Abstract

A evidência recente suporta um papel de microRNAs em câncer e distúrbios psiquiátricos, como esquizofrenia e transtorno bipolar, por meio de o seu papel regulador na expressão de genes múltiplos. A co-morbidade bastante raro de câncer e esquizofrenia é uma hipótese antiga, que precisa de mais pesquisas sobre microRNAs como moléculas que possam exercer a sua actividade oncosuppressive ou oncogênico no contexto do seu papel em distúrbios psiquiátricos. O padrão de uma variedade de diferentes microARNs expressão foi investigada em pacientes (n = 6) que sofrem de esquizofrenia denominado de controlo, os pacientes com um tumor sólido (N = 10) e pacientes com esquizofrenia e tanto do tumor (n = 8). miARN perfis foi realizada em amostras de sangue total usando a tecnologia de matriz miRCURY LNA microARN (6 7 geração). Um subconjunto de 3 microRNAs mostrou uma expressão diferencial estatisticamente significativa entre os grupos controle e estudo. Especificamente, observou-se significativa a infra-regulação da 7p-5p deixou-, miR-98-5p e de miR-183-5p nos grupos de estudo (tumor sozinho e tumorand esquizofrenia) (p 0,05). Os resultados do presente estudo mostraram que let-7, miR-98 e miR-183 pode desempenhar um papel oncosuppressive importante através do seu impacto regulamentar na expressão do gene, independentemente da presença de esquizofrenia, embora um maior tamanho da amostra é necessária para validar esses resultados . No entanto, mais estudos são necessários a fim de destacar um possível papel destes e de outros micro-RNAs nas vias moleculares da esquizofrenia

Citation:. Rizos E, Siafakas N, Katsantoni E, Skourti E, Salpeas V, rizos I, et al. (2015) Deixe-7, Mir-98 e Mir-181 como biomarcadores para o câncer e esquizofrenia. PLoS ONE 10 (4): e0123522. doi: 10.1371 /journal.pone.0123522

Editor do Academic: James D. Clelland, O Instituto Kline Nathan, United States |

Recebido: 09 de agosto de 2014; Aceito: 20 de fevereiro de 2015; Publicação: 09 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Rizos et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a esquizofrenia e câncer compartilham um amplo espectro de fenótipos clínicos e um fundo biológico complexo, implicando um grande número de fatores genéticos e epigenéticos [1]. Além disso, estas duas condições parecem partilhar uma etiologia suspeita que inclui a influência de vários componentes transcriptomic, sugerindo que a regulação epigenética da expressão do gene através da acção de miARN pode representar uma característica comum central na co-incidência baixa de esquizofrenia e cancro [2 ]. Há uma hipótese de idade sobre a co-ocorrência bastante rara da esquizofrenia e câncer. Estudos anteriores, de base populacional têm mostrado a diminuição da incidência de carcinogênese em patiens esquizofrénicos [3]. Desde então, várias especulações foram feitas sobre a base molecular possível para estas observações, mas não houve resultados específicos foram registrados até agora.

Tem havido um interesse crescente sobre o papel dos microRNAs como fatores regulatórios na etiologia e fisiopatologia das principais doenças psiquiátricas, como a esquizofrenia, autismo, transtorno bipolar etc [4-6]. MicroRNAs são uma classe de pequenos RNAs, não-codificante, que desempenham um papel importante em vários processos biológicos [7], incluindo ambos os distúrbios psiquiátricos e carcinogénese. miARNs parecem ter um controlo pós-transcricional da expressão do gene, resultando na estimulação do silenciamento de genes ou a expressão do gene [8]. Estudos recentes revelaram as funções específicas de miRNAs no desenvolvimento do cérebro [9,10], em desordens do desenvolvimento neurológico [11] e no armazenamento de memória de longo prazo [12]. O papel de miARNs na carcinogénese Também foi estabelecido em um grande número de relatórios. Foi recentemente revelado que 98 de 186 genes de miARN localizados em regiões genómicas associadas a cancro, podem ser frequentemente encontradas em diferentes tipos de tumores, ao passo que a expressão alterada de deixá-7 e miR-155 em cancro do pulmão foi correlacionado com a sobrevivência de pacientes [13,14].

não há nenhuma evidência satisfatória até agora sobre a possível papel regulador dos miRNAs na co-morbidade co-incidência e da esquizofrenia e câncer. No nosso estudo anterior, uma sub-regulação significativa de miR-183 em um grupo de pacientes com ambas a esquizofrenia e a doença foi observada em comparação com pacientes esquizofrénicos, fornecendo uma primeira indicação de que o miR-183 pode desempenhar um papel na regulação da expressão de outras genes com actividade supressora de onco-[15]. No presente estudo, um tamanho de amostra maior, que agora está incluído outro grupo de estudo de pacientes com câncer só foi investigado sobre expressão de muitos RNAs diferentes, em uma tentativa de fornecer mais informações sobre a explicação molecular possível da baixa incidência de risco de câncer entre esquizofrênico pacientes.

Materiais e Métodos

assuntos

Vinte e quatro pacientes foram recrutados a partir do Hospital Psiquiátrico de Ática e do Ambulatório de Oncologia do “Attikon” University Hospital Geral a partir de fevereiro 2011 até dezembro de 2012. a apresentação esquemática dos dois grupos de pacientes controle e estudo é mostrado na Figura 1, enquanto que a informação clínica mais detalhada é fornecida na Tabela 1. Estes pacientes foram avaliados por SCID-IV [16] e pela positiva e sub-escalas negativos síndrome (PANSS) [17]. Os critérios de exclusão incluíram uma história de qualquer doença neurológica e mau uso atual ou dependência nos últimos 6 meses, conforme definido pelo DSM-IV [18]. Todos os pacientes estavam em um estado psicológico estabilizados ea medicação foi mantida inalterada durante os últimos 6 meses, pelo menos. O diagnóstico de câncer foi feita de acordo com os registros médicos do paciente.

Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre as médias das idades do controle e os grupos de estudo (teste t de Student,

p

= 0,36)

O grupo controle consistiu de 6 pacientes (M /F:. 2/4, idade 48-78 anos) que sofrem de transtorno esquizofrênico crônico, que não tinha nenhuma evidência de doença do cancro (Fig 1). Os critérios de inclusão para o grupo controle foram pesos corporais dentro de 10% de um índice de massa corporal adequada, há outras doenças graves, exceto a esquizofrenia, valores laboratoriais anormais clinicamente significativos e não há achados patológicos no exame clínico completo. Além disso, todos os indivíduos do grupo de controle não tinha história de hipersensibilidade (asma, urticária e eczema), doenças auto-imunes, como lúpus eritematoso sistêmico, hipertensão não controlada ou cardíaca grave, pulmão, fígado ou condição renal.

O estudo grupo era composto por 18 pacientes (M /F: 8/10, idade 49-87 anos) que sofrem tanto de ambos esquizofrenia e câncer (N = 8), ou câncer só (N = 10) (Fig 1). Os critérios de exclusão incluíram uma história de qualquer doença neurológica e mau uso atual ou dependência nos últimos 6 meses, conforme definido pelo DSM-IV [18]. Todos os pacientes estavam em um estado psicológico estabilizados ea medicação foi mantida inalterada durante os últimos 6 meses, pelo menos. O diagnóstico de câncer foi feita de acordo com os registros médicos do paciente. Os pacientes que sofrem de câncer só não tinha história de sintomas psiquiátricos e eles tinham uma história familiar negativa de qualquer transtorno psiquiátrico.

Todos os pacientes esquizofrênicos estavam em um estado psicológico estabilizado e sua medicação foi mantida inalterada durante a última 6 meses, pelo menos. história de tabagismo, mas não história recente ( 1 ano) do alcoolismo, drogas ou dependência de drogas foram autorizados nos critérios de inclusão para ambos os grupos. Todos os participantes do sexo feminino foram testados e não estar grávida. Todos os pacientes esquizofrênicos estavam em tratamento médico regular com antipsicóticos. Todos os participantes foram capazes de comunicar de forma eficaz, foram informados sobre a natureza do estudo e forneceu consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo comitê de conselho de revisão institucional e ética de ambos os hospitais participantes (University Hospital Geral “Attikon”, Hospital Psiquiátrico da Ática) e foi conduzido de acordo com as Boas Práticas Clínicas princípios e as normas locais aplicáveis. Os pacientes com esquizofrenia foram acompanhados clinicamente por um ano após a coleta de sangue para o presente estudo e não mostrou nenhuma evidência de doença cancerosa.

Coleta de amostras e preservação

miRNA perfil para cada paciente foi realizada em conjunto amostras de sangue. A preservação do estado das amostras a expressão do gene foi conseguido através da recolha de 500 ul de sangue inteiro de cada paciente a um tubo RNAprotect animal de sangue (Qiagen, Hilden, Alemanha). Após inversão suave, os tubos foram incubados durante 2 h à temperatura ambiente, de acordo com as instruções do fabricante, a fim de permitir a lise celular eficiente. Todos os tubos foram depois armazenadas a -80 ° C antes da purificação de ARN.

purificação de ARN, controlo de qualidade e de miARN array de perfis

purificação de RNA total que continham miARN foi realizada utilizando o RNeasy proteger animais Blood kit (Qiagen). Todas as experiências que incluíam controle de amostra de RNA qualidade, miRNA profiling e análise foram conduzidas por Serviços Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). Resumidamente, ARN de controlo de qualidade e medição foram realizadas utilizando um Agilent Bioanalyzer 2100 e um instrumento NanoDrop. 300 ng de ARN total de ambas amostra e de referência foram, então, marcadas com um marcador fluorescente e Hy3 hY5, respectivamente, utilizando o kit de etiquetagem miRCURY LNA microARN Hi-Power, Hy3 /hY5 (Exiqon, Dinamarca), seguindo o procedimento descrito pelo fabricante. As amostras Hy3-rotulados e uma amostra de RNA de referência hY5 marcado foram misturados por pares e hibridado com a miRCURY LNA microRNA matriz 7º (Exiqon, Dinamarca), que contém sondas de captura dirigidos a todos os microRNAs para o homem, rato ou rato registrado no miRBase 18.0. A hibridação foi efectuada de acordo com o manual de instruções matriz miRCURY LNA microARN usando uma estação de hibridação Tecan HS4800 (Tecan, Áustria). Após a hibridação os diapositivos de microarray foram digitalizados e armazenados em um ambiente livre de ozono (nível de ozono inferior a 2,0 ppb), a fim de impedir que o potencial de branqueamento dos corantes fluorescentes. As lâminas de matriz miRCURY LNA microRNA foram escaneados usando o G2565BA Microarray Sistema Agilent Scanner (Agilent Technologies, Inc., EUA) e da análise de imagens foi realizada utilizando o Imagene 9 (miRCURY LNA microRNA matriz Software Análise, Exiqon, Dinamarca). Os sinais quantificados foram fundo corrigida (Normexp com valor de deslocamento 10) [19] e normalizada usando o Lowess global (Scatterplot localmente ponderadas Smoothing) algoritmo de regressão. controlos espiga no foram adicionados em várias concentrações em ambas as Hy3 e as reacções de etiquetagem hY5 para avaliar a reacção de marcação, a hibridação, e o desempenho do experimento matriz.

A análise dos dados (não supervisionada e análise de expressão)

Análise de componentes Principais (PCA) foi aplicado a fim de explorar as classes de amostra naturalmente decorrentes com base no perfil de expressão. Um diagrama de mapa de calor foi produzido, que mostrou os resultados de uma de duas vias de agrupamento hierárquico de microRNAs e amostras. O agrupamento foi feito usando o método complete-linkage em conjunto com a medida de distância euclidiana.

A significância estatística da expressão relativa de miRNAs entre os grupos controle e estudo foi determinada utilizando o teste t de Student. Além disso, o método de ajuste de testes múltiplos Benjamini-Hochberg foi aplicada ao

P

-Valores para o controlo de possíveis resultados falsos positivos.

Os resultados da análise de microarray foram submetidos a Gene Expression Omnibus e atribuído o número de acesso GSE65143.

resultados

no total, 322 miRNAs diferentes foram analisados ​​pela matriz miRCURY LNA miRNA. A Fig 2 mostra um diagrama de mapa de calor que mostra a expressão das 50 miARNs com o maior desvio padrão em todas as amostras. A análise estatística dos resultados mostraram, em primeiro lugar, que não existiam diferenças significativas nos perfis de expressão entre os grupos de estudo 2 (pacientes com a formação de esquizofrenia e de tumor e pacientes sem esquizofrenia, mas com a formação de tumor), como também depsicted na trama APC da Figura 3. no entanto, a análise identificou deixá-7P-5p, miR-98-5p e miR-183-5p com uma diferenciação altamente significativa do seu perfil de expressão (

p Art 0,05, após a aplicação do método de ajuste de múltiplos testes Benjamini-Hochberg) entre o grupo controle (pacientes com esquizofrenia, mas sem formação de tumores) e dois grupos de estudo (pacientes com /sem esquizofrenia, mas com a formação de tumores). Estes 3 microARNs expressos diferencialmente foram regulados negativamente em ambos os grupos de estudo, como se mostra na Fig 2.

A escala de cor ilustra o nível de expressão relativa de miARNs e, especificamente, a cor vermelha representa um nível de expressão baixo do canal de referência, Considerando cor verde representa uma expressão maior do que o de referência. Cada linha representa um microRNA e cada coluna representa uma amostra. A árvore microARN agrupamento é mostrado à esquerda. Os grupos controle e de estudo estão claramente indicadas com cores diferentes. Amostras S9-S13, S16, S18 S19 correspondem ao grupo de estudo de pacientes com esquizofrenia e formação de tumores, enquanto que amostras S21-S30 correspondem ao grupo de estudo de pacientes com tumor formação única. Os 3 miARNs, a expressão de que foi encontrado para ser significativamente mais elevado nas amostras do grupo de controlo de doentes, também são indicados.

A análise de componente principal foi realizada em todas as amostras, e no 50 principais microRNAs com o maior desvio padrão. Os valores da razão de log normalizados têm sido usados ​​para a análise. As características foram transferidas para ser zero centrada, (isto é, o valor médio entre as amostras é deslocado para 0) e dimensionado para ter variância unitária (isto é, a variação entre as amostras é dimensionado para 1) antes da análise. As amostras C2-C5, C7 C13 correspondem ao grupo de pacientes controle, enquanto códigos de amostra começam com o S correspondem aos 2 subconjuntos do grupo de estudo, designado e colorido separadamente como na figura 2.

Discussão

é geralmente conhecido que as células cancerosas mostram uma diminuição nos níveis de apoptose, enquanto que as doenças neurodegenerativas, tais como a esquizofrenia, são marcadas por um aumento da apoptose. Durante o presente estudo, houve uma tentativa para determinar se o possivelmente fraca associação entre o câncer e esquizofrenia podem estar associados a determinados perfis de expressão de miRNA. Estes dados forneceram uma visão preliminar sobre a expressão diferencial de 3 miRNAs em correlação com câncer só e não tanto com esquizofrenia e câncer, ao contrário do que inicialmente esperado, embora um tamanho de amostra maior de pacientes com esquizofrenia e /ou câncer ainda é necessária para se obter conclusões mais representativas. Especificamente, foi observado um aumento estatisticamente significativo a sub-regulação da 7g-5p deixou-, miR-98-5p e miR-183-5p no grupo de estudo de doentes (doentes com tumores sólidos e pacientes com esquizofrenia e tumor) (p 0,05), fornecendo uma indicação sobre o seu papel na incidência de câncer. elevados níveis de expressão destes miARNs podem levar a elevados níveis de apoptose e, assim, permitir que a incidência de esquizofrenia. Contudo, os baixos níveis observados de expressão dos mesmos miARNs em um certo grupo de pacientes com esquizofrenia e cancro, possivelmente causando uma diminuição nos níveis de apoptose e, portanto, tornando-os propensos ao desenvolvimento de tumores malignos, pode indicar o desenvolvimento da esquizofrenia devido alterações em vias moleculares independentes destes miARNs. Além disso, a teoria do neurodesenvolvimento e neurotoxicidade tem um papel dominante na sua patofisiologia e, portanto, a regulação negativa de deixá-7, 98-miR-183 e miR podem proporcionar um possível explicação molecular.

let-7 é um miARN que nunca foi estudado em relação a perturbações neurológicas, tais como a esquizofrenia. No entanto, em relação à doença de Parkinson (DP), menciona-se que em um

Caenorhabditis elegans

modelo de let-7 é regulada em estirpes que carregam uma mutação típico no gene da alfa-sinucleína (A53T) e em estirpes com mutações no gene PDR-1 [20]. Além disso, o aumento dos níveis de deixá-7 foram encontrados para atenuar os efeitos patogénicos LRRK2, uma molécula que é muito frequentemente mutado em ambas PD familiar e esporádica [21]. Na doença de Alzheimer (AD), a APP-like-1 expressão foi mostrada para ser modulada pela actividade de deixar-7 família [22]. Em outro estudo, deixou-7 foi encontrada para activar o receptor de tipo Toll 7 e, subsequentemente, causar a neurodegeneração [23]. No que respeita à implicação de deixá-7 no cancro, tem-se mencionado que este miARN inibe a invasão celular e migração no cancro de não pequenas células do pulmão (NSCLC) [24]. Além disso, um estudo recente destaca a implicação de deixá-7 em células sensibilizadas fluorouracil-resistente humanas de hepatoma [25]. Além disso, a baixa expressão de let-7 prediz mau prognóstico em pacientes com múltiplos tipos de câncer [26]. De acordo com outro estudo, deixou-7 regula negativamente a fosforilação STAT3 em células de cancro do pâncreas, aumentando a expressão SOCS3 [27].

miR-183 é um miARN que nunca foi correlacionada com doenças neurodegenerativas, no passado, com a excepção de um estudo recente em que o possível papel supressor de miR-183 nas vias neurobiológicos envolvidos na esquizofrenia foi destacado [15]. Mir183 foi recentemente implicada na modulação de diferentes estágios de apoptose e autofagia através da regulação da apoptose e genes relacionados com a autofagia [28-30]. Em específico, knock-down de mir-183 expressão pode induzir a morte celular autofágica em câncer medular da tiróide, através da regulamentação de algumas supressor tumoral vias de sinalização, indicando que o miR-183 pode ser um alvo terapêutico atractivo [31]. O papel oncogênico dos miR183 Também foi revelado em um estudo recente, visando a EGR1 fator de transcrição e promovendo a migração de células tumorais em diferentes tipos de câncer, como sarcomas e tumores do cólon [32]. Portanto, parece que o miR-183 no presente estudo podem ter desempenhado um papel supressor de tumor, em vez, por provavelmente activação da expressão de genes supressores de tumores que controlam a diferenciação celular ou a apoptose, tal como previamente descrito [33].

o perfil de expressão, bem como o papel funcional de miR-98 em doenças neurológicas, tais como a esquizofrenia, não foi ainda elucidada. foi feita a única referência a tal associação num estudo recente, onde a expressão de miR-98 foi regulada nos casos de alterar o stress pré-natal, assim, as respostas inflamatórias no cérebro [1]. Na AD, miR-98 exibido significativamente diferentes níveis de expressão em pacientes comparados com os controles [34]. miR-98 também tem sido demonstrado que moléculas alvo que foram associados a diferentes formas de cancro, tais como HMGA2, a qual exerce um efeito de transformação em células de cancro do pulmão [35], IRS2, uma proteína que é sobre-regulada no cancro colo-rectal que leva a um aumento na sinalização Wnt [36] e IGF2BP que foi documentado para promover o carcinoma hepatocelular [37]. Outras moléculas que estão envolvidos na tumorigénese e são alvo de miR-98 incluem N-Ras [38], SNAP23 [39], IMPDH1 [40] e muitos outros.

Tal como anteriormente referido, o tamanho bastante pequena amostra possivelmente, constitui um fator limitante do presente estudo. No entanto, deve-se afirmar que, à luz da grave dificuldade para recrutar pacientes que apresentam esquizofrenia e câncer como uma comorbidade, este foi o primeiro estudo clínico que tentou fornecer algum insight preliminar sobre o possível baixo risco de câncer em pacientes com esquizofrenia por analisar um grande número de miARNs em doentes com ambas as doenças e os doentes com esquizofrenia quer única ou cancro. Além disso, o nível de expressão de miARNs foi analisada em sangue e não no cérebro, o que representa, assim, uma análise indirecta de níveis miARNs cerebrais de expressão e, como consequência, os dados sobre uma predisposição genética geral sobre a implicação de deixá-7, miR -98 e miR-183 na co-morbidade da esquizofrenia e câncer foram recolhidos.

em conclusão, o presente estudo reforçou ainda mais o papel importante de let-7, miR-98 e miR-183 na carcinogênese, mas não há miARNs foram encontrados estar envolvida na co-incidência do cancro e de esquizofrenia, como era o objectivo. Novos estudos com amostras maiores ainda são necessários, a fim de investigar o papel dos miRNAs e outras vias moleculares no co-incidência muito baixa de câncer e esquizofrenia.