PLOS ONE: Segmentação do NF-kB Caminho como uma terapia de combinação para o cancro de tiróide Avançada

Sumário

sinalização de NF-kB desempenha um papel importante na proliferação de células de tumor, a sobrevivência celular, angiogénese, invasão, metástase e resistência à droga /radiação. A terapia de combinação envolvendo inibição da via de NF-kB é uma estratégia atractiva para o tratamento de formas avançadas de cancro da tiróide. Este estudo foi desenhado para testar a eficácia de inibição da via NF-kB em combinação com quimioterapia citotóxica, usando docetaxel e radiações ionizantes em

in vitro

modelos de cancro da tiróide. Descobrimos que, embora tanto o docetaxel e radiação ionizante activada de NF-kB de sinalização em células de cancro da tiróide, não houve efeito sinérgico sobre a proliferação celular e /ou morte celular programada com qualquer genética (transdução de uma forma mutante negativa dominante de IκBα) ou farmacológico ( bortezomib inibidor de proteassoma e inibidor IKKβ GO-Y030) inibição da via do NF-kB em células de cancro da tiróide linhas BCPAP, 8505c, THJ16T e SW1736. Docetaxel e bortezomib diminuiu sinergicamente

In vitro

invasão de células 8505c, mas não nas outras linhas de células. O rastreio de um painel de terapias específicas clinicamente relevantes para sinergia com a inibição do NF-kB genético num ensaio de proliferação /citotoxicidade identificou a histona desacetilase (HDAC) suberoilanilida do inibidor de ácido hidroxâmico (SAHA), como um candidato potencial. No entanto, o efeito sinérgico foi confirmada apenas nas células BCPAP. Estes resultados indicam que os inibidores de NF-kB são susceptíveis de ser benéfica como terapia de combinação com quimioterapia citotóxica taxano, terapia de radiação ou terapia externa com iodo radioactivo. Pode haver circunstâncias únicas que os inibidores do NF-kB pode ser considerado em combinação com docetaxel de reduzir a invasão de tumor ou em combinação com inibidores de HDAC para reduzir o crescimento de tumores, mas isto não parece ser uma terapia de combinação que pode ser amplamente aplicada a pacientes com câncer de tireóide avançado. Mais pesquisas podem identificar quais subgrupos de pacientes /tumores podem responder a essa abordagem terapêutica

Citation:. Pozdeyev N, Berlinberg A, Zhou Q, Wuensch K, Shibata H, Madeira WM, et al. (2015) Segmentação do NF-kB Caminho como uma terapia de combinação para o cancro de tiróide avançado. PLoS ONE 10 (8): e0134901. doi: 10.1371 /journal.pone.0134901

editor: Jacques Emile Dumont, Universite Libre de Bruxelles (ULB), Bélgica

Recebido: 06 de julho de 2015; Aceito: 10 de julho de 2015; Publicação: 11 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Pozdeyev et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH /NCI bolsa de investigação R01 CA100560 (www.nih.gov) para BRH, pela Mary Rossick Kern e Jerome H. Kern Endowment for Endócrino Neoplasias Research a BRH, e por uma bolsa de investigação Endocrine Fellow Foundation (www.endocrinefellows.org) para NP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

tireóide é um importante problema de saúde pública com 60.000 novos casos estimados causando cerca de 2000 mortes nos Estados Unidos no ano de 2015 [1]. cancro da tiróide anaplásico (ATC) é a forma mais letal de câncer de tireóide com uma sobrevida média de 5 meses e 20% de sobrevida em 1 ano, apesar de uma gestão agressiva com uma combinação de cirurgia, radioterapia e quimioterapia [2]. A quimioterapia citotóxica com docetaxel é um dos poucos tratamentos que apresentaram resultados encorajadores em ATC, especialmente quando combinado com a terapia de radiação [3].

NF-kB é uma família de factores de transcrição envolvidos em vários aspectos da biologia tumoral tais como proliferação de células, a sobrevivência, angiogénese, invasão, metástase e resistência às drogas [4]. sinalização de NF-kB foi encontrado para ser constitutivamente activado no carcinoma hepatocelular [5], o cancro colo-rectal [6], o cancro da mama [7], o cancro da próstata [8] e outras doenças malignas sólidas e hematológicas [4]. As drogas anti-cancerosas e radiação ionizante regular positivamente a via de NF-kB, que resulta no desenvolvimento de resistência ao tratamento [9,10]. Isso levou a um esforço significativo para desenvolver inibidores NF-kB e estudo de sua eficácia para o tratamento de cancros, tanto em modelos pré-clínicos e em ensaios clínicos [4,11].

Como foi mostrado para outros tumores, tecido de cancro da tiróide aumentou a expressão de fatores de transcrição NF-kB que está associado com um maior tamanho do tumor, a presença de metástases, extensão extra-tireoidiana e

BRAF V600E

mutação [12-15]. O papel do NF-kB de sinalização no crescimento de células do cancro da tiróide, a migração, angiogénese e invasão foi mostrado [16-18]. Um efeito sinérgico de docetaxel e a curcumina inibidor da via do NF-kB na proliferação e apoptose da linha celular de 8505c ATC tem sido relatada [19]. A combinação da inibição I

131 e NF-kB tanto com uma IkB quinase (IKK) inibidor Bay 11-7082 ou siRNA p65 resultou em uma maior diminuição do crescimento do cancro da tiróide

in vitro

[20] e num modelo de xenoenxerto de flanco em ratinhos [21] que por si só, quer terapêutica. Encorajados por estes resultados que nós projetamos este estudo teve como objetivo investigar sistematicamente os benefícios da terapia de combinação com docetaxel ou de radiações ionizantes e inibição da via NF-kB usando

in vitro

modelos de cancro da tiróide.

métodos

As linhas celulares e construções genéticas

Este estudo foi realizado utilizando um câncer papilar da tiróide (PTC) linha de células BCPAP e três ATC linhas celulares 8505c, THJ16T e SW1736 que foram validados pela curta em tandem repetição de perfis [22,23]. As linhas celulares que foram modificadas para expressar a forma mutante negativa dominante de IκBα (mIκBα) que é resistente à degradação proteossómica [24]. A acumulação de muito excesso mIκBα citoplasmática impede a translocação nuclear de fatores de transcrição NF-kB ao desligar canônica de sinalização de NF-kB. Geração de construção pQCXIP-mIκBα, transdução e selecção de antibiótico são descritas em detalhe noutro local [17]. O fenótipo de cada linha de células foi testada por medição da acumulação de proteína IκBα por Western blot e funcionalmente por meio da estimativa de NF-kB factor de transcrição de ligação a locais de ADN de consenso kB (NFkB p65 transam kit de ELISA, o Active Motif) p65. Factor de necrose tumoral α (TNFa) foi usada como um controlo positivo para a activação de sinalização de NF-kB. Nós demonstramos que mIκBα transdução conduz à acumulação IκBα e inibição tanto da linha de base e outras linhas celulares de cancro da tiróide-TNFa estimulado ADN p65 de ligação em células BCPAP (FIG 1) e (dados não mostrados).

Os dados estão normalizados para o grupo tratado com veículo vetor. * -p 0,01 para o efeito do TNFa no grupo de vetor (two-way ANOVA seguido por pós-teste de Bonferroni)

Para monitorizar convenientemente a atividade da via de NF-kB, construímos um vector lentiviral contendo um

Renilla

repórter de luciferase dirigido por um mínimo de

c-fos

promotor sob o controlo de quatro elementos de resposta a montante do NF-kB (kB). Este vector foi transduzido para as células BCPAP e cancro da tiróide 8505c já expressando

Firefly

luciferase dirigido por um promotor de CMV constitutivo como um controlo não-NF-kB-regulado. Depois de transdução e selecção de antibiótico com puromicina, as células foram avaliadas para a expressão de ambos

Firefly

e

Renilla

atividade luciferase (Fig 2, Dual-Luciferase Reporter Assay Sistema, Promega).

bortezomib inibidor do proteassoma e IKK inibidor complexo GO-Y030 neutralizar a activação de NF-kB pelo docetaxel. As células foram incubadas com drogas durante 48 h antes do repórter medições actividade de luciferase. As diferenças entre grupos são altamente significativas (p 0,0001, ANOVA de uma via). Os asteriscos indicam uma mudança significativa (p 0,05, pós-teste de Newman-Keuls) quando comparado com o grupo de controlo correspondente (TNFa, docetaxel e bortezomib isoladamente foram comparados ao veículo; combinações docetaxel e bortezomib /GO-Y030 foram comparados com o docetaxel único grupo) .

Drogas e tratamentos de radiação

a maioria dos agentes farmacológicos foram obtidos em forma de pó a partir LC Labs e Sellekchem e reconstituídos em DMSO. A concentração final de DMSO no meio de cultura não ultrapassou 0,05%. O bortezomib inibidor de proteossoma, um medicamento aprovado pelo FDA que bloqueia a via de NF-kB por inibição da proteólise IκBα [25], foi utilizado para estudar a sinergia fármaco-fármaco. Um inibidor experimental IKKβ GO-Y030 [26] serviu como um inibidor farmacológico alternativo de sinalização de NF-kB e foi obtido a partir de laboratório do Dr. Shibata (Akita, Japão).

de raios X de radiação ionizante foi entregue na dose de 2 e 5 Gy por um irradiador de raios-X RS2000 (RAD Fonte Technologies).

ensaios

citotoxicidade celular /proliferação /viabilidade

Os efeitos das drogas, radiação ionizante e modificação genética em células tumorais a sobrevivência e a proliferação foi medida por 72 h de ensaio de sulforrodamina B (SRB) [27], bem como por contagem directa do número de células viáveis ​​utilizando uma célula de Vi-CELL XR Viabilidade Analyzer (Beckman Coulter).

In vitro

invasão ensaio

células cancerosas da tiróide foram semeadas a uma densidade de 5×10

6 células por placa, e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FBS durante 6 horas. O meio foi então aspirado e substituído com os meios suplementados com 0,1% de FBS, e as células foram incubadas durante 18 horas. As células foram colhidas e 1×10

6 as células foram semeadas em câmaras superiores das câmaras Transwell revestidas com Matrigel (24 poços, 8 um de tamanho de poro; BD Biosciences) em meio RPMI-1640 com 0,1% de FBS. Os ensaios foram realizados em duplicado. Células invadidas para dentro da câmara inferior contendo meios com 10% de FBS. Após 18 horas, foram descartados não invadir as células na câmara de topo, e as células invasoras foram fixadas com metanol, coradas com 3 ug /ml de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; Invitrogen) e contado em cinco campos microscópicos sob ampliação de 10x utilizando o software Metamorph (Molecular Devices).

Rastreio de drogas orientadas clinicamente relevantes para a sinergia com a inibição da via de NF-kB

a proliferação de células que expressam mIκBα (como um modelo genético de NF -κB inibição da via, mostraram produzir um fenótipo altamente eficaz (Figura 1)) foi avaliada por meio de ensaios SRB. Três linhas de células de cancro da tiróide foram expostas a uma série de terapias citotóxicas e segmentados. Dos 15 terapias específicas utilizadas para o rastreio, 12 eram inibidores da quinase, DAPT é um inibidor γ-secretase, decitabina é um inibidor methyltrasferase ADN, e suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA, vorinostat) inibe a histona-desacetilases. Oito curvas de resposta de dose foram obtidos e ponto de metade da concentração máxima de droga inibidora (IC

50) foi calculada através do ajuste dos dados experimentais, utilizando 4-parâmetros logísticos de regressão não linear com o auxílio de um script R feitos. Visitas foram identificados por comparação IC

50 para Controle de Vetores e mIκBα células transduzidas e foram ainda avaliados utilizando o ensaio SRB e células viáveis ​​contando.

Caspase-3/7 ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços em duplicado a uma densidade de 7.5×10

4 células /poço em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS). Seguindo drogas incubação durante a noite foram adicionados quer isoladamente quer em combinação durante 24 horas e de FBS no meio foi mudado para 0,1%. a actividade da caspase-3/7 foi avaliada utilizando um ensaio da caspase-base luminescência de acordo com as instruções do fabricante (Caspase 3/7 Ensaio GloTM, GloMax multimodo Reader, Promega).

Os cálculos estatísticos e de sinergia

Os cálculos estatísticos foram realizados utilizando GraphPad Prism. O método de análise específica utilizada e os valores de p calculados são definidos numa legenda da figura correspondente. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão.

índice de independência Bliss (BI) e do índice de combinação (IC) foram calculados como uma medida do efeito sinérgico. A BI e CI 0,8 foram aceites como uma evidência de sinergia. BI foi calculada utilizando a seguinte fórmula: BI = ((F

a + F

b) – (F

a * F

b)) /F

ab, onde F

a é o efeito de um tratamento com drogas ou radiação; F

b é o efeito de um inibidor de NF-kB ou farmacológico mIκBα; (F

A + F

b) – (F

a * f

b) é a soma dos efeitos previsto de dois tratamentos; F

ab é o efeito real de uma terapia de combinação encontrado experimentalmente

sinergia Droga /droga foi também avaliada pelo índice de Chou combinação (CI) [28] usando software Compusyn (http: //www.. combosyn.com). Para estes cálculos, construímos curvas de dose-resposta de 8 pontos para a combinação de drogas e medicamentos único. CI para IC

50 é relatado.

Resultados

Docetaxel e radiação ionizante activar NF-kB via em células de cancro da tiróide

Usando células BCPAP e 8505c modificadas para expressar

Renilla

repórter da luciferase a actividade de NF-kB como uma leitura da actividade de NF-kB, tanto positivos de controlo 25 ng /ml de TNFa e 5 nM de docetaxel por 48 horas aumentou a actividade repórter de NF-kB (Fig 2). O efeito foi maior do docetaxel nas células BCPAP (Fig 2A e 2B). Os inibidores da via farmacológica do NF-kB foram eficazes na revoga o aumento induzido por docetaxel na actividade repórter nas concentrações de ≥ 5 nM e ≥ 250 nm para o bortezomib (Fig 2A e 2C) e GO-Y030 (Fig 2B e 2D), respectivamente.

Um curso de tempo do efeito de radiação sobre o NF-kB repórter actividade de luciferase em células BCPAP e 8505c ionizante é mostrado na Fig 3A e 3B. Semelhante ao docetaxel, NF-kB via foi activado após ≥ 48 h de exposição à radiação ionizante. Esta descoberta foi confirmada utilizando um ensaio funcional que mede a p65 se ligar a segmentos de DNA contendo sequências de NF-kB em células BCPAP (Fig 3C). Em células que sobre-expressam mIκBα, tanto da linha de base e a sinalização de NF-kB induzida pela radiação foram bloqueados.

experiência de ligação de ADN p65 foi realizada 72 horas após a exposição à radiação. Os dados estão normalizados para o grupo não irradiado (a um tempo 0 h para os painéis A e B). * -p. 0,05, (two-way ANOVA, pós-teste de Bonferroni)

A falta de um efeito sinérgico de docetaxel ou radioterapia e farmacológica ou inibição genética via NF-kB ionizante na tireóide proliferação das células cancerosas /morte

a próxima série de experimentos testou a hipótese de que o efeito de tratamentos clinicamente relevantes, tais como docetaxel e radiação ionizante conhecida por ativar a sinalização de NF-kB é potenciado pela farmacológico (bortezomib e GO-Y030) ou genéticas (mIκBα ) inibição de sinalização de NF-kB. Não sinergia foi encontrado, independentemente da linha de células método de cálculo sinergia, ensaio de viabilidade citotoxicidade /celular ou cancro da tiróide usado (Tabela 1). Da mesma forma, há sinergia foi encontrado quando a radiação ionizante em doses de 2 e 5 Gy foi combinado com o bloqueio do NF-kB por mIκBα durante 48 ou 72 h em células BCPAP e SW1736 (Tabela 2).

Docetaxel não activar a caspase-3/7 em células de cancro da tiróide

NF-kB inibição de sinalização sensibiliza as células para a apoptose induzida por citocinas, tais como TNFa [24]. Tem sido relatado que o docetaxel também induz apoptose em células de cancro da tiróide [29], mas não demonstraram sinergia com a inibição da via de NF-kB nas nossas experiências. Tomando esta discrepância em consideração, decidimos avaliar se docetaxel induz a apoptose em nossos modelos. Contrariamente aos dados publicados, docetaxel, enquanto sendo altamente eficaz no ensaio de SRB (IC

50 na gama picomolar, dados não mostrados), não conseguiu induzir actividade de caspase-3/7 em células BCPAP e 8505c (Fig 4). Bortezomib, utilizado como um controlo positivo, dependente da dose a activada de caspase-3/7 nestas linhas celulares

ponto asteriscos para uma significância estatística quando comparado com um grupo de dose mais baixa (p . 0,05, ANOVA de uma via, Newman-Keuls pós-teste).

O efeito do docetaxel e bortezomib na invasão de células de câncer de tireóide

in vitro

O efeito de uma combinação docetaxel /bortezomib em um aspecto mais complexo da biologia do tumor, invasão da matriz, foi testada (Figura 5). A combinação de drogas sinergicamente inibiu a invasão de células de câncer de tireóide 8505c

in vitro

(BI de 0,47 sugere um grau moderado de sinergia), mas não teve efeito sobre a invasão de células THJ16T. A tendência para a diminuição da invasão em células BCPAP após o tratamento com docetaxel /bortezomib não foi significativa

Os asteriscos indicam um efeito significativo da combinação de drogas (p . 0,05, medidas repetidas ANOVA one-way, Newman-Keuls pós-teste ). O efeito das drogas sobre a invasão de células e BCPAP THJ16T não foi significativa. BI-Bliss índice de independência.

O rastreio de drogas que /efeito anti-proliferativo citotóxico em células de câncer de tireóide é potenciado pela inibição da via NF-kB com mIκBα

Nós estendemos nossa esforços para encontrar drogas /NF-kB sinergia de inibição através da realização de um rastreio utilizando uma série de drogas orientadas clinicamente relevante. mIκBα foi selecionado como um método “limpo” da inibição da via de NF-kB é que menos provavelmente produzirão efeitos fora do alvo, em comparação com inibidores de NF-kB farmacológicos. Três linhas de células foram modificadas para expressar mIκBα e o fenótipo foi confirmada tal como descrito na secção de métodos e mostrado na Figura 1. O ensaio de SRB IC

50 valores estão resumidos na tabela 3. Cinco drogas (CABOZANTINIB, dabrafenib, DAPT , selumetinib e vandetanibe) foram ineficazes em concentrações testadas e maximamente IC

50 não pôde ser calculado. Everolimus foi a droga mais potente. Entre as três linhas de células, BCPAP foi mais sensível e 8505c mais resistente global e esta correlacionada com a taxa de proliferação (dados agora mostrado). SAHA foi o único composto que mostrou consistentemente sinergia em combinação com mIκBα e foi ainda estudada.

A potenciação da SAHA citotóxica efeito /anti-proliferativa por mIκBα foi confirmada em um ensaio de SRB 12 concentração no BCPAP células mas não em células 8505c ou THJ16T (Fig 6). A sinergia foi também demonstrada por contagem directa de células viáveis ​​ao fim de 3 dias de exposição a 500 nM de SAHA (BI = 0,69 e 1,18 para as células BCPAP e 8505c, respectivamente).

A resposta diferencial de SAHA em células BCPAP foi significativa a p . 0,0001 (two-way ANOVA)

Discussão

neste estudo, buscou-se determinar se a inibição da via NF-kB pode sinergicamente inibir tireóide crescimento de células cancerígenas usando

in vitro

modelos de cancro da tiróide. Docetaxel e radiação ativam a via NF-kB em células de câncer de tireóide confirmando observações anteriores [19,20,29]. No entanto, apesar de medir a citotoxicidade /proliferação, viabilidade, bem como a invasão de células de cancro da tiróide, utilizando tanto a inibição farmacológica e genética via de NF-kB e empregando dois algoritmos para o cálculo do efeito de combinação, a evidência de actividade sinérgica foi limitada. Especificamente, verificou-se que o docetaxel e bortezomib sinergicamente diminuiu

in vitro

invasão em apenas células 8505c. Fora das 16 drogas (incluindo o docetaxel e 15 outras drogas na triagem) apenas o crescimento celular reduzido SAHA sinergicamente quando a via de NF-kB foi bloqueada, e este efeito foi limitada a uma linha celular (BCPAP).

a aparente discrepância entre nossas descobertas atuais e estudos publicados anteriormente de docetaxel [19] e eu

131 [20,21] é provavelmente explicada pelas diferenças na metodologia de estabelecer o efeito sinérgico. A verdadeira sinergia ocorre quando o resultado do tratamento de combinação

excede

o da

soma

dos efeitos de cada tratamento individual e isso tem que ser provado quantitativamente. Para o nosso conhecimento nenhum dos estudos publicados anteriormente abordada a questão das sinergias com NF-kB sinalização de inibição utilizando a mesma abordagem quantitativa como neste estudo.

O aumento da sinalização de NF-kB em células cancerosas é conhecido por bloquear a apoptose [ ,,,0],30]. inibição da via de NF-kB foi mostrado para sensibilizar as células para o efeito pró-apoptótico de TNFa [24]. Especula-se que a elevada potência de SAHA em ensaio de sinergia é um resultado da actividade pró-apoptótica de inibidores de desacetilase de histona [31]. A falta de indução de apoptose por docetaxel e o fraco desempenho deste agente neste estudo sinergia fornecer mais provas que sustentam esta hipótese. No entanto, uma investigação experimental detalhado do papel da apoptose na droga /NF-kB via a inibição sinergia está para além do âmbito deste projecto focado. O efeito de potenciação SAHA por inibição da via NF-kB pode ser de interesse clinico. No entanto, o entusiasmo é diminuída pelo fato de que este efeito foi observado em apenas um dos três

in vitro

modelos de cancro da tiróide (e os mecanismos responsáveis ​​por esta selectividade não são claras). Além disso, SAHA monoterapia não foi eficaz em um estudo de fase II de pacientes com carcinoma de tireóide com iodo radioactivo-refractário metastático [32].

Este estudo investigou vários aspectos da biologia do tumor, como a célula de sobrevivência, proliferação e invasão que pode ser convenientemente medido

in vitro

. Ainda é possível que o benefício anti-tumoral de inibição da via NF-kB pode ser mediada por processos mais complexos que são difíceis de estudar em linhas celulares, tais como angiogénese, da resposta imune e outros. Além disso, as células de cancro da tiróide cultivadas

in vitro Quais são desdiferenciado [33] e pode faltar características fenotípicas que são importantes para a ação sinérgica dos inibidores da sinalização de NF-kB.

Nós não demonstraram efeito sinérgico de docetaxel e bortezomib na invasão de células de câncer de tireóide, mas esta foi restrito a apenas uma linha celular (8505c), que por sua vez faz com que qualquer consideração desta terapia de combinação no câncer da tireóide avançado, menos atraente.

em resumo, verificou-se que a terapia de combinação envolvendo inibidores da via NF-kB é um benefício limitado no cancro da tiróide. Pode haver circunstâncias ainda não descoberto que os inibidores de NF-kB pode ser considerado em combinação com docetaxel de reduzir a invasão de tumor ou em combinação com inibidores de HDAC para reduzir o crescimento de tumores, mas isto não parece ser uma terapia de combinação que pode ser amplamente aplicada a pacientes com câncer de tireóide avançado. Mais pesquisas podem identificar quais subgrupos de pacientes /tumores podem responder a esta abordagem terapêutica.

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