). O subconjunto FPSC tem o maior número de transcritos significativamente alterados (1286) sondas de genes, tal como pode ser esperado quando a comparação de um SC fetal, com uma população de células de adulto diferenciada. O subconjunto APSC (Sca-1
Hi) tem 641 eo subconjunto-amplificando trânsito (Sca-1
Lo; mais diferenciado do que o subconjunto APSC) tem apenas 144 transcrições que são diferencialmente expressos. Em seguida, determinar se podíamos discernir padrões de expressão comum entre estes três subgrupos progenitoras e padrões que eram exclusivos para cada subconjunto. Intersecção das transcrições-regulada dentro dos três subgrupos resultou na geração de quatro clusters (
UGE-only
,
UGE + Sca-1
Hi
,
Sca- 1
Hi-only
,
Sca-1
Hi
+
Sca-1
Lo
) de genes expressos mutuamente ou exclusivamente (Figura 1, Tabela S3). O padrão de expressão do gene mais distintiva foi obtido a partir da população de células UGE, que se manifesta por 1050 transcritos que foram sobre-expressos exclusivamente na única UGE-
aglomerado (cluster de FPSC)
. Um segundo padrão distinto era evidente no Sca-1
Hi subconjunto, representado pelo exclusivo sobre-regulação de 296 transcrições no
Sca-1
Hi-somente
cluster (aglomerado APSC). Curiosamente, dentro do cluster que se sobrepõe entre o feto e os subconjuntos adultos, o
UGE + Sca-1
Hi
cluster, encontramos um número substancial de transcritos (209) que eram comumente-regulada, enquanto que menor de uniformização (112 transcrições) foi observada no cluster que se sobrepõe (
Sca-1
Hi
+
Sca-1
Lo
cluster) entre o subconjunto APSC (Sca- 1
Hi) eo subconjunto TA (Sca-1
Lo) (Figura 1, Tabela S2). Muito poucas transcrições (5) foram distintamente sobre-expresso na população mais diferenciada (
Sca-1
Lo-only
cluster). Estes resultados mostram transcritos de genes específicas do estágio proeminentes expressas durante a maturação das células da próstata, a partir da população fetal mais primitiva (EDA), e progredindo através da população APSC (Sca-1
Oi), e sua descendência, o trânsito -amplifying células (Sca-1
Lo), e culminando com o subconjunto mais diferenciada (Sca-1
Neg).
Um diagrama de Venn detalhando o número de transcrições (sondas de genes) de sobre-expressos genes compartilhados e distinta entre os UGE, Sca-1
Hi e Sca-1
subconjuntos Lo. O número de transcrições dentro de cada subconjunto é dado entre parêntesis fora do gráfico de Venn. O número de transcrições dentro de cada cluster é dada em itálico dentro das fatias de gráfico de Venn. Números de genes anotados que aparecem em cada um dos quatro grupos são apresentados na tabela a inserir. O dendograma correspondente de cada cluster é apresentado.
A. Expressão de marcadores de SC em tronco prostática /progenitoras aglomerados
A nossa análise de perfil indica que todos os /progenitoras enriquecidas subconjuntos três-tronco contêm um número substancial de marcadores conhecidos de PSC murino, ou seja,
Trp63
,
CD200
,
CTNNB1
,
Smo
,
KRT5
,
KRT14
,
ITGA6
/
Cd49f
,
CD44
,
Kit
,
Bcl2
, e
CD34
[10] (Figura 2A, B, Tabela S4). Uma comparação de 11 marcadores PSC conhecidos que foram supra-regulados nos subconjuntos com um painel de 15 genes de manutenção de murino comuns, cuja expressão não foi alterada, confirma que os perfis reflectem uma assinatura transcricional específica de FPSC primitivo e APSC (Figura 2A; Tabela S4). Além disso, transcrições para um receptor ephrin,
Ephb3
, e dois ligantes efrina,
Efna5
e
Efnb2
, que atuam como coordenadores de migração e proliferação do SC intestinal nicho [11] são regulados positivamente tanto na FPSC e populações APSC (Figura 2B). A análise FACS de Sca-1
Hi e Sca-1
células Lo validou o aumento da expressão de vários antígenos de células-tronco previstos pelo microarray (Figura 3A), incluindo marcadores de células tronco a6 e p4 -integrins [12], queratina 5, a Bcl-2, β-catenina [10], Sox2 [13] e CD34 [14] (Figura 3B). Isso indica que as mudanças nos níveis de mRNA de muitos SC-marcadores são refletidas por mudanças em seus níveis de proteína.
A. perfis de expressão de moléculas descritas como sendo expressas em populações primitivas da próstata que foram sobre-regulada, pelo menos, duas vezes (painel superior) nas UGE, Sca-1
Oi e Sca-1
lo células são apresentados. Cada coluna representa uma amostra individual, e cada linha representa um gene específico. Red (alto), verde expressão relativa (baixo); preto indica a igualdade de expressão relativa aos Sca-1
células Neg. O painel inferior apresenta uma cassete de 15 genes de limpeza murino comuns que se manifestam a expressão estável em todas as amostras. Log rácio (LR) Os valores são apresentados na Tabela S3. B. perfis de expressão de marcadores SC conhecidos (
Egon
e
Fatigo
inquérito), que foram up-regulada por pelo menos 2 vezes em amostras de caule de próstata /progenitoras enriquecido. Cinco padrões de expressão podem ser distinguidos. valores LR são apresentados na Tabela S5.
A. nível de transcrição de marcadores SC em células da próstata primitivos e progenitoras. dados de micromatriz de marcadores de SC estas populações de células primitivas são expressos como valores de LR [média ± SD] relativa a amadurecer amostras Sca-1
Neg. expressão B. Antígeno de marcadores SC em Sca-1
Hi e Sca-1
células Lo. A análise FACS de Sca-1
Hi e Sca-1
células Lo determinou a expressão de marcadores de SC (indicado em A) sobre essas populações. valores de enriquecimento [média ± SD] são expressos como a variação vezes na expressão de antigénios em relação à expressão do antigénio da
população de células Neg Sca-1 madura.
Para determinar se genes adicionais relacionadas SC foram expressos na próstata subconjuntos estaminais /progenitoras, utilizamos duas abordagens. Primeiro, utilizamos duas ferramentas de bioinformática (
Egon
e
Fatigo
[15]) para identificar genes anotados como células-tronco genes baseados em publicações anteriores. Esta pesquisa indica que todos os nossos haste /subconjuntos relacionados com progenitoras (UGE, Sca-1
Oi, Sca-1
Lo) expressar um número de marcadores de células-tronco (total de 67 genes) (Figura 2B; Tabela S5 ). A segunda abordagem para determinar a natureza primitiva dos perfis envolveu uma comparação sistemática do nosso perfil com outros cinco perfis de expressão genética a partir embrionárias (ESC), hematopoiéticas (HSC), neuronal (NSC) [16], [17], a pele [18 ] e fígado [19] células-tronco. Verificou-se que um número significativo de mRNAs expressos nos agrupamentos estaminais /progenitoras de próstata foram também regulado para cima em pelo menos um dos cinco perfis de SC publicados (variando de 40% de
UGE-
apenas mRNAs a 20% do
Sca-1
Hi + Sca-1
Lo
mRNAs) (Figura 2B, Tabelas 1, S6). Assim, apesar das limitações da comparação de dados obtidos utilizando diferentes condições experimentais e microarrays menos abrangentes do que usados em nosso estudo, detectamos um alto grau de sobreposição entre os genes sobre-expressos nos perfis estaminais /progenitoras da próstata e aqueles que são sobre-expressos em outros perfis de SC. Isto implica que próstata células estaminais /progenitoras compartilhar inúmeros recursos com SC isolado a partir de outras fontes. No entanto, próstata células estaminais /progenitoras também expressam genes não identificados em qualquer desses cinco populações SC indicando que alguns desses genes podem ser exclusivo para próstata ou podem ser compartilhadas com outros perfis de SC não descritas. Notavelmente, as duas abordagens utilizadas para a estimativa do enriquecimento SC-marcador indicam que, enquanto há uma considerável representação de genes relacionados à SC em adultos Sca-1
células Oi, existe uma representação ainda maior de SC-marcadores em células UGE. Curiosamente, uma comparação com dois estudos ‘stemness assinatura “[16], [17] indica que o perfil PSC tem maior sobreposição com ESC ou perfis NSC, do que com HSC. Por exemplo, a comparação com os dados de Ramalho-Santos et al [17] indica que 14,4% e 16,1% dos mRNAs PSC-enriquecidos se sobrepõem com os mRNAs ESC e NSC-enriquecidas, respectivamente, enquanto que os mRNAs menos (6,8%) sobreposição com transcrições HSC enriquecidas (Tabela 1). Vários estudos recentes têm demonstrado que os perfis de expressão de gene e CES NSC sobrepõem uns com os outros a uma maior extensão do que com HSC [17], [20]. Assim, os nossos resultados sugerem que a linhagem de células progenitoras de próstata pode assemelhar-se de progenitores neuronais ou embrionárias, em maior medida do que a dos progenitores hematopoiéticos.
A presença de um número significativo de genes SC em nossa APSC e FPSC sugere que estas populações têm as características de células progenitoras indiferenciadas. A seguir, determinou os perfis moleculares das populações PSC isoladas de decifrar vias de sinalização potenciais que são expressos por estas células.
B. Identificação das categorias funcionais sobre-representadas e motivos promotoras de ligação TF dentro dos grupos de genes que são sobre-expressos nas células-tronco /progenitoras
Para identificar os principais processos biológicos e redes de transcrição, dentro dos três grupos contendo SC (
UGE-only
,
UGE + Sca-1
Hi
,
Sca-1
Hi-only
; Figura 1) foi aplicado o pacote Expander para funcional e análise promotor. Um número de categorias funcionais e motivos promotoras de ligação TF são significativamente enriquecida nestes clusters (Tabelas 2, S7).
a) assinatura de auto-renovação em FPSC
O
UGE somente
cluster é altamente enriquecidos em genes de proliferação celular, como seria de esperar para uma população fetal de expansão (Tabelas 3, S7,8). Aumento da regulação do
Mki67
(12 vezes) exclusivamente no subconjunto UGE atesta que estas células estão proliferando. vias relacionadas com o ciclo de proliferação e celulares são elevados no auto-renovação da SC normais [21]. PTEN eliminação, o que aumenta o conjunto de auto-renovação NSC [21], revela uma assinatura SC-auto-renovação (231 genes) para estas células. Notavelmente, cerca de 64% desses genes também estão up-regulamentada no
UGE-only
cluster, indicando semelhança considerável na expressão genética entre essas duas populações auto-renovação (Tabela S9). Componentes, bem como genes alvo, da via /β-catenina Wnt que promove a auto-renovação em muitos tipos de SC [22] estão fortemente representadas em FPSC e APSC (Tabelas 3, S10). A activação aberrante desta via em tumores de próstata [23] e seu enriquecimento no PSC é consistente com a noção de que o câncer de próstata pode surgir no compartimento primitivo. análise qPCR validados os perfis de expressão de gene, indicando que a expressão de
Wnt4
é elevada em FPSC (5 vezes) e APSC (8 vezes) em relação a células maduras (Sca-1
Neg). Além disso,
Wnt6
é elevada em FPSC (22 vezes), e é elevada em Fzd6 FPSC (5 vezes) e APSC (3-vezes) em relação a células maduras (Tabela S11). Os componentes do circuito de hedgehog sónica (Shh), que também está implicado na auto-renovação das células primitivas [24] e a supressão da diferenciação, se manifestam em FPSC e APSC (Tabelas 3, S12). A abundância de SHH-reguladores e genes-alvo que são up-regulamentados na FPSC e APSC indica que a sinalização hedgehog autócrina pode desempenhar um papel importante na progenitor de próstata /biologia das células estaminais. análise qPCR valida os dados de expressão de gene e indica que
Shh
e
Gli3
expressão são aumentados em fetal (35 vezes e 4 vezes, respectivamente) e adultos (6 vezes e três vezes respectivamente) SC em relação a células maduras (Tabela S11). a sinalização de hedgehog é importante para o crescimento normal da próstata e aumenta durante a tumorigénese da próstata em conjunto com um aumento em marcadores de células progenitoras [25], o que implica mais uma vez que as células primitivas podem ser expandido durante a tumorigénese.
local de ligação de TF- análise de promotores de genes que eram up-regulamentados dentro do FPSC (o
UGE-only
cluster) identifica dois reguladores de transcrição do ciclo celular, ou seja, E2F e Nfy (Tabelas 2, S13), consistente com excesso representação de genes de auto-renovação (Tabelas 3, S7) [20]. Importante, aumentos nos níveis de ARNm que codificam os quatro membros da família E2f são observados juntamente com numerosos genes específicos que são alvos de E2F3 (Tabela 3). A análise por qPCR confirma que
E2F3
(3 vezes) e seu gene alvo representativa,
Cdc2a
(12 vezes), são regulados positivamente nas células UGE comparação com células maduras (Tabela S11). Curiosamente, a expressão E2F3 está associado com a auto-renovação de SC murino trophoblast [26], a expansão da SC na columela e raízes laterais tampas de Arabidopsis [27], e um mau prognóstico no câncer de próstata [28]. A assinatura-motivo de ligação para Nfy também é bem representada nos promotores de genes FPSC e está de acordo com o aumento da transcrição de Nfya e Nfyb subunidades e a constatação de que Nfya é um potente indutor de HSC auto-renovação [29].
assinaturas promotor adicionais que são enriquecidos no
UGE-only
de cluster são os de Ap2 e do fator contendo domínio TEA embrionária (ETF), também conhecido como Tead2 (Tabelas 2, S13). Na expressão FPSC de
ETF
/
Tead2
e sua coativador,
Yap1
, sofreram um aumento de 4 e 2 vezes, respectivamente. A expressão aumentada de
Tead2
(4 vezes) em relação ao FPSC células maduras foi verificado por qPCR (Tabela S11). Tead2 induz genes que promovem a auto-renovação de células progenitoras no epitélio olfactivo [30] e é essencial durante o desenvolvimento do embrião murino [31]. Ap2 transcrições são elevados três vezes e um certo número dos seus genes alvo são aumentadas (Tabela 3). Ap2 promove a proliferação sobre a diferenciação e é um marcador de SC e pluripotência [32]. Assim, E2f, Nfy, Tead2 e Ap2 são susceptíveis de ser envolvido na auto-renovação e expansão da população de próstata primitivo.
b) TGF-ß sinalização assinatura em APSC
Em contraste à abundância de genes de proliferação presentes na população UGE expansão, em APSC (Sca-1
Hi subconjunto) descobrimos que genes alvo TGF-β são upregulated indicando que a sinalização TGF-β é uma característica proeminente da APSC. Nós anteriormente documentado que a manutenção da dormência do APSC é dependente da /3 via de TGF-β /Smad2 sinalização [33]. Significativamente, a nossa análise promotor cis-elemento identifica enriquecido para Smad e Smad3 no
Sca-1-sítios de ligação
Hi-only
cluster, enquanto sites semelhantes estiveram ausentes do
UGE-only
cluster (Tabela 2), o que indica que o TGF-β /Smad de sinalização podem ter um papel predominante em APSC.
O nível de expressão de
Itgb6
, uma integrina que se liga e activa o TGF-? β [34] é sobre-regulada de 3 vezes na APSC (Tabela 3). Além disso, um aumento nos níveis de
IGFBP3
(14 vezes) de expressão, que fosforila Smad3 [35], observa-se exclusivamente na Sca-1
Oi subconjunto. Validação por qPCR (3 vezes; Tabela S11) e a análise por FACS (3 vezes; Figura 3B) confirma que o TGF-β gene alvo clusterina (Clu) é sobre-regulada em APSC. A nossa análise promotor também identifica sobre-representação do motivo Smad3 nos promotores de genes de a UGE + Sca-1
Oi cluster (Tabela 2), o que indica que o TGF-β também pode mediar a sinalização no FPSC. Numa segunda abordagem para determinar o possível envolvimento de sinalização de TGF-β em células da próstata primitivas, compararam-se os genes dos três grupos enriquecido-SC (
UGE somente
,
UGE + Sca-1
Hi Comprar e
Sca-1
Hi-only
) com a assinatura TGF-β-driven de queratinócitos [36]. Estas comparações indicam que aproximadamente 14% dos genes em cada um destes três grupos testados podem ser alvos de TGF-β (
UGE-only
112/823;
UGE + Sca-1
Hi
19/130;
Sca-1
Hi-only
23/172 genes) (Tabela S14), apoiando a contribuição da sinalização TGF-β em FPSC para além do seu papel proeminente na APSC (Tabela 3). A este respeito, é importante notar que o
Smad2
e
Smad3
, os dois principais mediadores da transcrição do TGF-β, estão exclusivamente up-regulamentada no UGE (Tabela 3). A representação proeminente do local de ligação motivo Smad nos promotores de genes que são regulados positivamente na APSC (Sca-1
Hi-only cluster) indica que o TGF-β via de sinalização é altamente relevante para o programa transcricional destas células e apoia a conclusão de que o TGF-β mantém a quiescência de APSC [33].