Abstract

Não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) é uma das mais principais causas de câncer mortes relacionados com todo o mundo. Paclitaxel terapias de combinação baseados têm sido muito utilizados como um tratamento padrão no CPNPC agressivos. Mas a resistência paclitaxel emergiu como um problema clínico importante na luta contra o cancro do pulmão de células não pequenas e autofagia é um dos mecanismos importantes envolvidas neste fenómeno. Neste estudo, foram utilizados microRNA matrizes (miRNA) para a tela miRNAs diferencialmente expressos entre as células de câncer de pulmão sensíveis paclitaxel A549 e sua variante celular paclitaxel-resistente (A549-T24). Foram identificados miR-17-5p foi um dos mais miARNs significativamente regulada negativamente em células de cancro de pulmão resistente a paclitaxel em comparação com células parentais sensíveis paclitaxel. Descobrimos que a sobre-expressão de células de câncer de pulmão resistente paclitaxel sensibilizados miR-17-5p ao paclitaxel induzida morte celular por apoptose. Além disso, neste relatório foi demonstrado que o miR-17-5p se liga directamente à 3’UTR do beclin um gene, um dos mais importantes modulador autofagia. Superexpressão de miR-17-5p em células de câncer de pulmão resistente paclitaxel reduzida beclin1 expressão e um falecimento concordante em autofagia celular. Também observamos resultados semelhantes em outro paclitaxel pulmão resistentes células carcinoma adeno (H596-TxR). Nossos resultados indicaram que a resistência paclitaxel de câncer de pulmão está associado com a regulação negativa de miR-17-5p expressão que pode causar upregulation de expressão BECN1

Citation: Chatterjee A, Chattopadhyay D, Chakrabarti G (2014) miR-17. -5p regulação negativa contribui para a resistência Paclitaxel de células de câncer de pulmão através da alteração Beclin1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e95716. doi: 10.1371 /journal.pone.0095716

editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, França |

Recebido: 02 de dezembro de 2013; Aceito: 29 de março de 2014; Publicação: 22 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chatterjee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por uma concessão do Departamento de Biotecnologia, Govt. da Índia (No. BT /PR12889 /AGR /36/624/2009) para GC. AC foi apoiado por uma bolsa da mesma concessão, e, posteriormente, uma bolsa do Programa DST- bolsa, Universidade de Calcutá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais comuns e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer no mundo. Quase 85% dos casos de câncer de pulmão pertencem aos não-cancro do pulmão de células pequenas (NSCLC) [1]. Paclitaxel quimioterapias de combinação baseadas agora estão sendo considerados como terapias padrão para quase todos os pacientes diagnosticados com NSCLC [2]. O paclitaxel liga-se à subunidade β- de α- heterodímero β tubulina, estabiliza microtúbulos, reduz a sua dynamicity no fuso mitótico, faz com que L

2 /H paragem do ciclo celular e dirige as células cancerosas à morte apoptótica, activando verificação mitótico spindle- ponto [3]. Infelizmente, a afetividade clínico de paclitaxel é limitada porque alguns tumores apresentam resistência ou tornar-se resistente a ela após repetidos ciclos de quimioterapia baseada paclitaxel que finalmente leva à reincidência e mau prognóstico. Os mecanismos mais relatados de resistência paclitaxel envolve a regulação positiva da P-glicoproteína e bombas de efluxo de drogas relacionados [4], [5], a interação inadequada com os microtúbulos do fuso devido a modificação pós-tradução ou expressão alterada de isotipos de tubulina e proteínas associadas a microtúbulos [6] – [8] ou alteração funcional na sinalização celular e percursos de sobrevivência celular [9] – [12]. Estudos recentes mostram que a indução autophagic por paclitaxel desempenha um papel importante no desenvolvimento da resistência em células de tumor paclitaxel [13] – [15]

MicroRNAs, uma família altamente conservadas de ARN que codificam, não-pequenas que recentemente. emergiu como nova classe de moduladores de expressão de genes ao nível pós-transcricional [16] – [18]. Isto ocorre por meio de emparelhamento de bases perfeito ou imperfeito para os elementos de reconhecimento de miARN (MRE) dentro da região não traduzida a 3 ‘(UTR) do ARNm-alvo, resultando na desestabilização ARNm e translacional repressão [16], [19], [20]. expressão miRNA aberrante tem sido freqüentemente observada em vários cancros humanos, incluindo NSCLC [21], [22]. Nos últimos anos, foram feitas tentativas para correlacionar a desregulação da expressão particular miRNA com capacidade de resposta do tumor às quimioterapias, incluindo paclitaxel [13], [23] – [26].

Neste estudo, nós estávamos interessados ​​para examinar o papel de miARN no desenvolvimento de resistência paclitaxel em células do cancro do pulmão relacionadas com autofagia. Foi realizada matrizes miRNA para a tela miRNAs diferencialmente expressos entre paclitaxel sensíveis (A549) e paclitaxel cancro do pulmão células resistentes (A549-T24). Identificamos que miR-17-5p foi regulada negativamente em células paclitaxel resistentes do cancro do pulmão (A549-T24 e H596-TxR) e sua superexpressão promover paclitaxel citotoxicidade induzida e apoptose. Além disso, nossos dados demonstram que beclin1, um dos reguladores mais importantes da autofagia celular, era um alvo direto de miR-17-5p em células de câncer de pulmão.

tomados em conjunto todos os resultados concluímos que miR-17 -5p desempenhou um papel crítico no desenvolvimento da resistência ao paclitaxel, regulando autofagia celular. Supressão da expressão de miR-17-5p foi associada com a regulação positiva da expressão beclin1 e autofagia concordantes que desempenhou um papel cito-protectora e protegeu as células contra a apoptose induzida por paclitaxel e morte celular.

Materiais e Métodos

Materiais

mistura de nutriente meio de eagle modificado por Dulbecco (suplementado com 1 mM de L-glutamina), soro fetal de bovino, penicilina-estreptomicina, anfotericina B e 0,25% de tripsina-EDTA foram adquiridos a GIBCO (Invitrogen) . O paclitaxel foi adquirido da Sigma, EUA. kit de apoptose AnnexinV-FITC foi de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). JC-1 e H2-DCFDA foram adquiridos da Sigma, EUA. Bradford kit de estimativa de proteína foi comprado de Genei, Índia. Todos os outros produtos químicos e reagentes foram de grau analítico e foram adquiridos de Sisco Research Laboratories, na Índia.

Linha Celular e Cultura de Células

Humano não-pequenas de pulmão epiteliais linha de células de adenocarcinoma Tipo II, A549, foi obtido a partir do repositório de células do Centro Nacional para Cell Science (NCCS), Pune, índia. pulmão humano de células de carcinoma adeno linha NCI-H596 foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC). Ambas as células foram caracterizados por mt-rDNA para identificação de espécies, curta repetição em série de perfis e análise de isoenzimas para autenticação linha de células e foram confirmados para ser negativo para contaminação por micoplasma pelo repositório. Ambas as células foram seleccionadas A549 e H596 para resistência ao paclitaxel (Sigma, EUA) de um modo passo a passo, essencialmente como descrito [27], [28]. Resumidamente, as células A549 foram inicialmente expostas a 2 nM de paclitaxel e uma vez que o crescimento normal foi atingida a dose da droga foi aumentada nos múltiplos de dois até uma concentração final de 24 nM de paclitaxel (A549-T24) foi alcançado. Para as células NCI-H596, que eram um pouco tolerante ao paclitaxel, foram primeiro expostas 5 nM de paclitaxel e mantida a esta concentração até que o crescimento normal foi atingida. Posteriormente, a dose da droga foi aumentada nos múltiplos de três até se obter uma dose final de 15 nM de paclitaxel (H596-TxR). Ambas as células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 1 L- mM de glutamina, 10% de soro bovino fatal, 3,7 g /l de NaHCO

3, 100 ug /mL de cada um de penicilina e estreptomicina e 2,5 ug /mL de anfotericina B. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. As células foram cultivadas até 70-80% de confluência em balões de cultura de tecidos, em seguida, tripsinizadas com 0,25% de EDTA tripsina e divididas em placas de cultura subsequentes, conforme necessário.

miARN micro matriz Expressão Análise

miARN perfis de A549 e células A549-T24 foram feitas a partir de Exiqon (Vedbaek, Dinamarca). O ARN total incluindo miARN foi extraído a partir de células A549 e A549-T24 utilizando Qiagen Mini Kit miRNeasy seguindo o protocolo do fabricante. As amostras de RNA total com a qualidade adequada para análise por plataforma de microarray miRCURY LNA miRNA foram marcadas usando o Labelling Kit miRCURY LNA microRNA Hi-Power, Hy3 /hY5 e pares de amostra foram hibridizados na matriz miRCURY LNA microRNA (6th gen – HSA, mmu rno) e a matriz foi lido em Agilent G2505B Micro sistema de scanner matriz em um ambiente de ozono livre. Apenas os miRNAs que foram desregulados por pelo menos duas vezes (ΔLMR ≥2) foram levados em consideração.

Pré-miRNA transfecção

Mirvana miRNA 17 precursores imitar (pré-miR-17-5p ) e Mirvana miRNA mimetizador de controle negativo # 1 (controle pré-miR-negativo) foram adquiridas da Ambion. Pré-miARNs foram transfectados para linhas celulares a -50% de confluência a 100 nM de concentração de reagente de transfecção com lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen). Quarenta e oito horas após a transfecção, a expressão de miR-17-5p foi detectado por PCR em tempo real e a expressão de BECN1 foi testada por qRT-PCR e /ou transferência de Western.

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

Para análise de expressão de miARN, qRT-PCR foi realizado usando o kit TaqMan microARN transcrição inversa (Applied Biosystems) e TaqMan microARN kit de ensaios (Applied Biosystems) seguindo os protocolos do fabricante. U6 snRNA serviu como o controlo interno.

Para analisar a expressão de BECN1, Bax, Bcl-2, LC3-II e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e caspase-3 (Tabela 1), os ADNc foram sintetizados a partir de 1 ug de ARN total utilizando o kit de síntese de ADNc SuperScript VILO (Invitrogen). O ADNc foi misturado com 2 × dínamo ColorFlash mistura SYBR Green qPCR mestre (Thermo Scientific) e vários conjuntos de iniciadores específicos para o gene e, em seguida, submetido a quantificação de qRT-PCR utilizando o sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems) StepOne- Plus. a expressão do gene foi calculada em relação ao GAPDH (por BECN1, Bcl-2, Bax, LC3-II, caspase-3, etc) ou snRNA U6 (para miR-17-5p) método usando o tempo de ciclo comparativo (Ct) (2

método -ΔΔCt) [29], [30].

proliferação celular Ensaio de Inibição (MTT Assay)

A549-T24 e H596-TxR células, quer transfectadas com 100 nM pré-miR-17-5p (T24-miR-17-5p e TxR-miR-17-5p respectivamente) ou com 100 nM RNA controle pré-miR-negativo (T24-miR-NC e TxR-miR-NC respectivamente) foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poços (1 × 10

4 células por poço). Após 24 h de incubação, o meio foi substituído com meio fresco e as células foram tratadas com diferentes concentrações de paclitaxel durante mais 24 h. MTT (5 mg /ml) dissolvido em PBS e esterilizadas por filtração, em seguida, 20 uL da solução preparada foi adicionado a cada poço. Isto foi incubado até precipitado púrpura foi visível. Subsequentemente, 100 mL de Triton-X100 foi adicionado a cada poço e incubou-se no escuro durante 2 h à temperatura ambiente. A absorvância foi medida num leitor de ELISA (MultiskanEX, LAB SYSTEMS, Helsínquia, Finlândia) a um comprimento de onda de teste de 570 nm e um comprimento de onda de referência de 650 nm. Os dados foram calculados como a percentagem de inibição pela seguinte fórmula:. (1)

A

T e A

s indicados a absorvância das substâncias de teste e controlo de solvente, respectivamente [31]

azul de Tripano ensaio de exclusão para viabilidade celular

ensaio de exclusão azul de tripano [32] foi usado para determinar o número de células viáveis ​​e mortas após transfecção pré-miR-17-5p e subsequente tratamento com paclitaxel. Resumidamente, as células T24-miR-17-5p ou T24-miR-nc foram plaqueadas em placas de cultura de 6 poços (5 x 10

4 células por poço). Em seguida, as células foram tratadas com 24 nM e 50 nM de paclitaxel durante mais 24 h. Após 24 h as células foram colhidas através de tripsinização, lavadas duas vezes com 1X PBS, e depois coradas com 0,4% azul tripano em PBS. As células foram então preparadas para análise por citometria de fluxo.

Construção de luciferase repórter Constrói e luciferase Ensaio de Actividade

As construções repórter 3’UTR-luciferase contendo o 3’UTR de BECN1 com ou sem miR -17-5p local de ligação foram amplificados por PCR a partir de ADNc totais preparados a partir de ARN total obtido a partir de células A549-T24. Os produtos de PCR foram clonados em

vetor

repórter-PCI-neo-RL luc (A generosa oferta do Dr. SN Bhattacharyya, IICB, Kolkata, na Índia.) Entre

Xba

I e

not * I sítios de restrição, imediatamente a jusante do gene da luciferase de Renilla. Todas as construções de luciferase foram sequência é verificada. As células foram transitoriamente co-transfectadas com plasmídeos repórter Renilla luciferase (

pCI-neo-RL-Bec-3

‘

UTR-wt

ou

pCI-neo-RL-Bec-3

‘

UTR-mut

), vaga-lume plasmídeo luciferase (

pGL3-FF

) e pré-miR-17-5p precursor e /ou anti-miR-17-5p ou pré RNA precursor controle -miR-negativos utilizando o reagente de transfecção lipofectamine2000 seguindo o protocolo do fabricante. Após 48 h de transfeco, as culas foram colhidas e lisadas com tampão de lise passiva (Promega). As actividades de luciferase nos extractos celulares foram determinadas utilizando Promega duplo de luciferase kit de ensaio de repórter num sistema de Leitor de placas VICTOR X3 (PerkinElmer). As actividades de luciferase relativas foram calculados pela relação de Renilla actividade Luc /luc do vaga-lume e normalizados para que a das células de controlo e foi calculado dobra repressão. vector pGL3-FF foi utilizado como controle interno.

Detecção de Ácido vesicular Organelos (avos)

Para observar a redução na formação de avos, T24-miR-17-5p e T24-miR células -NC foram semeadas em lamelas. Depois de 48 horas de transfecção, as células foram coradas com laranja de acridina (AO) (1 ug /ml) a 37 ° C no escuro durante 15 min, depois foi lavada duas vezes com PBS. Imagens de coloração AO foram visualizados imediatamente, usando microscópio de fluorescência (Olympus IX70, Japão). O citoplasma e núcleo de células coradas fluorescência verde brilhante, enquanto que os vacúolos autofágicos ácidas fluorescência vermelha brilhante. Experiências semelhantes foram também realizados com células A549.

Para quantificar a alteração no número de vesículas ácidas (avos) na A549, células T24-T24 de miR-17-5p-miR-NC e, que foram coradas com AO (1 ug /ml) em PBS a 37 ° C durante 15 min, as células foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em 500 ul de PBS e, em seguida, analisadas imediatamente por citometria de fluxo de ensaio. Os dados de citometria de fluxo foi analisada com o software de análise CellQuest (Becton Dickinson) [33].

Rotulagem de autofágica Vacúolos com Monodansylcadaverine

células A549-T24 foram transfectadas quer com pré-miR-17- 5p (100 nM) ou com pré-miR- ARN de controlo negativo (100 nM), semeadas em lamelas e mantido durante mais 48 h. As células foram incubadas com 50 uM monodansylcadaverine durante 10 min a 37 ° C em PBS e imagens foram obtidas por microscópio de fluorescência (Olympus IX70, Japão). Além disso, para a análise quantitativa das mesmas amostras de formação autophagosome foram tratadas com tripsina e analisada por citometria de fluxo de ensaio [34].

análise citométrica de fluxo de células apoptóticas

T24-miR-NC e T24-miR- 17-5p células foram tratadas com 24 nM e 50 nM de paclitaxel durante 24 h. Cerca de 1 × 10

5 células foram então coradas durante 15 min à temperatura ambiente no escuro com FITC-conjugado annexinV (1 ug /ml) e iodeto de propídio (PI) (0,5 ug /ml) num Ca

2 + enriquecida em tampão de ligação e analisado através de um ensaio de citometria de fluxo de duas cores. emissões AnnexinV e PI foram detectadas em FL1 e FL2 canais de um fluxo FACSCalibur citómetro (Becton-Dickinson, EUA), respectivamente [31]. Os dados foram analisados ​​utilizando o programa CellQuest da Becton-Dickinson

Determinação da Membrana Mitocondrial Potencial (ΔΨ)

Para avaliar o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ), 5,5 ‘, 6,6. ‘-tetrachloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC-1), uma sonda fluorescente sensível para ΔΨ foi utilizado [35]. células T24-miR-NC e T24-miR-17-5p foram tratadas com 24 nM e 50 nM de paclitaxel durante 24 h. As células foram então recolhidas, lavadas duas vezes com PBS, coradas com 5 uM JC-1 durante 30 min a 37 ° C no escuro. As células foram lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 500 ul de PBS e imediatamente avaliada para a fluorescência vermelha (JC-1) com o citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson, EUA).

Medição de espécies de oxigénio reactivos (ROS)

ROS foram determinadas usando o marcador fluorescente 2 ‘, 7’- diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-dA) [36]. Resumidamente, as células T24-T24 de miR-17-5p-miR-NC e foram tratadas com 24 nM e 50 nM de paclitaxel durante 24 h. As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e incubadas com 10 mM de DCFH-DA, durante 30 min no escuro à temperatura ambiente e a mudança na intensidade de fluorescência verde, tal como detectado no canal FL1, foi seguido por citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson, EUA) e os dados foram analisados ​​com o software de análise CellQuest (Becton-Dickinson, EUA).

análise estatística

reacções de qRT-PCR foram corridos em triplicado para cada amostra e repetidos pelo menos 3 vezes e os dados foram analisados ​​estatisticamente com o “teste t” de Student ou Wilcoxon rank sum. IC

50 dados do ensaio de MTT foram analisados ​​com o teste de Wilcoxon rank sum. Todos os dados foram apresentados como a média ± S.E. (Erro padrão). Duas medidas foram estatisticamente significantes se o valor p correspondente foi de . 0,05

Resultados

Perfis de miRNAs em paclitaxel células sensíveis e resistentes do cancro do pulmão

Nós preparados paclitaxel células de pulmão resistente não pequenas do cancro (A549-T24) a partir de células sensíveis de paclitaxel pela exposição contínua das células A549 ao paclitaxel (Fig. S1A). Para procurar os miARNs críticos envolvidos no desenvolvimento de resistência paclitaxel, o ARN total, extraído de células de cancro do pulmão (A549) e a sua variante resistente a paclitaxel (A549-T24), foram enviados para Exiqon, Dinamarca para miARN matriz de perfis. A partir da matriz de results identificou-se que 23 miARNs foram diferencialmente expressos em células A549-T24 do que as células A549 (Fig. 1).

perfis de matriz miARN de paclitaxel sensíveis (C1 e C2) e resistentes (Tx1 e Tx2 ) linhas de células de câncer de pulmão foi mostrado. agrupamento hierárquico supervisionado de linhas de células com base na sua expressão miRNAs diferenciais com ΔLMR≥2 entre os dois grupos foi exibido. Cada coluna representa uma linha de células e cada linha de um conjunto de sonda. O mapa de calor indica o nível de expressão em relação à média alta (vermelho) ou baixa (azul) de acordo com a escala mostrada na figura.

Para identificar os genes alvo destes miRNAs diferencialmente expressos, nós procurou miRNA-alvo miRBase bancos de dados de previsão, microRNA.org e TargetScanHuman 6.2 e identificamos miR-17-5p provavelmente poderia ter um papel na autofagia, visando proteína relacionada autofagia beclin 1 (BECN1) ligando diretamente para a sua região 3 ‘UTR entre a posição 135 a 141. é já relatado que a indução de autofagia por tratamento com paclitaxel desempenha um papel importante no desenvolvimento de resistência paclitaxel em células tumorais, com a regulação positiva de BECN1 [13] – [15]. Observamos aumento do nível de autofagia como indicado pela regulação positiva de BECN1 e aumento da conversão e a regulação negativa da expressão de p62 LC3-I lc3-II em células A549-T24 em comparação com células A549 (Fig. 2a). Nós também medidos os níveis de ARNm relativos de BECN1 e LC3-II (Fig. 2B e 2C) e a ambos esses mRNAs foram regulados positivamente em células A549-T24 em comparação com células A549. Para estender a nossa conclusão de que preparou outra resistente linha de células de cancro do pulmão paclitaxel H596-TxR de paclitaxel células sensíveis NCI- H596

in vitro

(Fig. S1B) e examinou o estado da BECN1 e LC3 nesta célula de câncer de pulmão resistente line (H596-TxR). Encontramos upregulation semelhante de BECN1 e aumento da conversão LC3-I para LC3-II em células H596 resistentes paclitaxel (H596-TxR) em comparação com células H596 parental (Fig. S2A). Além disso, a análise dos níveis de mRNA relativas de BECN1 e LC3-II (Fig. S2B e Fig. S2C) também confirmou a regulação positiva significativa de autofagia celular em células H596-TxR comparação com H596 células.

(A) estatuto Expression de certas proteínas marcadoras autophagic BECN1, MAP-LC3, p62 e GAPDH (controlo de carga) foram medidos por transferência Western. (B-C) e BECN1 LC3-II níveis de expressão de ARNm relativos foram quantificadas por análise de qRT-PCR em células A549 e A549-T24,

barras representam a média ± D.P. (

*

p 0,03 vs controlo, em que n = 3) (D) regulação negativa da expressão de miR-17-5p em células de cancro de pulmão resistente ao paclitaxel (A549-T24) em comparação com células A549. Taqman qRT-PCR foi realizado para detectar os níveis relativos de miR-17-5p em células A549 e A549-T24. Os resultados foram normalizados para o nível de expressão snU6 e representados como a média ± S.E. a partir de três replicados independentes.

(** p 0,001

vs controle, n = 3)

miRNA-17-5p é regulada negativamente em paclitaxel resistentes cancro do pulmão células

Nós. ainda validados os dados da matriz para miR-17-5p por Taqman qRT-PCR. Usando ensaio qRT- PCR probe- base Taqman, comparamos o nível de expressão de miR-17-5p em paclitaxel sensível e células A549 resistentes. FIG. 2D mostra uma regulação negativa ~7.2 vezes no nível de expressão de miR-17-5p relativo em células A549-T24, em comparação com células A549, validar os resultados de micro-arranjo. Nós também estimado o nível de miR-17-5p em células H596-TxR expressão e comparou-a com a de H596 células. Descobrimos que as células H596-txr exibiu quase ~2.62 downregulation dobra de expressão de miR-17-5p relativa em comparação com a de células H596 sensíveis paclitaxel (Fig. S2D) indicando associação entre o miR-17-5p e resistência paclitaxel não foi linha celular específica .

Sensibilidade a paclitaxel é modulada por sobre-expressão de miR-17-5p

in vitro

para investigar se as células miR-17-5p superexpressão sensibilizados A549-T24 ao paclitaxel , nós transfectadas células A549-T24 com 100 nM de pré-miR-17-5p (T24-miR-17-5p) ou 100 nM pré-miR- RNA controle negativo (T24-miR-NC) e 24 h após a transfecção as células foram tratados com diferentes doses de paclitaxel (0-200 nM). Observou-se que, em comparação com o controlo negativo (T24-miR-NC), a sobre-expressão de miR-17-5p sensibilizados significativamente as células T24 A549- ao paclitaxel (Figura 3A,

p. 0,05 e

p 0,03

). Por exemplo, as células T24-miR-17-5p exibiu quase 86%, 51%, 31% e 6% de viabilidade celular quando as células foram tratadas com 12 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM de paclitaxel durante 24 h, respectivamente. Sob condições semelhantes células T24-miR-NC mostrou quase 99%, 89%, 78% e 58% de viabilidade. Resultados semelhantes foram obtidos quando overexpresed 100 nM pré-miR-17-5p em células H596-txr (TxR-miR-17-5p) e tratou-se as células com doses semelhantes de paclitaxel (0-200 nM) durante 24 h. Observou-se que, em comparação com o controlo negativo (TxR-miR-NC), células TxR-miR-17-5p exibiram viabilidade celular muito inferior quando tratadas com concentrações crescentes de paclitaxel. As curvas de resposta a dose completa são apresentados na Fig. S3A.

células A549-T24 (A) ou foram transfectadas com 100 nM de controle pré-miR-negativo (T24-miR-NC) ou pré-miR-17-5p (T24-miR-17-5p ) de RNA percursor e foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10

4 células por poço. Após 24 h, as células foram tratadas com 0, 12, 24, 50, 100, 200 nM de paclitaxel durante mais 24 h. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT. Os dados são apresentados como% da viabilidade celular medida em células tratadas com paclitaxel.

Colunas

, com média de três experimentos independentes;

bares

, média ± S.E.. (* P 0,05 vs controlo negativo, p 0,03 vs controlo A549, em que n = 4). (B-C) As células (T24-miR-NC e T24-miR-17-5p) foram subsequentemente tratadas com 24 nM e 50 nM de paclitaxel durante 24 h e são submetidas a análise por FACS depois de serem coradas pelo azul de Tripano. Histograma representa a intensidade de fluorescência vermelha (FL3-H) versus conta trama onde a dose aumento dependente da morte celular ocorre. Os resultados representam o melhor dos dados recolhidos a partir de três experimentos com resultados semelhantes.

Esta perda de viabilidade celular por sobre-expressão de miR-17-5p e tratamento subsequente paclitaxel foi ainda avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano corante utilizando citometria de fluxo (Fig. 3B e 3C,

p 0,01

) com células A549-T24. células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem o azul de tripano, no entanto, as células mortas e, eventualmente, não ocupam azul de tripano. FIG. 3B e 3C mostram que a sobre-expressão com miR-17-5p e subsequente tratamento com paclitaxel (24 e 50 nM) durante 24 h, a viabilidade celular residual de células T24-miR-17-5p foi diminuída em comparação com os respectivos controlos negativos. Por exemplo, enquanto que a sobre-expressão de miR-17-5p e tratamento subsequente com 24 nM e 50 nM de paclitaxel durante 24 h causou quase 25% e 46% de morte celular, correspondendo controlos negativos expostos apenas 4% e 6% de morte celular, respectivamente. Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de miR-17-5p desempenha um papel chave na sensibilização de células A549-T24 resistentes ao paclitaxel paclitaxel.

beclin 1 é um alvo directo de miR-17-5p em células de cancro de pulmão

para determinar se miR-17-5p liga-se diretamente para a região 3 ‘UTR do mRNA BECN1, construímos 3′- UTR repórteres de BECN1 contendo sítio de ligação putativo miR-17-5p e construção mutante correspondente, faltando miR- 17-5p local de ligação, a jusante do gene repórter da luciferase (Fig. 4A). A co-transfecção de pré-miR-17-5p com BECN1 construção repórter tipo selvagem em células A549-T24 grandemente reprimidos actividade da luciferase de Renilla (Fig. 4B), enquanto que o co-transfecção com construção repórter mutante não apresentaram qualquer alteração significativa na actividade de luciferase relativa com a do controlo (Fig. 4B). Além disso, quando as células A549-T24 foram co transfectadas com anti-miR-17-5p (100 nM) e 3’- repórteres UTR de BECN1, com ou sem sítio de ligação putativo do miR-17-5p, sem diminuição significativa da actividade de luciferase relativa observou-se (Fig. 4B). Estes resultados coletivamente confirmou que BECN1 era um alvo direto de miR-17-5p em células de câncer de pulmão.

(A) Representação esquemática do 3′-UTR de transcrição BECN1 humano. Previu sítio de ligação de miR-17-5p foi retratado. Os números 135-141 (+) representado os nucleótidos que foram preditos a par de bases com a sequência de semente de miR-17-5p. (B) o miR-17-5p liga-se directamente ao gene 3 ‘UTR de BECN1 em células A549-T24. As células A549-T24 foram co-transfectadas com plasmídeos repórter Renilla luciferase (

pCI-neo-RL-Bec-3

‘

UTR-wt

ou

pCI-neo-RL-Bec -3

‘

UTR-mut

), plasmídeos firefly luciferase (pGL3-FF) e pré-miR-17-5p precursor ou anti-miR-17-5p ou pré-miR-negativo precursor controle ARN utilizando o reagente de transfecção lipofectamine2000. Após 48 h, as células foram colhidas e lisadas com tampão de lise passiva. A actividade de luciferase foi medida utilizando o Promega duplo de luciferase kit de ensaio de repórter. Os resultados foram representados como a repressão vezes relativamente (actividade Renilla luc /Firefly luc) em comparação com células de controlo. (* P 0,05, ** p 0,03 vs controle, n = 4)

A superexpressão de miR-17-5p em Paclitaxel resistentes células de câncer pulmonar leva à beclin 1 Downregulation

Para validar experimentalmente previsão alvo, que avaliou os níveis de proteína de BECN1 seguintes superexpressão de miR-17-5p em células tanto A549-T24 e H596-TxR. FIG. 5A mostra, a sobre-expressão de miR-17-5p diminuíram significativamente a expressão BECN1, em comparação com o controlo negativo (T24-miR- NC). Este foi ainda confirmada pela avaliação dos níveis de ARNm de BECN1 por qRT-PCR. Descobrimos, a sobre-expressão de miR-17-5p reduzido nível de ARNm BECN1 por ~5.6 dobra (

P 0,01

) em células A549-T24, em comparação com o controlo negativo. Foram testados os níveis de dois outros marcadores autofágicos, LC3-II e p62 que estão a jusante do BECN1 por transferência de Western de expressão. A sobre-expressão de miR-17-5p em células A549-T24 reduzida conversão de LC3-I lc3-II (Fig. 5A, segundo blot e Fig. 5C) e aumento do nível de p62 (Fig. 5A, terceiro blot). No caso de células H596-txr, também descobrimos que a sobre-expressão de miR-17-5p resultou na downregulation de BECN1 concordante e LC3-II em células H596-txr (Fig. S3B-D). Todos estes dados coletivamente provou que a sobre-expressão de miR-17-5p em células de câncer de pulmão resistente paclitaxel causou redução na autofagia celular diretamente pela segmentação proteína relacionada autofagia BECN1.

células A549-T24 (A) foram transfectadas quer com 100 nM controle pré-miR-negativo (T24-miR-NC) ou pré-miR-17-5p (T24-miR-17-5p) RNA precursor. Após 24 h, foram preparados lisados ​​celulares por Western blotting com anticorpo contra BECN1, MAP-LC3, p62 e GAPDH foi usada como controlo de carga. (B-C) os níveis de expressão de mRNA relativos BECN1 e LC3-II foram quantificados por análise de qRT-PCR em T24-miR-NC e as células T24-miR-17-5p,

bares

representam a média ± S.E. a partir de três experimentos independentes (** p 0,01 vs controle, onde n = 3)

A superexpressão de miR-17-5p Inibe a autofagia em Paclitaxel resistente A549-T24 células

. O paclitaxel induz autofagia em células cancerosas [13] – [15]. As células tumorais utilizar esta autofagia citoprotector como uma defesa da morte celular por apoptose que por sua vez contribui para o desenvolvimento da resistência de paclitaxel. Durante autofagia, autofagossomas se fundem com os lisossomas para formar autophagolysosomes que são vacúolos acidicos (AVO) que se ligam-acridina laranja dando fluorescência vermelha e pode ser facilmente avaliada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. FIG. 6A-B mostram, enquanto as células A549 sensíveis paclitaxel apresentaram quase nenhum vesículas vermelhos (Fig. 6A), o grande número de vesículas fluorescentes vermelhas foram observados no citoplasma de células T24-miR-NC (Fig. 6B). No entanto, quando as células A549-T24 foram transfectadas com miR-17-5p (células T24-miR-17-5p), aparecimento de reduzida significativamente (Fig. 6C) vermelho de AVO. Estes resultados foram reconfirmada por análise de citometria de fluxo (Fig. 6D-G). Observou-se que as células T24-miR-NC mostraram níveis mais elevados de fluxo autophagic em comparação com células A549 (Fig. 6D em comparação com a Fig. 6E). No entanto, quando células A549-T24 foram sobre-expressos com miR-17-5p, formação de Avo reduzida significativamente em comparação com células T24-miR-NC (Fig. 6F em comparação com a Fig. 6E). FIG. 6G mostra a representação quantitativa de Avos em células que foram calculados a partir de citômetro de fluxo resultados.

T24-miR-NC e as células T24-miR-17-5p foram coradas com AO para observação AVO sob microscópio de fluorescência (B e C ). AO coloração de A549 serviu como controlo (A). (D-F) Para quantificar as alterações na% de células em desenvolvimento AVO seguintes superexpressão de miR-17-5p em células A549-T24, em fluxo de citometria de estimativa de avos foram feitas em A549, T24-miR-NC e T24-miR-17- 5p de células, respectivamente. (G) A quantificação de células positivas médios AVO em todas as três linhas de células. Os dados apresentados são a média ± E.P. FIG. Como mostrado na Fig. FIG. FIG. Como mostrado na Fig.