PLOS ONE: mTOR inibição provoca uma resposta dramática em Colon PI3K-Dependent Cancers

Abstract

O phosphatidylinositide-3-quinase (PI3K) via de sinalização é fundamental para múltiplas funções celulares, incluindo metabolismo, proliferação, angiogênese e apoptose, e é a via mais comumente alterados em cancros humanos. Recentemente, desenvolvemos um modelo do rato romance de câncer de cólon em que os tumores são iniciadas por um PI3K ativo dominante (

FC PIK3CA *

). Os tipos de câncer nesses camundongos são moderadamente diferenciadas adenocarcinomas mucinosos invasivos do colo proximal que se desenvolvem por 50 dias de idade. Curiosamente, estes cancros formar sem uma sinalização WNT intermediário ou aberrante benigna, indicando um mecanismo não-canônico de desenvolvimento de neoplasias. Uma vez que estes tumores dependem da via da PI3K, que investigou o potencial de resposta do tumor pela segmentação desta via com a rapamicina, um inibidor de mTOR. Uma coorte de

FC * PIK3CA

ratinhos foram tratados com rapamicina a uma dose de 6 mg /kg /dia ou placebo durante 14 dias. FDG dupla de imagem PET /CT híbrido demonstraram uma resposta tumor dramática no braço rapamicina e isso foi confirmado na necropsia. O tecido de tumor remanescente após o tratamento com rapamicina demonstrou aumento pErk1 /2 ou persistente proteína ribossómica S6 fosforilada (PS6), indicando potenciais mecanismos de resistência. Este modelo único vai promover nossa compreensão da doença humana e facilitar o desenvolvimento de terapêuticas por meio farmacológico triagem e biomarcador identificação

Citation:. Deming DA, Leystra AA, Farhoud M, Nettekoven L, Clipson L, Albrecht D, et ai. (2013) mTOR inibição provoca uma resposta dramática em cancros do cólon PI3K-dependente. PLoS ONE 8 (4): e60709. doi: 10.1371 /journal.pone.0060709

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Outubro, 2012; Aceito: 01 de março de 2013; Publicação: 09 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Deming et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O projeto foi apoiada pela Fundação Conquer Cancer da Sociedade americana de Oncologia Clínica através de uma Young Investigator Award (para DAD); o National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde, através T32 CA009614 (a DAD), P50 CA095103 Gastrointestinal Especializada Programa de Investigação Excellence Grant, Vanderbilt Ingram Cancer Center), R01 CA123438 (a RBH), CA014520 P30 (Núcleo Grant, da Universidade de Wisconsin (UW) Carbone Cancer Center); e start-up fundos (a RBH) da Divisão de UW of Gastroenterology and Hepatology, do Departamento de Medicina UW, e na Escola UW de Medicina e Saúde Pública. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o desenvolvimento de terapias direcionadas para o tratamento do câncer tem sido um assunto de grande interesse e esforço. Até recentemente, novas terapias dirigidas têm sido estudados em populações não seleccionadas, em grande medida. limitada eficácia foi demonstrada utilizando esta abordagem. No entanto, à medida que evoluímos mais perto de uma era de medicina personalizada, cada subtipo histológico de câncer está se tornando mais bem compreendida como uma coleção de raros cancros com cada uma definida por seu perfil de mutação. Portanto, o teste de agentes direcionados deve ser realizado com uma população seleccionada portadores de mutações que se sabe activarem vias de sinalização a ser alvo.

tumores do cólon humano contêm várias possíveis mutações oncogénicas do controlador que poderia potencialmente ser segmentados, incluindo

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

alvos-chave [1] Estas cinases mutantes foram para o contínuo desenvolvimento de agentes terapêuticos. Eles também têm sido importantes para a compreensão da biologia de resistência ao receptor do factor de crescimento epidérmico terapias dirigidas, cetuximab e panitumumab [2], [3]. Apesar dos avanços significativos no tratamento desta doença fatal, cancro colorrectal permanece a segunda principal causa de morte relacionada com o cancro nos Estados Unidos [4]. Para avançar as opções de tratamento para os pacientes, é necessária uma investigação mais aprofundada sobre a biologia destas mutações. Isto irá fornecer uma melhor compreensão de quais pacientes são mais propensos a responder a terapias específicas.

PIK3CA

mutações ocorrem em 20 a 30% dos cancros colo-rectais humanos [5], [6]. Três mutações de ponto de acesso são comumente encontrados, incluindo H1047R, E542K e E545K, que resultam em uma forma constitutivamente activa de subunidade catalítica da PI3K p110α [7]. Este PI3K ativo dominante, em seguida, resulta em aumento da sinalização de Akt /mTOR e aumento da proliferação celular (Figura S1) [8]. Embora vários investigadores examinaram os efeitos destas mutações em linhas celulares, o nosso laboratório recentemente desenvolvido um modelo murino de cancro do cólon, que é iniciada por uma PI3K activo dominante (

FC * PIK3CA

) [9]. Neste modelo, grandes adenocarcinomas mucinosos invasivos moderadamente diferenciadas desenvolvem no cólon proximal por apenas 50 dias de idade. Estes tumores são iniciadas por um independente via não-canônica de sinalização Wnt aberrante. Uma vez que estes tumores são iniciadas por PI3K activada, que teve como objetivo determinar se esses tumores são dependentes desta via. Aqui, demonstramos que o tratamento de

FC * PIK3CA

ratinhos com o inibidor de mTOR, rapamicina, resulta em uma resposta dramática em cancros do cólon avançada. Isso indica que os tumores humanos que dependem da via PI3K /AKT são susceptíveis de ser sensíveis aos inibidores de mediadores a jusante.

Materiais e Métodos

Mouse Pecuária

Todos os estudos com animais foram realizado sob protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade de Wisconsin-Madison, seguindo as orientações da Associação americana para a Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care. Homozigoto

FC

+

camundongos fêmeas (FVB /N-Tg (Fabp1-Cre) 1Jig; NCI mouse Repository, número Strain – 01XD8) foram cruzados com homozigotos

PIK3CA *

+ camundongos machos (C57BL /6

Gt (ROSA) 26Sor

TM7 (PIK3CA *, EGFP) Rsky /Tablet

J; O Laboratório Jackson, da Number – 012.343) para gerar

camundongos * FC PIK3CA

utilizado neste estudo. Os ratos foram genotipados para

FC

e

PIK3CA *

como descrito anteriormente [10], [11].

Tratamento animal

FC PIK3CA

* foram seleccionados ratos entre 50 e 60 dias de idade para inclusão no estudo, enquanto eles não estavam moribundos. Linha de base dupla híbrido

scans 18F-FDG PET /CT foram realizadas antes e 15 dias após o início do tratamento. O tamanho do tumor foi subjectivamente determinada a partir das imagens cruas de pré-tratamento e utilizados para a estratificação durante a aleatorização aos rapamicina e controle de armas. Os animais do grupo de controlo recebeu etanol dissolvido em água para uma concentração final de 1% por gavagem oral diariamente durante 14 dias. Animais randomizados para o braço rapamicina recebeu 6 mg /kg de rapamicina (LC Labs, Woburn, MA) por gavagem oral por dia durante 14 dias consecutivos. A rapamicina foi dissolvido em etanol a uma concentração de 50 mg por ml antes da suspensão em água para um volume final de 200 ul para administração.

Imagiologia

Os animais foram mantidos em jejum durante pelo menos 6 horas antes à injeção de

18F-FDG (160 uCi; IBA Molecular, Romeoville, IL) ou

18F-FLT (140 uCi; Universidade de Wisconsin ciclotrão, Madison WI). Após a injecção, os animais foram mantidos sob anestesia por 60 minutos e, em seguida, preparada para colonografia virtual como descrito anteriormente [12]. A aquisição de PET 10 minutos foi realizada, seguida imediatamente por tomografia computadorizada. projeções de intensidade máxima foram criados em Siemens Inveon Research Workplace (Knoxville, TN). As imagens de PET foram reconstruídos usando OSEM3D /MAP (OSEM3D, 2 iterações; MAP 18, iterações 16 subconjuntos). Atenuação correcção foi realizada utilizando os dados de CT. As imagens de TC foram reconstruídos usando reconstrução conebeam padrão. Linha de base e de PET pós-tratamento scans foram normalizados para dose injectada, a dose de decadência, atividade e peso. Os volumes dos tumores foram estimados a partir de medidas nos exames PET /CT (Figura S2). imagiologia PET foi utilizado para localizar tumores antes da estimativa de volume. Os volumes tumorais só pode ser estimado, como delinear os limites do tumor exatas é difícil. Isso ocorre porque esses cânceres não são alterações luminais e sutis sinais FDG relacionadas com o epitélio normal hyperplastic circundante existem os tumores. Os volumes de tumor em cada coorte foram comparadas usando exatamente um teste t de Student dos dois lados. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Histologia e imunohistoquímica

Os ratos foram submetidos à eutanásia por CO

2 asfixia após a sua imagem de pós-tratamento. O intestino delgado e cólon foram removidos, lavada com PBS, seccionadas longitudinalmente, espalhados nos, e fixados em formol a 10% tamponado por 24 horas. Os tecidos foram então armazenados em etanol a 70%, processadas, embebidas em parafina e cortada em secções de 5 | iM. Cada décimo seção foi corado com hematoxilina e eosina (H E) para análise histológica. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando o kit de Histomouse ™ Max amplo espectro (DAB) como indicado pelo fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) e como anteriormente [9] descrita. A imunofluorescência foi realizada utilizando um protocolo semelhante com as seguintes modificações: 5% de leite em PBS foi usado para bloquear o tecidos. Todos os passos após a incubação com o anticorpo primário e a lavagem foram omitidas e substituídas com a seguinte: anticorpo incubadas com 488 AlexaFluor de cabra anti-IgG de coelho fluorescente secundária (1:1000, Invitrogen) durante uma hora, lavadas em PBS, e montado com o ProlongGold antifade Reagente com DAPI (Invitrogen). Os anticorpos primários incluíram: anti-pAKT (Ser473, 1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-PS6 (1:200, Cell Signaling Technology), anti-Ki67 (1:1000, Cell Signaling Technology) e rato anti-β-catenina (1:200, BD Biosciences – Clone 14, San Diego, CA).

Western Blot Analysis

As amostras de tecido foram excisadas e flash congelado. Após 24 horas, as amostras foram sonicadas em T-PER tecido reagente de extracção de proteína (Thermo Scientific, Pittsburg, PA), mistura de inibidores de proteassoma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma-Aldrich) . proteína extraída foi então executado como descrito anteriormente [9]. Os anticorpos primários contra p110α, pAKT (Ser473), AKT (pan, 11E7), o total de tuberina /TSC2 (D93F12), pmTOR (Ser2448), pS6K1 (S6 quinase p70, Thr389), PS6 (Ser235 /236), Total S6 (5G10 ), caspase 3 clivada, pErk1 /2 (Thr202 /Tyr 204) e ERK total de 1/2 (Cell Signaling Technology) foram incubadas em albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich) a uma razão 1:1000 durante 16 horas. anticorpo anti-GAPDH (Cell Signaling) foi utilizado como um controlo de carga na proporção de 1:5000.

Resultados

FC PIK3CA

* ratinhos desenvolvem cancros do cólon proximal que pode ser acompanhado longitudinalmente para o tratamento Estudos

FC PIK3CA *

ratinhos desenvolvem rapidamente adenocarcinomas mucinosos moderadamente invasivos [9]. Importante para este estudo, os tumores nestes ratos podem ser detectados por dupla híbrido

18F-FDG ou

18 F-FLT PET /CT colonography (Figura S3

A

e

B

, respectivamente). Na nossa recente descrição deste modelo, avaliou-se o desenvolvimento de tumores no cólon ao longo do tempo [9]. adenocarcinomas invasivas foram identificadas em 75% dos ratinhos em apenas 40 dias de idade. A grande maioria dos ratinhos moribundos por tornar-se apenas de 60 a 80 dias de idade. Dado o objetivo deste estudo para medir o efeito da rapamicina em cânceres pré-existentes cólon com uma PI3K predominantemente ativa, colocamos em nosso estudo terapêutica 22

FC PIK3CA *

ratos em 55 dias de idade, uma idade em que a maioria tem pré-existente câncer, mas ainda não se tornaram moribundo. Os ratos foram estratificados em grupos com base no tamanho do tumor entre os sexos e de pré-tratamento, estimado a partir da linha de base dupla híbrido

18F-FDG PET /CT colonography. Um volume de 50 milímetros

3 foi usada como um ponto de corte para determinar grande contra tumores pequenos. Estes ratinhos foram então divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento, recebendo placebo ou rapamicina por sonda oral. As características basais são apresentados na Tabela 1.

FCPIK3ca * Ratos Tolerar Rapamicina Tratamento

A rapamicina foi administrada a

FC PIK3CA *

ratos a uma dose de 6 mg /kg /dia por gavagem oral, durante um total de 14 dias consecutivos, que tinha sido mostrado previamente para ser tolerável para ratinhos [13].

FC PIK3CA *

ratos também tolerado este tratamento bem (Tabela 1). Nenhuma mudança significativa no nível de atividade ou de peso foi observada entre os grupos placebo e de tratamento durante todo o período do estudo. Dois ratos no grupo de placebo se tornou moribunda devido à obstrução do cólon a partir de grandes tumores do cólon proximal e foram sacrificados antes da conclusão do curso o tratamento pretendido. Ambos os ratos tinham tumores grandes na imagem de linha de base com volumes mais de 80 mm

3.

A rapamicina induz uma resposta significativa do tumor em

FC PIK3CA *

Mice

Depois 14 dias de tratamento, os ratinhos em ambos o placebo e os braços de rapamicina foram fotografadas uma segunda vez para avaliar a eficácia do tratamento. Após a normalização dos dados de imagem, uma resposta dramática foi observada nos ratos tratados com rapamicina quando comparada com os controlos (Figura 1, Figura S4, e Tabela S1). Em vários animais, atividade FDG consistente com tecido do tumor não pôde ser encontrado após o tratamento rapamicina. As imagens de PET /CT foram usadas para a localização do tumor e os volumes foram estimadas com base nas medições a partir dessas imagens (Figura S2). No braço do placebo, o volume do tumor quase dobrou de tamanho desde o início com um aumento da linha de base de 96%. Esta mudança dramática era esperado uma vez que estes cancros crescer muito rapidamente neste modelo. Na coorte de rapamicina, houve uma acentuada redução no volume do tumor, com apenas 16,9% da massa de base ainda estar presente em média (Figura 1

B

e Tabela S1). Nem todos os tumores responderam ao mesmo grau, embora nenhum dos cancros no braço rapamicina foram mostrados para aumentar de tamanho durante o tratamento. Uma vez que estas lesões são bastante sensíveis à inibição do mTOR por rapamicina, isso indica ainda que eles são dependentes da cascata de sinalização PI3K /AKT /mTOR.

Um grupo de 22

FC PIK3CA *

ratos foram fotografadas com dual híbrido

18F-FDG PET /CT colonography e estratificada com base no tamanho do tumor. Os ratinhos foram então tratados com um placebo (de etanol, dissolvidos em água de beber) ou rapamicina 6 mg /kg /dia por gavagem oral, durante 14 dias. Após a conclusão do curso de tratamento, PET /CT colonography foi repetido para avaliar a resposta do tumor. Nos ratinhos que receberam o placebo, os tumores aumentar de tamanho durante o período de tratamento de 14 dias (

A, esquerda

). No braço de rapamicina uma resposta significativa foi observada (

A, direito

). Projeção e vistas axiais são apresentados na parte superior e partes inferiores, respectivamente. Os tumores foram localizados em imagens de PET e os volumes foram medidos a partir de dados TC. A variação percentual no volume do tumor para cada tumor é exibido em uma trama cachoeira (

B

).

Para confirmar os dados de resposta adquiridos com o colonography de PET /CT, necropsia foi realizada após a aquisição de imagem. Uma resposta significativa também foi observado no momento da necropsia (Figura 2). Usando uma análise, cecal intenção de tratar e /ou tumores de cólon foram manifestamente presente em 10 de 11 ratos no grupo de placebo, mas estavam presentes em apenas 5 de 11 ratos no braço rapamicina (Figura 2

C

, p = 0,021), indicando um efeito significativo do tratamento com a terapia de rapamicina único agente. No braço do placebo, 8 de 11 ratos tinham tumores do cólon, enquanto cancros estiveram presentes em apenas 3 de 11 ratos tratados com rapamicina (Figura 2

C

, p = 0,034). Ambos os grupos apresentaram um número igual de tumores cecais, com 2 dos 11 ratinhos tendo-lhes, em cada braço. Um dos

FC PIK3CA *

ratos no grupo de controle com um tumor cecal também desenvolveram doença metastática com a propagação do câncer para o tecido mesentérica confinando o baço e pâncreas (Figura 2

D e E

). Não há evidência de doença metastática foi detectada em nenhum ratinhos tratados com rapamicina.

sequência de imagens de pós-tratamento, foi realizada a necropsia. O cólon foi retirado e dividido longitudinalmente. Grandes tumores submucosos foram vistos em ratos tratados com placebo (

A

). A resposta dramática foi observada na necropsia no grupo tratado com rapamicina (

B

). Hiperproliferação foi diminuída no cólon proximal normal e tumoral residual mínima foi identificado. 10 de 11

FC PIK3CA *

ratos no grupo do placebo tiveram tumores identificáveis ​​enquanto apenas 5 de 11 ratos no braço rapamicina tinham tumores identificáveis ​​(

C

). Um rato no grupo placebo foi encontrado para ter a doença metastática de um tumor cecal (

D

). Um grande lesão dentro do mesentério foi identificado encosto do baço e pâncreas (

D, seta

). Em histológica seccionamento uma morfologia similar foi observada entre o depósito metastático e tumor primário dentro do ceco (

E

).

FC PIK3CA

* Tumores Demonstrar p110 * a expressão e a activação da via PI3K que é reduzida com rapamicina tratamento que resulta na resposta do tumor e reduziu a proliferação

Após necropsia, os tumores do cólon foram isolados e preparados para seccionamento histológico. H E coloração demonstrou tecido epitelial hiperplásico e moderadamente diferenciado adenocarcinomas mucinosos invasivos como esperado no grupo placebo (Figura 3

A

, à esquerda). Nos ratinhos tratados com rapamicina, uma redução significativa na hiperplasia do tecido epitelial foi observada, e o tamanho do tumor foi reduzido (Figura 3

Um

,

direita). As células malignas colunares geralmente circundando os lagos de mucina foram embora na maioria dos tumores, resultando num menor número de células que coram fortemente para pAKT PS6 e em tumores de ratos tratados com rapamicina comparado com os controlos (Figura 3

B e C

,

respectivamente). proliferação celular diminuiu foi observado após o tratamento rapamicina como demonstrado pela diminuição da coloração Ki67 (Figura 3

D

).

Após necropsia, tecido de tumor do cólon com o tecido do cólon epitelial adjacente foi fixado em formol e incluídas em parafina incorporado, e foram submetidos a cortes histológicos. O tecido foi corado com H E (

A

). Comparado com o placebo, uma diminuição dramática no tamanho foi observada nos tumores de ratos tratados com rapamicina. O tumor retratado em

A, rapamicina

é de um rato FC3K tratada em um piloto deste estudo e escolhido para este cálculo, devido à resposta parcial dramático observado. Além disso, o epitélio colunar maligna em torno dos lagos de mucina foi diminuída após o tratamento com rapamicina quando comparada com o controlo. Menos células pakt e PS6-positivas foram observadas em tumores de ratos tratados com rapamicina, em comparação com tumores de murganhos que receberam placebo (

B

e

C,

respectivamente). a proliferação do tumor, tal como medido por Ki67, também foi reduzida em tumores de ratos tratados com rapamicina em comparação com os tratados com placebo (

D

). bar Tamanho:

A

, 1 mm.

B-D são

~ 3 × alargamentos.

A seguir ao tratamento com rapamicina, a activação a montante da via PI3K permaneceu imperturbável como esperado (Figura 4). Na necropsia, algum tecido do tumor foi flash congelado antes da preparação de proteína e quantificação. A proteína p110 *, a forma activa de PI3K dominante utilizado neste modelo, foi expressa em tumores e epitélio normal do cólon proximal em todos os animais, independentemente do tratamento. pAKT expressão significativa foi também observado nos tumores e tecidos normais de cólon proximal. O nível de pAKT não parece ser afectada pela rapamicina tratamento. Proteínas pmTOR, pSK61, e PS6 foram reduzidos em resposta ao tratamento com rapamicina na maioria dos tecidos, embora alguns tumores demonstrou claramente continuou activação destas proteínas. Os tumores com sinalização PS6 persistente tinha menos de uma resposta à rapamicina tratamento como observado na imagem PET.

Todos

FC PIK3CA *

tumores e tecido do cólon hiperplásico demonstrou expressão de p110 *, o dominante ativa subunidade catalítica de PI3K neste modelo. Isto resultou no aumento da fosforilação da AKT

9. Os níveis de pAKT e AKT total não foram alterados em resposta ao tratamento com rapamicina. níveis totais TSC2 também não variou. Os níveis de pmTOR, pSK1, e PS6, no entanto, variar com o tratamento com rapamicina. Em tumores da coorte de placebo (-), foram observados níveis elevados de PS6. Em tumores que foram tratados com rapamicina (+), a diminuição dos níveis de PS6 foram observados na maior parte dos tumores e correlacionado com o aumento da resposta de imagem PET. Aumento pErk1 /2 foi observada em alguns tipos de cancro tratados com placebo e também o tumor tratado com rapamicina com sinalização PS6 persistente.

FC PIK3CA *

tumor e tecido hiperplásico tinha aumentado caspase 3, devido ao aumento da renovação celular. Uma redução da caspase 3 clivada foi identificado nos tumores possuindo aumentada pErk1 /2 sinalização que indica que os tumores com maior pERK pode ser resistente ao tratamento rapamicina através da diminuição da apoptose. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

Resistência a rapamicina Tratamento de

FC PIK3CA *

ratos poderiam ser mediadas através animar-regulação e persistente PS6 Sinalização levando à apoptose Diminuição

Alguns tumores teve uma resposta limitada ao tratamento rapamicina. Nossa hipótese é que este pode estar relacionado ao aumento da regulação do Raf /MEK /ERK cascata de sinalização ou sinalização PS6 persistente. ERK1 /2-regulação anteriormente foi descrito em resposta ao tratamento com rapamicina [14], [15]. Níveis de pErk1 /2 foram avaliados no tecido normal do cólon, tumores do cólon proximal, e tumores cecal (Figura 4). pErk1 /2 foi encontrado para ser dramaticamente regulado para cima em um rato de cada grupo de tratamento. Em um grupo de dez tumores de

FC PIK3CA * camundongos

não tratados, seis demonstraram algum grau de pErk1 /2, indicando possível mecanismo (s) para a resistência intrínseca (Figura S5

A

). Além disso, todos os tecidos tratados com rapamicina fez exibir um aumento na pErk1 /2 em relação aos controlos. Estes dados indicam que uma subpopulação de

FC * PIK3CA

tumores possuem activação de sinalização de ERK. Esta sinalização pode ser responsável por algum grau de resistência à inibição de mTOR, uma vez que a via de ERK não é inibida com esta estratégia de tratamento. Esta resistência pode ser intrínseco ao tumor ou induzida secundário ao tratamento.

Para confirmar que a sinalização de Wnt não é aberrante nestes tumores, como descrito anteriormente, [9], foi realizada a análise histológica para examinar evidência de β nuclear -catenina. Nenhuma β-catenina nuclear foi observada em tumores de controlo (Figura S5

B

). Além disso, os restos de tumor de ratos tratados com rapamicina também foram examinados para WNT sinalização aberrante para determinar se a indução desta via pode ser um outro mecanismo de diminuir a sensibilidade destes tumores a rapamicina. Não há evidência de β-catenina nuclear foi demonstrada nos tumores dos ratos tratados com rapamicina (Figura S5

B

).

O exame histológico de um representante rapamicina resistente

FC PIK3CA *

tumor demonstraram uma morfologia semelhante a cancros dos controlos (Figura 5). Além disso, não há diferenças em termos de proliferação celular ou níveis de pAKT foram observados (Figura 5

C

). Num tumor de um ratinho de controlo, foi notada PS6 na hiperplasia da mucosa, bem como o tecido tumoral, tal como esperado (Figura 5

D

, parte inferior). No entanto, no tumor a partir de um ratinho tratado com rapamicina, foi observada uma diminuição na PS6 no tecido epitelial normal, mas PS6 sinal persistiu no tecido de cancro do remanescente (Figura 5

D

, parte superior, Figura S6

A

). A quantidade de PS6 presentes nestas células cancerígenas resistentes excede o que é visto na respondendo cancro na Figura 3. Isto indica uma resposta diferencial no tecido normal em comparação com o tecido tumoral e pode ser um mecanismo de resistência à inibição da mTOR nesta configuração.

um tumor resistentes a rapamicina (top em cada painel) e um tumor de um

FC PIK3CA *

rato (parte inferior de cada painel) foram incluídos no mesmo bloco histológico tratados com placebo. A taxa de fenótipo e proliferação semelhantes foram observados em H E e coloração Ki67, respectivamente (

A

e

B

). Não houve diferença significativa no pAKT foi observada entre os tumores do placebo e os ratos tratados com rapamicina (

C

). No tecido do rato tratado com placebo, o aumento da PS6 foi observada em tecido de tumor e tecido hiperplásico sobrejacente como esperado (

D

). Interessantemente, no tecido a partir do

FC * PIK3CA

ratinho tratado com rapamicina, diminuiu PS6 é notado no tecido hiperplásico, mas aumentou de sinalização PS6 permanece no tecido tumoral resistente, apesar de rapamicina tratamento. Isto indica que a configuração PS6 persistente dentro dos tumores pode ser o mecanismo de resistência do tumor. Este mesmo padrão de coloração foi observado em todos os tumores (3/3) com algumas células neoplásicas remanescentes após o tratamento com rapamicina, que foram examinados. barras de tamanho:

A

,

C Comprar e

D

, 1 mm;

B

, 500 mm.

Discussão

Segmentação vias oncogênicas levou a recentes avanços empolgantes em vários cancros, incluindo vemurafenib em

BRAF

melanoma mutante, erlotinib em

EGFR

mutante cancro do pulmão de células não pequenas, e crizotinib no cancro do pulmão com a translocação EMLA4-ALK [16] – [18]. Estes agentes são utilizados no estabelecimento de alterações genéticas específicas que codificam proteínas oncogénicas. Segmentação Estas proteínas do controlador resulta numa elevada taxa de resposta a agentes dirigidos contra eles. Esta abordagem permitiu a avaliação conveniente e a aprovação da FDA destes agentes para estas indicações [19]. O desenvolvimento destes agentes em configurações moleculares específicos levou à compreensão de que cada tipo histológico de cancro é realmente um conjunto de numerosos subtipos raros. Esses subtipos são cada diferenciados pelo seu perfil de mutações.

A via PI3K /AKT é a cascata de sinalização alterada geneticamente mais comum em cancro. interesse clínico importante no direccionamento da via PI3K /Akt /mTOR continua a aumentar à medida que os novos inibidores desta via continuam a ser desenvolvidos. A inibição da via PI3K em cancros possuindo

PIK3CA

mutações tem demonstrado benefício clínico em cancros da mama e doenças malignas ginecológicas, mas a presença destas mutações por si só não prever a sensibilidade dessas abordagens [20]. A subpopulação de pacientes que são mais susceptíveis de beneficiar o desenvolvimento contínuo de novos inibidores da via PI3K permanece obscura.

Até recentemente, os efeitos de uma PI3K activada no intestino de mamífero não tinha sido investigado. Fomos o primeiro a descrever o desenvolvimento de adenocarcinomas mucinosos invasivas avançadas em desenvolvimento no cólon proximal, como resultado da expressão de uma PI3K ativo dominante [9]. Curiosamente, estes tumores desenvolvem-se rapidamente, sem um componente luminal significativa ou aberrações na sinalização WNT, indicando um mecanismo não-canônico da iniciação tumor. Aqui, nós demonstramos que os tumores se formando em

FC PIK3CA *

ratos são em grande parte dependente da via PI3K. Neste modelo, uma PI3K activo dominante é expresso no cólon resulta em iniciação do tumor. Estes cancros são muito agressivos e são capazes de ser seguidos longitudinalmente, com dupla híbrido

18F-FDG PET /CT colonography. Depois de apenas duas semanas de terapia rapamicina uma resposta significativa foi observada com imagens e confirmado na necropsia. Estes resultados indicam que

FC PIK3CA *

tumores são dependentes desta via. Se tumores semelhantes estão presentes em seres humanos, a inibição da via PI3K pode resultar em benefício clínico importante para pacientes apropriados.

a hipótese de que uma subpopulação de tumores humanos formam como consequência de uma PI3K activo dominante e que estes tumores dependem desta via. Em uma série patológica recente, mutações ativadoras em

PIK3CA

foram observados mais frequentemente em cancros do cólon mucinoso em seres humanos, semelhante ao nosso modelo, e foram associadas com piora no prognóstico [21]. Mutações ativadoras em

PIK3CA

foram inversamente associados com a translocação de β-catenina [21]. A translocação da β-catenina seria esperado se estes tumores foram iniciadas pela sinalização de Wnt aberrante como parte dos mecanismos anteriormente descritos canónicos da tumorigénese em cancros do cólon [22]. Em conjunto, estas observações indicam que um subgrupo de cancros do cólon humanos surgem na fixação de PI3K activada, semelhante ao que é visto no nosso modelo. Apenas um pequeno número de tumores foram interrogados por aberrações na sinalização WNT e mutações no

PIK3CA

, investigações, assim, adicionais são necessários para melhor caracterizar esta população de pacientes. Com base nestes estudos anteriores, nós acreditamos que este provavelmente representa 1-5% de todos os cancros do cólon.

Mesmo com as respostas significativas observadas neste estudo, a resistência à terapia rapamicina foi identificado. Aumento pErk1 /2, PS6, ou ambos foram observadas em tumores persistentes apesar do tratamento rapamicina. Estes mecanismos de resistência pode ser intrínseca para os tumores induzidos ou secundário para o tratamento de rapamicina. A rapamicina é conhecido por inibir quinases S6 ribossomal (S6K1 e S6K2) através da sua interacção com mTOR [23]. A inibição da S6Ks diminui a fosforilação a jusante do S6 pelo Ser

240/244 e Ser

235/236 [24]. Estudos em S6K1 /fibroblastos de rato embrionárias S6K2 nulo confirmou que estes S6Ks foram os principais quinases afetam S6, mas também demonstrou um mecanismo dependente MEK1 /2 S6 fosforilação de Ser

235/236 [25]. Além disso, a ERK1 /2 foi demonstrada para activar a p90 ribossomal S6 quinase (RSK), que pode subsequentemente fosforila S6 em Sor

235/236 independente de mTOR sinalização (Figura S7) [26]. Em todos os tumores de

FC * PIK3CA

ratinhos, observa-se a fosforilação de S6 pensado para ser relacionada com a activação da via PI3K. Em um subgrupo de tumores, observamos também aumentou pErk1 /2 e persistente PS6. Estes dados indicam que a fosforilação alternativo de S6 mediada pela activação de ERK1 2 /de RSK pode ser um mecanismo pelo qual estes tumores são resistentes a rapamicina. As combinações de terapias específicas, provavelmente, será necessário, em algumas circunstâncias para superar estes mecanismos de resistência. PI3K e Raf /MEK /ERK regimes de combinação inibidor da via continuam a ser uma área ativa de pesquisa pré-clínica e clínica [27] – [29].

Embora a rapamicina é um inibidor conhecido de mTOR e da via PI3K, novos agentes continuam a ser desenvolvidos para atingir essa via.

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