Sumário

Alguns medicamentos quimioterápicos potentes, incluindo agentes de ligação de tubulina foi desenvolvido a partir de plantas da natureza, como a podofilotoxina e paclitaxel. No entanto, a má seletividade citotóxica, efeitos colaterais graves e eficácia limitada ainda são as principais preocupações em sua aplicação terapêutica. Foi desenvolvido um derivado de podofilotoxina totalmente sintético denominado Ching001 e investigados os efeitos de crescimento anti-tumorais e mecanismos em modelos pré-clínicos de cancro de pulmão. Ching001 mostrou uma citotoxicidade selectiva de diferentes linhas celulares de cancro de pulmão, mas não para células de pulmão normais. Ching001 inibida a polimerização dos microtúbulos, resultando na paragem da mitose como evidente pela acumulação de proteínas relacionadas com a mitose, survivina e Aurora B, levando, assim, a danos no ADN e apoptose. Ching001 também activado o estresse ER pró-apoptótica via de sinalização. A injecção intraperitoneal de 2 mg /kg Ching001 inibiu significativamente o crescimento do tumor de xenoenxerto A549, enquanto a injecção de 0,2 mg /kg Ching001 diminuiu a capacidade de colonização de pulmão de células A549 em ensaio de metástases experimentais. Estes efeitos de inibição do crescimento do tumor e anti-colonização pulmonar foram mais fortes do que os de tratamento com paclitaxel na mesma dosagem. As manchas de tecido de tumor xenoenxerto confirmou ainda que Ching001 induzida prisão mitose e apoptose tumor. Além disso, os testes de hematologia e bioquímica de amostras de sangue, bem como exames de tecido indicaram que o tratamento Ching001 não mostrou toxicidade dos órgãos aparentes nos animais testados. Nós fornecemos evidências pré-clínicas que novo inibidor de microtúbulos sintética Ching001, o que pode provocar danos ao DNA e apoptose através da indução de paragem da mitose e estresse ER, é um potencial composto anti-câncer para o desenvolvimento de drogas

Citation:. Chen JY, Tang YA, Li WS, Chiou YC, Shieh JM, Wang YC (2013) um derivado sintético podofilotoxina Exerce Anti-Cancer Efeitos induzindo mitótico Detenção e pró-apoptóticos ER stress em Lung Cancer pré-clínica Modelos. PLoS ONE 8 (4): e62082. doi: 10.1371 /journal.pone.0062082

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de dezembro de 2012; Aceito: 17 de março de 2013; Publicação: 30 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas CMNCKU10107 do Centro Médico da Chi Mei, Taiwan (JMS) e NSC 101-2325-B-006-008 do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (JOC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Alguns medicamentos quimioterápicos potentes foram derivadas de plantas naturais. Por exemplo, podofilotoxina, um componente activo purificado a partir de

Podophyllum peltatum

[1] – [3], é utilizado como um tratamento padrão para verrugas venéreas [4]. Podofilotoxina inibe microtúbulos polimerização levando à insuficiência mitose e ciclo celular prisão [5] – [7]. derivados semi-sintéticos de podofilotoxina, por exemplo, etoposido e teniposido, são actualmente utilizados medicamentos anti-cancro para a leucemia, o linfoma, o glioblastoma, do pulmão, cancros testiculares e [8]. Muitos outros fármacos anti-cancro derivados de ervas naturais também possuem a capacidade de inibir a dinâmica dos microtúbulos [2], [9]. Por exemplo, o taxol (ou paclitaxel) e compostos alcalóides vinca são produtos naturais purificados a partir de

Taxus brevifolia

ou

Catharanthus roseus

, respectivamente. Estudos anteriores revelaram que o paclitaxel e compostos de vinca alcalóides pode interromper dinâmica dos microtúbulos [9] – [13]

Embora muitos agentes de ligação de tubulina tinha sido desenvolvida, forte citotoxicidade em relação a células normais, a depressão da medula óssea e risco aumentado de. leucemia mielogénica aguda secundária limitar a sua eficácia clínica [1], [14] – [16]. Assim, o desenvolvimento de novos agentes com melhor selectividade citotóxica e efeitos secundários limitados é importante para o tratamento anti-cancro. Foi desenvolvido um novo derivado de podofilotoxina totalmente sintética com elevada pureza e bom rendimento chamado Ching001, e descobriram que Ching001 mostrou forte citotoxicidade especificamente em linhas celulares de cancro de pulmão, mas não em células de pulmão normal. Ching001 inibida microtúbulos de polimerização e prendeu ciclo celular na mitose. Ching001 induzida apoptose através da indução de danos no DNA e activação da sinalização ER stress. Ching001 mostraram inibição do crescimento tumoral e prevenir a colonização do tumor sem aparentes efeitos colaterais em modelos de xenoenxerto, sugerindo que pode ser adicionalmente testada como um reagente anti-tumor novo.

Resultados

Ching001 Mostra citotoxicidade selectiva Rumo Cancer mas as células do pulmão não é normal

Ching001 é um composto totalmente sintético e sua estrutura é mostrada na Fig. 1A. A citotoxicidade do Ching001 em diferentes linhas celulares de cancro do pulmão e MRC5 linha de células de pulmão normal foi ensaiada. A IC50 calculada por análise de regressão de várias linhas de células foram: CL1-0, 1,99 uM; CL1-5, 1,90 uM; A549, 1,21 uM; H1299, 2,58 uM; e MRC5, 8,27? M para o tratamento Ching001 às 48 h (Fig. 1B). Ching001 mostrou uma citotoxicidade selectiva para células de cancro de pulmão, mas não para células de pulmão humano MRC5 normais.

(a) a estrutura do composto Ching001. (B) Ensaio de citotoxicidade de MRC5 pulmão normal e várias células de câncer de pulmão foi monitorada por coloração azul de tripano. As células foram tratadas com diferentes concentrações de Ching001 durante 48 h. Os dados representam a média ± SEM de três experiências independentes. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as células normais MRC5 e células cancerosas. ***

P Art 0,001. (C) análise de citometria de fluxo da distribuição do ciclo celular de linhas celulares de cancro de pulmão, tratados com várias doses de Ching001 e para diferentes durações. (D) de imunofluorescência para α-tubulina (verde) e coloração nuclear DAPI (azul), após um tratamento uM Ching001 durante 2 a 8 horas em linhas celulares de cancro do pulmão em fase S sincronizado. DMSO foi usado como controlo do solvente. Barras de escala: 10 mm

Ching001 Inibe microtúbulos polimerização e Atrasos M-fase de progressão

Desde podofilotoxina é conhecido para direcionar microtúbulos, o seu análogo estrutural Ching001 também pode ter como alvo microtúbulos.. ensaio de montagem de microtúbulos mostrou que um tratamento Ching001 uM diminuiu a forma polimerizada insolúvel de microtúbulos dentro de 6 h (Fig. S1A). A imunofluorescência de α-tubulina mostrou perturbação significativa de organização de microtúbulos em comparação com o controlo de solvente de DMSO em ambas as células de cancro do pulmão CL1-5 (Fig. S1B) e A549. Estes resultados sugerem que a microtúbulos é o alvo potencial de Ching001.

Em seguida, examinámos efeito de Ching001 na progressão do ciclo celular. A citometria de fluxo As análises indicaram que a população /M-fase G2 das células de cancro do pulmão, incluindo tratados H1299, A549, CL1-0, e CL1-5, aumentou dependentemente da dose com 0,5 a 1 uM Ching001 tratamento durante 6 h. A /M do ciclo celular G2 população adicionalmente aumentada dramaticamente, acompanhado pela aparência da fracção sub-G1 no tratamento Ching001 prolongada durante 12 h (Fig. 1C). A análise de citometria de fluxo e ensaio de proliferação de células de cancro do pulmão em fase S sincronizado também confirmou que o tratamento Ching001 preso a progressão do ciclo celular em G2 /M-fase, por conseguinte, inibiu a proliferação (Fig. S2).

Para dissecar ainda mais o efeito de Ching001 durante a G2 /M de detenção, por imunofluorescência foi realizada de microtúbulos em células de cancro do pulmão em fase S sincronizado tratados por Ching001 (Fig. 1D). As células tratadas com DMSO começou a entrar pró-metáfase após 2 h e progrediu para anaphase a 4 h após a saída da fase S. As células procedeu à telophase em 6 h e chegou tarde cytokinesis para completar a mitose às 8 h. No entanto, as células tratadas com Ching001 entrou M-fase em 2 horas e manteve-se em metáfase mesmo em 8 h (Fig. 1D).

Para fornecer evidência molecular da prisão M-fase, realizamos análises de western blot da chave proteínas que regulam a mitose celular, incluindo aurora B, survivina e fosforilados monoclonais proteína mitótico 2 epítopos (P-MPM2) [17] – [19]. Os resultados mostraram que a Aurora B, survivina e p-MPM2 permaneceu elevada depois do tratamento Ching001 comparado com o controlo DMSO, indicando paragem na fase M (Fig. 2A). Além disso, a coloração imunocitoquímica demonstrou que cerca de 15% de DMSO, as células tratadas estavam em fase M por sua expressão de ambos Aurora B e survivina, ao passo que o tratamento Ching001 aumentou significativamente a população de células M-fase, que co-expressa Aurora B e survivina (Fig. 2B). Juntos, estes resultados demonstraram que prende Ching001 progressão do ciclo celular na fase M. Analisa

(A) transferência de Western de proteínas relacionadas com a mitose após um tratamento uM Ching001 para tempos indicados nas linhas celulares de cancro do pulmão. (B) A desregulação do ciclo celular fase M induzida por Ching001. linhas celulares de cancro de pulmão foram analisados ​​com survivina (verde), aurora B (vermelho) e DAPI (azul) depois de 1 de tratamento? M Ching001 por 24 h. DMSO foi usado como controlo do solvente. Barras de escala: 30 mm

induzida Ching001 paragem da mitose leva a danos de DNA e apoptose das células do câncer pulmonar

Ela tinha sido relatados que os erros na mitose gerar danos e fragmentação do. ADN [20]. Nossas análises de transferência de Western mostrou que o aumento de danos no ADN marcador γ-H2AX em células de cancro após tratamento Ching001 (Fig. 3A), a qual foi confirmada por imunofluorescência para γ-H2AX (Fig. S3). Para analisar se os danos no ADN induzidos por tratamento Ching001 eventualmente resulta em apoptose, PS translocação foi detectada por imunofluorescência após tratamento Ching001 (Fig. 3B). Além disso, o ensaio de escada do ADN induzida por apoptose foi realizada (Fig. 3C). Um forte translocação PS a 24 h e a indução de escadas de ADN de apoptose em 48 horas em H1299-tratada Ching001, A549, células CL1-0 e CL1-5 sugerem que os danos no ADN induzidos por erros de mitose durante o tratamento Ching001 eventualmente resulta em apoptose.

analisa (a) Western blot por danos DNA marcador γ-H2AX após 1 de tratamento? M Ching001 nos tempos indicados. (B) para o início de Imunofluorescência-apoptótica translocação PS marcador após tratamento Ching001 durante 24 h. Barras de escala: 30 mm. (C) A fragmentação de ADN específicos de apoptose foi detectada por análise de DNA escada após o tratamento Ching001 durante 48 h.

Ching001 Induz pró-apoptóticos ER stress via de sinalização

Notavelmente, a actividade de ER stress induzido caspase-4 foi aumentada de uma maneira dependente do tempo em H1299 e linhas celulares de cancro do pulmão A549 após o tratamento Ching001 (Fig. 4A). Para investigar os mecanismos de tratamento Ching001 na indução ER estresse pró-apoptótica, western blot de proteínas reguladoras da apoptose, incluindo o estresse ER vias de sinalização foram realizados. A activação do ER stress foi evidente pelo aumento da expressão de p-PREK, p-eIF2α, p-JNK, GADD153 e caspase-4 após o tratamento Ching001 (Fig. 4B). Além disso, o tratamento Ching001 diminuiu a expressão de factor anti-apoptótico Bcl-2 e aumentou a expressão do factor pró-apoptótica Bax, conduzindo a apoptose através de clivagem da apoptose verdugo da caspase-3 (Fig. 4A). Estes resultados indicaram que a apoptose induzida Ching001, pelo menos em parte, pela via de sinalização ER stress.

(A) A actividade da caspase-4 aumentou o tempo-dependente, após um tratamento uM Ching001 em ambas células A549 e cancro do pulmão H1299 linhas em tempos indicados. **:

P Art 0,01, ***:

P Art 0,001. (B) análises de Western blot de estresse ER relacionado proteínas sinalizadoras (borrões acima da linha de ponto) e apoptose relacionados proteínas sinalizadoras (manchas abaixo da linha de ponto) após o tratamento Ching001 nos horários indicados.

Ching001 Exposições

em

vivo

xenoenxerto crescimento inibição por mitose detenção e apoptose, sem indução de apoptose em tecido circundante de xenoenxerto

ensaio de tumor xenoenxerto foi realizado para testar a capacidade de inibição do crescimento do tumor Ching001

em

vivo

. A injecção intraperitoneal de 0,4 mg /kg Ching001 por cinco vezes durante o curso inicial de tratamento mostraram o efeito de inibição do crescimento do tumor, o que era semelhante à de 4 mg /kg de tratamento com paclitaxel, um inibidor de microtúbulos conhecida (Fig. 5A, painel esquerdo). A taxa de crescimento tumoral foi ainda inibida por tratamento com 2 mg /kg Ching001. Sem perda de peso corporal significativa nos animais tratados em comparação com o grupo controle foi encontrada (Fig. 5A, painel da direita).

(A) ratos ICR-nus portadores de tumores A549 estabelecidos (-50 mm

3) foram tratados com Ching001 (0,4 mg /kg ou 2 mg /kg) através de injecção intraperitoneal em dia1, Dia3, Dia5, day7, e Dia9 (como indicado por cabeças de seta). Um inibidor de microtúbulos conhecido, paclitaxel (4 mg /kg), foi usado para comparação. Os volumes tumorais (esquerda) e peso corporal (à direita) foram medidos em cada outro dia até day35. Pontos, quer dizer; barras, ± SEM. *:

P Art 0,05, **:

P Art 0,01, ***:

P Art 0,001. (B) O activada caspase-3 IHC coloração do tecido do tumor de ratinhos nus ICR-tomadas a partir do grupo de controlo solvente e tratamento Ching001 grupo (2 mg /kg). ampliação original × 200. (C) A imunofluorescência tecido de survivina (verde), Aurora B (vermelho), e DAPI (azul) de xenoenxerto de tumor de ratinhos de controlo com solvente e Ching001 ratinhos tratados com (2 mg /kg). As setas indicam as células mitóticas em tumor controlo do solvente. A figura aumentado representa os cromossomas aberrantes após o tratamento Ching001. Barras de escala:. 30 mm

Para investigar se Ching001 apoptose induzida por tumor

em

vivo

, imuno-histoquímica (IHQ) coloração da caspase-3 ativada foi realizada. Encontrámos um aumento da expressão da caspase-3 activada em xenoenxertos do tumor do grupo tratado em comparação com Ching001 grupo tratado com solvente (Fig. 5B). Além disso, o Ching001 tratadas células de tumor parece ter encolheu em núcleo e borbulhado na aparência, representando a morte celular por apoptose em nódulo xenoenxerto (Fig. S4A), enquanto nem fenótipo histológico ou apoptótica foi observada em tecido saudável circundante de xenoenxerto (Fig. S4B ). Para investigar se Ching001 mitose induzida prisão

em

vivo

, imunofluorescência do tecido da survivina e Aurora B foi realizada. Os resultados demonstraram um aumento de população de células que survivina e Aurora B co-expressa no tecido do tumor Ching001 tratados em comparação com o solvente tecido tratado (Fig. 5C). Importante, a configuração cromossoma aberrante foi observada em Ching001 xenoenxerto (inserção ampliada na Fig. 5C) tratado. Estes

em

vivo

resultados corroboram com

em

Dados vitro

que Ching001 induz a paragem da mitose, danos cromossômicos, e apoptose.

Ching001 Inibe Cancer colonização Capacidade

em

vivo

sem afetar normal Função Vital

Para verificar o

em

vivo

inibição da colonização potencial de Ching001, foram realizados estudos de metástases experimentais de animais. células de cancro do pulmão A549 foram injectadas por via intravenosa na veia da cauda de ratinhos. Os ratinhos receberam 0,2 mg /kg Ching001, um décimo da dose utilizada para estudos do crescimento animal anti-tumor, por via intraperitoneal a cada dois dias a partir do dia 1 ao dia 35. DMSO serviu como controlo do solvente e 0,2 mg /kg de paclitaxel foi incluído como um controle positivo. Além disso, também foram realizados células A549 pré-tratadas com 1 uM antes da injecção Ching001 cauda-veia. Hematoxilina e eosina (H E) mostrou significativamente menos manchas de nódulos de tumor nos pulmões dos ratinhos tratados por via intraperitoneal com Ching001 ou paclitaxel em comparação com o controlo de solvente DMSO. nódulos tumorais foram raramente encontrados em tecidos pulmonares de ratinhos intravenosamente injectados com células cancerosas Ching001 pré-tratados (Fig. 6A, painel esquerdo). O número médio de nódulos de tumor nos pulmões foi de 88, 29, 18 e 2 em DMSO, 0,2 mg /kg de tratamento com paclitaxel, 0,2 mg de tratamento /kg Ching001, e grupos de pré-tratamento Ching001, respectivamente (Fig. 6A, painel superior direito ). Não houve perda significativa do peso corporal em todos os animais tratados (Fig. 6A, painel inferior direito). Toda a análise bioquímica de amostras de sangue de animais testados não mostraram efeitos adversos aparentes no funções hepáticas e renais em comparação com o controlo de solvente (Fig. 6B). Além disso, a H E a coloração não mostraram desordem significativa órgão de coração, rim, fígado, pulmão e dissecados a partir de ratinhos tratados com Ching001 (figura S5.). Os dados sugerem que o tratamento Ching001

em

vitro

ou

em

vivo

inibir a colonização pulmonar. Notavelmente células A549, o tratamento contínuo de Ching001 de 35 dias não apresentaram toxicidade detectável nos animais tratados.

(a) (1 × 10

6) foram injectados na veia da cauda nos ratinhos BALB /c. Os ratinhos receberam 0,2 mg /kg Ching001 ou 0,2 mg /kg de paclitaxel por via intraperitoneal a cada dois dias, durante cinco semanas, como indicado pela seta cabeças no painel inferior direito. Foram também realizados células pré-tratadas com 1 uM Ching001 antes da injecção na veia da cauda. DMSO foi usado como controlo do solvente. A H E-coloração do tecido pulmonar (à esquerda), uma quantificação dos nódulos de tumor nos pulmões (superior direito), e o peso corporal (inferior direito) de ratos injectados A549 são mostrados. As setas vermelhas indicam os locais de nódulos tumorais no tecido pulmonar. Ampliação original × 100. *:

P Art 0,05. (B) Os testes de hematologia e bioquímica de sangue de ratos testados. Nos testes de hematologia, WBC, RBC, e de plaquetas foram testados. Em testes de bioquímica, TGO, TGP, albumina e total de bilirrubina são utilizados como indicadores da função hepática; Uréia e creatinina como indicadores da função renal. Os dados indicaram que o tratamento Ching001 causou nenhuma mudança aparente sobre as funções hepáticas e renais em comparação com os animais tratados com DMSO.

Discussão

Para desenvolver drogas anti-câncer com uma melhor eficácia e lateral limitada -Efeitos, nós projetamos um composto totalmente sintético Ching001 e examinou as suas actividades anti-tumorais

em

vitro

e

em

vivo

no modelo de cancro do pulmão . Ching001 mostrou citotoxicidade específica contra várias linhas de células de câncer de pulmão humanos em dosagens na gama sub-micromolar sem citotoxicidade aparente contra a linha de células de pulmão humano normal. Estudos em animais mostraram que Ching001 inibiu o crescimento do tumor e colonização

em

vivo

sem efeitos colaterais significativos em ratos testados. O papel molecular de Ching001 na inibição do crescimento do tumor é mediada, pelo menos em parte, por polimerização de microtúbulos de-levando à paragem da mitose e danos no ADN. Esses eventos, juntamente com a indução ER estresse, acabou levando à apoptose das células de câncer de pulmão

em

vitro

e

em

vivo

(Fig. 7 ).

a progressão do ciclo celular rápida é uma das características da célula cancerosa proliferado. A inibição da polimerização de microtúbulos por Ching001 prende a progressão do ciclo das células M-fase e conduz a danos no ADN. Além disso, o tratamento Ching001 desencadeada ativação de estresse ER via de sinalização através da ativação de PERK e caspase-4 cascata de sinalização. paragem na fase M prolongada e ER stress sinalização activada, subsequentemente, induzir a apoptose em células de cancro a tratado com Ching001.

O nosso análises de Western blot detectada uma expressão sustentada de p-MPM2 representando entrada do ciclo celular M-fase [18], [19], o que indica que as células tratadas Ching001 saiu da G2 e precedida a fase M. Além disso, aurora B e survivin controlar o arranjo e separação dos cromossomas durante a mitose. Degradação de Aurora B e survivina na M-fase facilita o final da mitose [17]. Observou-se um aumento da co-expressão de Aurora B e survivina em ambas as amostras de células e em animais, sugerindo que Ching001 inibe a saída de M-fase. Nossa imunofluorescência α-tubulina de células sincronizadas em fase S demonstrou uma parada do ciclo celular na metáfase. Todos em conjunto, os nossos resultados suportam a hipótese de que prende Ching001 ciclo celular na fase M que pode ser devido à inibição da polimerização de microtúbulos e perturbação de organização de microtúbulos de fuso. Prolongar prisão M-fase em células resulta na insuficiência da segregação de cromossomas e morte subsequente da mitose [21]. Os nossos resultados actuais celulares e animais fornecem evidência de que o tratamento induz a paragem do Ching001 fase M seguido por danos no ADN e morte celular por apoptose.

Falha de migração e divisão nuclear poderiam perturbar a homeostase do ER [22]. sensores ER transmembranares conhecidas como PERK e IRE1α será então activado por fosforilação que posteriormente activa o de caspase-4 [23]. Ching001 tratamento aumentou a expressão de marcadores de estresse ER e marcadores de apoptose em 6-12 h. Estes resultados sugerem que a apoptose induzida por Ching001 célula cancerosa pode ser causada concomitantemente através da indução de defeitos a mitose e a activação ER tensão em pontos de tempo iniciais. Além disso, há a activação intrínseca aparente de caspase-9 e proteínas de sinalização de apoptose apoptose sinalização extrínseca proteína caspase-8 foram observados após tratamento Ching001 (dados não mostrados), sugerindo que a apoptose induzida Ching001 célula cancerosa é através ER stress. Atenuação da apoptose mediada por ER induzido por Ching001 em sensores ER derrubado células é digno de uma investigação mais aprofundada

podofilotoxina é o análogo produto natural da Ching001 [5] – [7].. compostos derivados de podofilotoxina utilizados no tratamento do cancro, muitas vezes mostram resistência clínica devido à expressão aberrante e mutação de isotipos específicos de p-tubulina durante o curso do tratamento [24]. Além disso, a resistência de paclitaxel também foi relatado para correlacionar com um aumento da expressão da P-glicoproteínas [25], [26]. Vale ressaltar que o tratamento Ching001 mostrou um efeito citotóxico similar em várias células de câncer de pulmão expressando diferentes níveis de p-glicoproteínas (Fig. 1B e Fig. S6). Além disso, o tratamento Ching001 mostrou uma forte actividade citotóxica para uma linha celular de cancro epidérmico humano etoposido-resistentes (Fig. S7). Se Ching001 é um composto potente para o tratamento de taxanes- ou etoposido células resistentes garante estudos posteriores.

Em conclusão, Ching001 exibe crescimento anti-tumoral e a eficácia de inibição de colonização sem efeitos adversos nos nossos testes pré-clínicos. Estes resultados destacam o potencial terapêutico da Ching001 no tratamento do câncer. Sintético composto Ching001 de alta pureza e rendimento com citotoxicidade específica de células de câncer é um potencial candidato a ser testado como um composto farmacêutico chumbo para tratamento de câncer.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os animais foram obtidos a partir do Centro Nacional de animais de Laboratório (República da China, Taiwan) com a aprovação do animal Care Institucional e Use Committee (IACUC) da Universidade Kung Cheng Nacional (IACUC aprovação No. 98.099) e foram mantidas em patógeno condições livres. A aprovação do estudo pela comissão de revisão instituição bordo e ética foi confirmada pela Universidade Nacional Cheng Kung.

Linha celular, cultura celular, e sincronização

MRC5 humano normal das células epiteliais do pulmão e de pulmão humano de células de adenocarcinoma linhas CL1-0, e CL1-5 foram obtidas do Dr. PC Yang (Departamento de Medicina Interna do Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan) [27]. Os pulmão de não pequenas células do cancro de células H1299 e linhas humano A549 foram obtidas a partir da cultura celular Tipo Americana. As linhas celulares de cancro epidérmico humano KB e células KB-7D foram fornecidos pelo Dr. Jang-Yang Chang do Instituto Nacional de Pesquisa de Saúde, Tainan. A linha de células KB foi inicialmente adquirida a partir da cultura celular Tipo Americano e KB-7D é uma linha de células de etoposido-resistente derivado da linha de células KB [28]. Todas as células foram cultivadas em DMEM (Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) com 10% FBS (Gibco) e 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco) e incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera humidificada. Para sincronizar as células na fase S, as células foram tratadas com 2 mg /ml de afidicolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 24 h e libertado para o ciclo celular antes do tratamento Ching001.

compostos utilizados

o derivado de podofilotoxina, Ching001, foi preparado pelo co-autor W.-S. Li. Pedido para o composto deve ser enviado ao [email protected].

Ensaio de citotoxicidade

As células (3 × 10

4) foram semeadas em 6 bem-placas de cultura e diferentes concentrações de Ching001 (0,5, 1, 3, 5 uM) foram adicionadas a cada poço durante 48 h. número de células e viabilidade foram determinadas por coloração com azul de tripano e contagem das células.

microtúbulos Ensaio

ensaio de montagem de microtúbulos foi realizada de acordo com o estudo anterior [29]. As células (1 x 10

6) foram semeadas em placas de cultura de 100 mm e tratadas com 1? M Ching001 ou controlo de DMSO, durante 6 a 48 horas. A fracção do sobrenadante dos lisados ​​celulares totais foram recolhidos como dímeros ap-tubulina solúveis e quantificada por ensaio de Bradford. O sedimento foi recolhido como proteína insolúvel contendo microtúbulos polimerizados que foi fervido com tampão de amostra de proteína para dissolver as proteínas. Cerca de 50 ug de proteína de lisados ​​solúveis foram usados ​​como controlo de carga, e um volume igual de lisados ​​proteicos insolúveis foram usadas para α-tubulina imuno-blotting. Todos os anticorpos e as suas condições de reacção usadas estão listadas na Tabela S1.

Citometria de Fluxo

CL1-0, CL1-5, A549, H1299 e as células (1 x 10

6) foram recolhidas após 6 e 12 h de tratamento com 0,5 uM ou 1 uM Ching001, lavou-se duas vezes com solução de Hank equilibrada de sal (Sigma-Aldrich) e -20

oC etanol fixação durante a noite. As células foram incubadas com o ADN intercalador de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich) a 37

° C durante 1 h com 1 ug /ml de RNase A e 0,1% de Triton-X100. Cerca de 3 × 10

4 células foram detectadas utilizando FACScalibur instrumento (BD Biosciences, San Jose, CA) para analisar a distribuição do ciclo celular.

Imunocitoqu�ica Coloração

Células (1 × 10

4) foram semeadas em lâminas de câmara e tratada com Ching001 ou DMSO de controlo durante 48 h. As células tratadas foram hibridadas com o anticorpo α-tubulina e DAPI após a fixação. Os anticorpos da survivina e Aurora B foram usados ​​para coloração de células mitóticas. O anticorpo anti-PS foi utilizado para a detecção da fase inicial da apoptose. As células foram então fotografadas em um microscópio confocal OLYMPUS FV1000. Os procedimentos detalhados e anticorpos estão descritos na Tabela S1.

Western Blot Analysis

amostras contendo quantidades iguais de proteína (50 ug) foram separadas em 10% SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas Immobilon-P membranas (Millipore). Western blot foi realizada para medir o nível de expressão da proteína. Os procedimentos detalhados e anticorpos estão descritos na Tabela S1.

DNA Ladder Ensaio

As células (1 x 10

6) foram tratados com controlo de DMSO ou de 3 a 5 uM Ching001 durante 24 a 48 h, O DNA foi extraído usando tampão de extracção de ADN (tampão de fosfato-citrato 0,2 uM, pH 7,8; ​​37

oC, 1 h de reacção), seguido pela ARNase A e proteinase K tratamento. electroforese em gel de agarose foi usada para análise de DNA escada.

Caspase-4 Ensaio de Actividade

ensaio da actividade da Caspase-4 foi realizada por caspase-4 kit de ensaio de actividade (GeneTex, Irvine, CA). Em resumo, cerca de 200? G de lisados ​​celulares totais com controlo de DMSO ou tratamento Ching001 durante 6 a 48 horas foram utilizados para o ensaio. A actividade da caspase-4 foi determinada por clivagem do substrato LEVD-AFC e detectada pelo leitor de ELISA (Ex /Em: 400/505).

quantitativa de Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR)

A expressão de mRNA de genes da família da glicoproteína-P

ABCB1

e

ABCG2

foram detectados por qRT-PCR em ambas as linhas de células normais e câncer de pulmão. O ARN total foi extraído a partir de linhas de células de pulmão humanas diferentes, utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cerca de 4 ug do ARN foram sujeitos a transcrição reversa em ADNc, utilizando transcriptase inversa Superscript (Invitrogen). RT-PCR quantitativa foram realizados para detectar o nível de genes alvo utilizando o ™ em tempo real do sistema StepOnePlus PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) com

GAPDH como controlo interno a expressão do mRNA. Os primers para

ABCB1

são: sentido 5′-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3 ‘, 5′-antisense CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3’; para

ABCG2

: sentido 5′-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3 ‘, 5′-antisense GGCCCGTGGAACATAAGTCTT-3’; para

GAPDH

: sentido 5′- GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘, 5′-antisense TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’. As amostras de ADNc foram amplificados utilizando o SYBR Green (Applied Biosystems) e a condição de ciclos térmicos composta de 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos a 95 ° C durante 3 seg e 60 ° C durante 30 seg. limiar de ciclo (Ct), foram determinados o número de ciclo fraccionada em que a quantidade de alvo amplificada chegou a um limite fixo. As proporções normalizadas de genes alvo foram calculados utilizando ΔCt [ΔCt = Ct

gene -target – Ct

-GAPDH]. Os dados foram apresentados como diferenças vezes em relação aos IMR90 normal de expressão de genes de células de pulmão com base em cálculos de 2

-ΔΔCt. (ΔΔCt = ΔCt

linha de células de Pulmão – ΔCt

-IMR90)

Análise de Citotoxicidade de MTT

diferentes concentrações de Ching001 foram adicionados a cada placa e incubou-se durante 48 h. As viabilidades celulares com diferentes concentrações do composto de tratamento foram determinadas por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-ensaio difenil tetrazólio (MTT, Sigma, St. Louis, MO). No controle sem tratamento, foi utilizado 0,1% de meio contendo DMSO.

In vivo

formação de tumores xenoenxerto Ensaio

ICR-Foxn1 ratinhos nus (5 semanas de idade) foram adquiridos a partir do Centro Nacional de animais de Laboratório com a aprovação do animal Care Institucional e Use Committee (IACUC) da Universidade Kung Cheng Nacional (IACUC aprovação No. 98.099), e cresceu em um ambiente livre de patógenos específicos. As células A549 (5 × 10

6) foram injectados por via subcutânea como xenotransplante em ratinhos e deixadas crescer até 50 mm

3 nódulo tumoral dentro de 2 semanas. Os ratinhos foram em seguida injectados intraperitonealmente com 0,4 mg /kg, ou de 2 mg /kg Ching001, ou 4 mg /kg de paclitaxel como controlo positivo, ou controlo de solvente (etanol: cremofore: DDH

2O = 02:01:07) no dia 1, 3, 5, 7, 9. o volume do xenoenxerto e o peso dos ratos foram medidos e quantificados durante 35 dias de tratamento com fármaco. O volume de xenotransplante foi calculada como (comprimento x largura quadrado) /2 em mm

3. Principais órgãos, incluindo coração, pulmão, fígado, rim e nódulos xenoenxerto foram dissecados e corados com H . E para confirmação

In vivo

Metástase experimental Ensaio

A camundongos BALB /c foram adquiridos e levantou depois de obter a permissão conselho de revisão institucional adequado como descrito acima. A549 (1 × 10

6) As células foram injectados intravenosamente em cauda-venosa de ratinhos BALB /c, que foram, em seguida, por via intraperitoneal dadas controlo de DMSO, 0,2 mg /kg Ching001 ou 0,2 mg /kg de paclitaxel a cada dois dias durante cinco semanas .