Abstract

Fundo

Redução quimio-sensibilidade das células cancerosas sólidos representa um obstáculo fundamental na oncologia clínica. Assim, a caracterização molecular de vias que regulam a quimiossensibilidade é um pré-requisito fundamental para melhorar a terapia do cancro. O factor de HIF-1α hypoxia-inducible tem sido associada a quimiossensibilidade ao mesmo tempo os mecanismos moleculares subjacentes permanecem em grande parte elusiva. Portanto, nós exaustivamente analisado o papel da HIF-1α na determinação quimio-sensibilidade centrando-se sobre as vias moleculares responsáveis.

Metodologia e principais conclusões

interferência de RNA foi aplicado para inativar HIF-1α ou p53 no cancro gástrico humano linhas celulares AGS e MKN28. Os agentes quimioterapêuticos, 5-f luorouracilo e cisplatina foram usadas e a quimiossensibilidade foi avaliada por ensaios de proliferação celular, bem como a determinação da distribuição do ciclo celular e apoptose. Expressão das proteínas p53 e p53 alvo foi analisado por western blot. a actividade de NF-kB foi caracterizado por meio de teste de desvio de mobilidade electroforética. Inactivação de HIF-1α em células cancerosas gástricas resultou em elevação robusta de quimio-sensibilidade. Por conseguinte, as células-HIF-1a competente exibida uma redução significativa da senescência induzida por quimioterapia e apoptose. Notavelmente, este fenótipo foi completamente ausente no

p53

células mutantes, enquanto inativação do p53

per se

não afetou quimio-sensibilidade. HIF-1α marcadamente suprimida activação induzida por quimioterapia de p53 e p21, bem como a proteína do retinoblastoma, eventualmente, resultando na paragem do ciclo celular. reduzida formação de espécies de oxigénio reactivas nas células HIF-1α-competentes foi identificado como sendo o mecanismo molecular da inibição HIF-1α mediada por p53. Além disso, a perda de HIF-1α revogada, de um modo dependente da p53, de NF-kB de ligação ao ADN e a expressão de genes alvo de NF-kB anti-apoptóticos induzidos por quimioterapia. Por conseguinte, a reconstituição da subunidade p65 de NF-kB inverteu o aumento da quimio-sensibilidade das células-HIF-1a deficiente.

Conclusão e Significado

Em resumo, identificou-HIF-1α como um regulador potente da actividade de p53 e NF-kB, sob condições de stress genotóxico. Conclui-se que

p53

mutações em tumores humanos têm o potencial para confundir a eficácia do HIF-1 inibidores na terapia do cancro

Citation:. Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, CA Schmitt, et ai. (2010) A hipoxia-inducible factor 1α Determina cancro gástrico Chemosensitivity através da modulação da p53 e NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038

editor: Deb Fox, do Instituto de Pesquisa para crianças do Hospital Infantil de Nova Orleans, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de abril de 2010; Aceito: 19 de julho de 2010; Publicação: 10 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Rohwer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (https://www.dfg.de) para TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 e 133 /2-3), e NR (Graduiertenkolleg 276/4 – “Signalerkennung und -umsetzung”). TC também foi apoiado por uma bolsa da Berliner Krebsgesellschaft e.V. (https://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

resistência intrínseca e adquirida de drogas são as principais causas para a eficácia limitada da quimioterapia na maioria das malignidades gastrointestinais, incluindo o cancro gástrico [1], [2]. A resistência às drogas representa um fenómeno complexo e multifatorial relacionada com microambiente do tumor, por exemplo, hipoxia, acidose e inflamação, bem como a própria célula neoplásica [3]. resistência celular pode ser inerente ao fundo genético específico da célula do tumor ou resultar de mutações e alterações epigenética após a terapia anti-proliferativa [4], [5].

O factor de transcrição hipoxia-inducible factor 1 (HIF-1 ) constitui um regulador fulcral da adaptação à hipoxia celular e tem sido implicado na resistência à droga [6] – [8]. A proteína HIF-1 é um heterodimero composto de uma subunidade-β constitutivamente expresso (ARNT (receptor de hidrocarboneto de arilo translocador nuclear)) e uma subunidade-α hypoxia-inducible [9]. Sob condições de normóxia, actividade de HIF-1α pode ser induzida por vários factores de crescimento, citocinas, oncogenes activados ou perda de função de genes supressores de tumor mutante [10]. HIF-1α é centralmente envolvido em vários aspectos da tumorigénese, incluindo a proliferação do tumor celular, angiogénese, metástase, assim como a resposta à quimioterapia e à radioterapia [11]. HIF-1α é abundante em um grande número de tumores sólidos, e expressão tumoral HIF-1α é frequentemente associada com mau prognóstico [12] – [15]. eficácia Além disso, a inibição do HIF-1α por meio de interferência de ARN ou compostos farmacológicos provou antitumoral em diversos modelos de cancro murino [16]. Uma contribuição de HIF-1α à quimiorresistência de células neoplásicas foi observada em um amplo espectro de tumores sólidos, incluindo o cancro gástrico [6] – [8], [17] – [20]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes, bem como o papel de HIF-1α para resistência à droga sob condições de normóxia permanecem em grande parte evasivo [8], [18], [21]. Aqui, identifica-supressão de p53 e a promoção da actividade do factor nuclear kB (NF-kB) como mecanismos centrais para de HIF-1α-sensibilidade determinação papel contra a 5-fluorouracil (5-FU) e cisplatina em células cancerosas humanas gástricas.

resultados

HIF-1α determina a sensibilidade das células cancerosas gástricas para os agentes quimioterápicos 5-FU e cisplatina

inativação funcional de HIF-1α foi conseguido através de transdução lentiviral da AGS e células MKN28 com pequena interferência RNA (siRNA) visando especificamente HIF-1α. Esta abordagem experimental produziu um knockdown altamente eficiente demonstrado por uma falha completa próximo das células transduzidas para induzir proteína HIF-1α em resposta a hipoxia, tal como publicado anteriormente [22]. Para avaliar a importância de HIF-1α para a sensibilidade de células de cancro gástrico humano a agentes quimioterapêuticos estabelecidos, compararam-se os efeitos de 5-FU e cisplatina em HIF-1α-competente (mexidos, “SCR”) e HIF-1α deficiente (knockdown, “KD”) células AGS. inactivação funcional de HIF-1α deslocado a dependência da dose de inibição de crescimento para concentrações de droga mais baixas (Figura 1A e Figura S1), o que sugere que o HIF-1α é capaz de reduzir a susceptibilidade a quimioterapia de células de cancro gástrico sob condições de normóxia. Em consonância com relatórios anteriores [6] – [8], [17], [18], a exposição a hipoxia aumento da resistência ao 5-FU em células AGS, no entanto inactivação de HIF-1α resultou em elevação robusta de quimiossensibilidade sob condições hipóxicas ( Figura S2). Em uma abordagem complementar, que estudou as consequências da superexpressão de HIF-1α (pcDNA HIF-1α) para a quimio-sensibilidade das células AGS. AGS células que sobre-expressam de HIF-1α estavam consideravelmente mais resistentes ao tratamento com 5-FU (Figura 1B). expressão de HIF-1α estável foi confirmada pelo HRE (hipoxia elemento responsivo) ensaio de repórter de luciferase (Figura 1C). Estes resultados sugerem fortemente que o HIF-1α limita a acção citotóxica de 5-FU e cisplatina em células de cancro gástrico humano e que a inactivação de HIF-1α pode ter efeitos benéficos sobre a quimiossensibilidade.

(A) Proliferação de AGS KD e células SCR 24 h após o tratamento com concentrações crescentes de 5-FU em condições de normóxia. Os números de células são apresentados como percentagem de células não tratadas (*,

P

0,05; **,

P

0,01). (B) As células do tipo selvagem AGS foram transfectadas com vector de expressão de HIF-1α (pcDNA HIF-1α) ou vector vazio (pcDNA 3.1) e tratado com 5-FU 24 h após a transfecção. Os números de células foram determinados 24 h após o tratamento com 5-FU, e estão apresentados como percentagem de células de controlo não tratados (**,

P

0,01). células (C) AGS de tipo selvagem foram co-transfectadas com pcDNA HIF-1α ou pcDNA 3.1 mais repórter de luciferase de HRE-(PHRE-Luc) e

Renilla

repórter (phRL-nulo) como controlo interno. As células foram colhidas 48 h após a transfecção. a actividade da luciferase de HRE, normalizada para

Renilla

actividade da luciferase foi expressa em relação à das células de controlo transfectadas (***,

P

0,001).

limites HIF-1a quimioterapia induzida por interrupção do ciclo celular e apoptose via supressão de p53

Nós começamos uma caracterização da inibição do crescimento observada pela análise dos padrões de distribuição do ciclo celular após a quimioterapia. L

1-sincronizadas, as células privadas de soro AGS foram libertados a partir de G

0 /L

1 fase por adição de perfis do soro e do ciclo celular foi determinado após a adição de 5-FU. culturas lançadas do AGS não tratados progrediram rapidamente através de G

1 em S e G

2 /H fases [22], enquanto que as células tratadas com 5-FU permaneceu em G

1 fase (não representado). Curiosamente, a retenção de 5-FU-dependente das células em G

1 fase foi grandemente aumentada em comparação com AGS KD células AGS SCR, consistentes com L

uma célula de paragem do ciclo (Figura 2A). a paragem do ciclo celular irreversível emergiu como um importante modo de acção de agentes antiproliferativos e é caracterizado por características celulares de senescência [7], [23]. Assim, determinou-se a fracção de células senescentes. De facto, o tratamento com 5-FU conduziu a uma indução da senescência robusto nas células AGS. Esta resposta foi significativamente reforçada em células com perda concomitante de HIF-1α (Figura 2B). Além disso, a indução de apoptose foi sugerida por um aumento

uma fracção pré G em histogramas de ADN de células AGS KD-tratados com 5-FU (não mostrado). Portanto, a análise quantitativa da fracção de células apoptóticas foi obtido com base na detecção de caspase-3 (Figura 2C). células AGS KD Consistente com os dados sobre a distribuição do ciclo celular, a fracção de apoptose induzida por 5-FU foi significativamente aumentada em HIF-1α deficientes em comparação com células-HIF-1a competente.

(A) AGS KD e células SCR foram tratadas durante 24 h com 10 ug /mL de 5-FU, e a distribuição do ciclo celular foi determinada por análise FACS (**,

P

0,01). senescência induzida por quimioterapia (B) foi quantificada nas células AGS KD e SCR 4 dias após o tratamento com 5-FU por medição da actividade de SA-β-Gal (**,

P

0,01). células AGS KD e SCR (C) foram tratadas durante 48 h com 10 ug /mL de 5-FU e a apoptose foi quantificada com base na detecção de caspase-3 utilizando citometria de fluxo (**,

P

0,01 ). (D) Análise de imunotransferência representativas das proteínas p53, p21, CDK2, ciclina A e os níveis de proteína pRb em AGS e KD células SCR tratadas com 10 ug /mL de 5-FU durante 6 e 24 h. Actina serviu como controle de carga. ppRb, fosforilada pRb.

senescência induzida por quimioterapia e apoptose ambos têm sido intimamente ligada ao supressor de tumor

p53

. Assim, temos a hipótese de que a p53 pode contribuir para a citotoxicidade aumentada de 5-FU sobre a perda de HIF-1α. Após o tratamento com 5-FU, a proteína p53 gradualmente acumulada nas células AGS, um efeito que foi notavelmente aumentada em células AGS-HIF-1a deficiente (Figura 2D). Esta estabilização de p53 foi associada com o aumento dos níveis de p21 inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK), um alvo transcricional bem estabelecida e efector a jusante de p53 com funções na paragem do ciclo celular, indução de apoptose e senescência (Figura 2D). Mais uma vez, as células AGS-HIF-1a deficiente mostraram um aumento significativamente mais forte do que em células p21 AGS-HIF-1a proficiente. indução forte de p21 é esperado para inibir a actividade de G

1 ciclina /CDK complexos, resultando em hipofosforilação da proteína do retinoblastoma (pRb) e falha para induzir ciclinas em fase S, por exemplo, ciclina A. Com efeito, tanto a pRb hipofosforilação e níveis reduzidos uma ciclina foram confirmados em células AGS KD-tratados com 5-FU e – em menor grau – também em células SCR AGS (Figura 2D). Estas alterações corroboram a retenção L

uma fase observada em histogramas de ADN e são consistentes com o G irreversível

1 detenção observada em senescência induzida por quimioterapia. Assim, os diferentes resultados biológicos do tratamento com 5-FU em células AGS HIF-1α-deficientes e -proficient surgir de regulação diferencial das proteínas p53 e p21 seu alvo a jusante.

A inactivação de p53 embota o papel de HIF-1α para chemosensitivity

para obter evidência experimental para o papel proposto para p53 na regulação HIF-mediada por 1α de quimio-sensibilidade nas células AGS, nós p53 funcionalmente inactivado por interferência de RNA usando transfecção transitória de anti-p53 siRNA (p53 si) ou um controle mexidos siRNA (si scr). P53 foi eficientemente batido para baixo, como indicado pela incapacidade das células transf ectadas para induzir a p21 efectores p53 e MDM2 em resposta ao tratamento com 5-FU (Figura 3A). Interessantemente, as células transfectadas com AGS KD Si p53 foram significativamente menos susceptível à inibição do crescimento por 5-FU do que as células transfectadas com AGS KD ARNsi de controlo (Figura 3B). De acordo com estes resultados, L retenção de ciclo de

1 celular e a apoptose de células AGS KD-tratados com 5-FU foram reduzidos por knockdown p53 em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo (Figura 3D e 3E). Em acentuado contraste, células de quimiossensibilidade AGS-HIF-1a proficiente não foi influenciada pela inactivação de p53 (Figura 3C).

AGS células foram transfectadas com ARNsi de controlo (Si SCR) ou ARNsi contra p53 (p53 Si) , e 10 ug /mL de 5-FU foi adicionado 24 h após a transfecção. (A) Análise de imunotransferência da expressão de p53, p21 e MDM2 em extractos de células inteiras a partir de células AGS KD após o tratamento com 5-FU. Actina serviu como controle de carga. (B e C) Os números de células SCR de Si e Si p53 transfectadas células AGS foi determinada 24 h após o tratamento com 5-FU. Os resultados são apresentados como percentagem de células de controlo não tratados (**,

P

0,01). As células do L

1 fase (D) e thesub-L

uma população de (E) foram avaliadas a partir de histogramas de ADN de células AGS KD transfectadas com p53 Si ou SCR Si e tratada durante 24 h com 5-FU ( *,

P Art 0,05; **,

P

. 0,01)

HIF-1α não afetam quimio-sensibilidade em

p53

células mutantes

para confirmar a regulação HIF-dependente 1α de 5-FU capacidade de resposta e para caracterizar melhor a contribuição de p53, examinamos uma segunda linha humana gástrica célula cancerosa (MKN28), que carrega uma missense mutação em

TP53

no códão 251. É interessante que a eliminação de HIF-1α em células MKN28 não conseguiu aumentar a inibição do crescimento após a exposição ao 5-FU (Figura 4A). Do mesmo modo, induzida por 5-FU G

1 acumulação e a apoptose de células MKN28 não foram afectados por perda de HIF-1α (Figura 4B e 4C). De acordo com estes resultados, os níveis de proteína de p53 e pRb manteve-se inalterada em células MKN28 5-FU-tratados ao longo do período de 24 h, e a indução de p21 estava ausente (Figura 4D). No entanto, quando a função de p53 foi restaurada por pré-tratamento com o composto químico PRIMA-1 [24] knockdown HIF-1α traduzido para uma significativamente melhorada de 5-FU citotoxicidade (Figura S3). Consistente com o papel estabelecido da p53 em citotóxica induzida pela quimioterapia /efeitos citostáticos, o tratamento com PRIMA-1

per se

ligeiramente reduzida a proliferação de células MKN28 e aumentou significativamente a eficácia de 5-FU em células MKN28 (Figura S3).

(A) Os números de células de MKN28 KD e células SCR 24 h após o tratamento com 5-FU em condições de normóxia. Os dados são apresentados como a percentagem de células não tratadas. As células em G

1 fase (B) e células apoptóticas (C) foram quantificadas a partir de histogramas de ADN de células MKN28 KD e SCR tratadas durante 48 h com 10 ug /mL de 5-FU. (D) A análise de imunotransferência de p53, p21 e os níveis de proteína pRb em células MKN28 KD e SCR tratadas com 10 ug /mL de 5-FU durante 6 e 24 h. Actina serviu como controlo de carga.

NF-kB é um importante mediador da função do HIF-1α na quimiossensibilidade

A activação do NF-kB está associada com a protecção contra a apoptose induzida por quimioterapia e , inversamente, a inibição do NF-kB pode melhorar a eficácia de agentes anti-neoplásicos tanto

in vivo

e

in vitro

[25] – [27]. Portanto, determinou-se a actividade de NF-kB de ligação ao ADN em células de AGS HIF-1α-deficientes e -proficient após o tratamento com 5-FU por ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA). O tratamento com 5-FU potentemente activada de NF-kB de ligação ao ADN em células de AGS SCR, com níveis de pico ocorrendo 6 h após a exposição ao 5-FU (Figura 5A). O tratamento com TNFa durante 4 h serviu como controlo positivo para a activação de NF-kB. Além disso, um supershift foi induzida por um anticorpo anti-p65, confirmando que os complexos NF-kB induzida pelo 5-FU continha a subunidade de 65 kDa (p65). Perda de HIF-1a activação inibiu significativamente de NF-kB em resposta a 5-FU e TNFa (Figura 5A). Consistente com esta observação, 5-FU tratamento também não conseguiu induzir os genes alvo de NF-kB cIAP1 e A20 em células AGS KD, enquanto que foram prontamente induzida em células SCR AGS (Figura 5B).

(A) os extractos nucleares de células AGS KD e SCR foram preparados nos pontos de tempo indicados após o tratamento com 10 ug /mL de 5-FU ou o TNFa como um controle positivo, e a actividade de ligação do ADN para o NF-kB foi examinada por EMSA. Para as experiências de supershift, extractos nucleares foram incubadas com um anticorpo anti-p65. (B) Expressão de genes alvo de NF-kB e cIAP1 ARNm A20 em extractos totais obtidos a partir de células de ARN AGS KD e AGS SCR 48 h após o tratamento com 10 ug /mL de 5-FU. Os dados foram expressos em relação aos níveis de ARNm em células não tratadas AGS SCR, fixado em 1,0 (*,

P

0,05; **,

P

0,01). células (C) AGS KD foram co-transfectadas com pcDNA p65 ou pcDNA 3.1 e tratada com 5-FU 24 h após a transfecção. Os números de células foram depois mais 24 h e são apresentados como percentagem de células de controlo não tratadas (***,

P

0,001). a actividade de ligação de ADN (D) para o NF-kB foi examinada por EMSA usando extractos nucleares de células MKN28 KD e SCR tratadas com 10 ug /mL de 5-FU ou TNFa durante os tempos indicados. inibição dos anticorpos foi realizada com um anticorpo anti-p65.

Para abordar o significado funcional de NF-kB para a inibição do crescimento induzida por 5-FU, que sobre-expressa a p65 (p65 pcDNA) em células AGS kD. A transfecção de p65 pcDNA, mas não o vector de controlo vazio, resultou numa indução significativa de proteína p65 e a actividade transcricional de NF-kB em células AGS kD (Figura S4). Digno de nota, as células AGS KD-HIF-1a deficiente que sobre-expressam a p65 foram consideráveis ​​mais resistentes ao tratamento com 5-FU em comparação com células AGS KD transfectadas com o vector de controlo (Figura 5C), consistente com um papel essencial de NF-kB na mediação quimiorresistência em direcção 5-FU em células de cancro gástrico. Tomados em conjunto, uma activação simultânea de p53 e a inibição do NF-kB em 5-FU-tratados, observou-se células AGS-HIF-1a deficiente. Para esclarecer, se ambos os eventos são interdependentes, estudamos induzida por 5-FU a activação de NF-kB em células MKN28 com mutante

p53.

Ambos 5-FU e TNFa activada de NF-kB de ADN de ligação em um tempo- forma dependente, que indica mecanismos independentes da p53 de activação de NF-kB por 5-FU (Figura 5D). No entanto, diferente do achado nas células AGS, esta ativação NF-kB na

p53

linha de células mutante não foi anulado pela inativação HIF-1α. Assim, HIF-1α pode apoiar a activação de NF-kB induzida pela quimioterapia por contrariar mecanismos inibitórios dependente de p53.

formação de ROS Altered é responsável pela modificação induzida pelo HIF-1α da atividade p53

Para clarificar o mecanismo subjacente superindução p53 molecular em 5-FU-células tratadas com HIF-1α-deficientes, que caracteriza o papel de espécies de oxigénio reactivas (ROS). ROS constituem uma ligação candidato como (i) ROS são activadores potentes de função de p53 e dos factores-chave considerados na indução de p53 por vários agentes quimioterapêuticos [28], e (ii) HIF-1α pode suprimir a produção de ROS, diminuindo a actividade mitocondrial e biogénese [22], [29], [30]. Assim, as células AGS KD foram pré-tratados com o cloreto de Ros-inibidores diphenyleneiodonium (DPI) ou apocinina. Ambos os inibidores conferiu uma protecção significativa contra a inibição do crescimento induzida por 5-FU em células AGS kD (Figura 6A e 6B). Além disso, o DPI e apocinina impedido quase completamente a indução de p53 e p21 seu alvo a jusante em 5-FU-tratados células (Figura 6C e 6D). Estes resultados sugerem uma intersecção de sinalização HIF-1α com a resposta mediada por p53 a 5-FU no nível de produção de ROS. Para estabelecer um papel causal do HIF-1α para o potencial redox das células AGS após o tratamento com 5-FU, os níveis de ROS intracelulares foram determinados em células AGS KD e SCR por citometria de fluxo. Nós descobrimos que os níveis de superóxido intracelulares em células AGS KD-tratados com 5-FU foram 2,5 vezes mais elevadas do que aquelas em células AGS SCR-tratados com 5-FU (figura S5), indicando que a inactivação funcional de HIF-1α em células AGS resultou elevação significativa e funcional do stress oxidativo intracelular mesmo sob tratamento quimioterapêutico.

(a-D) células AGS KD foram pré-tratados durante 16 h com diferentes concentrações de inibidores da NADPH-oxidase diphenyleneiodonium (DPI) ou apocinina. Proliferação de DPI-pré-tratados (A) ou (B) células AGS KD apocinina pré-tratamento 24 horas após o tratamento com 10 ug /mL de 5-FU em condições de normóxia (***,

P

0,001). Os números de células são apresentados como percentagem de células não tratadas. (C e D) O efeito de DPI (C) e apocinina (D) nos níveis de proteína p53 e p21 foi determinada por análise de imunotransferência utilizando extractos celulares totais de células AGS KD tratadas durante 24 h com 10 ug /mL de 5-FU. (E) O modelo proposto para a regulação 1-dependente HIF de quimio-sensibilidade pela modulação induzida ROS de p53. (Painel da esquerda) a resposta induzida por quimioterapia em células de HIF-1-competente. HIF-1 neutraliza a geração de ROS ao nível mitocondrial. Diminuição dos níveis de ROS por sua vez activação abate de p53 e permitir a progressão do ciclo celular, apesar da quimioterapia. Assim, as células de HIF-1-competente exibir um fenótipo mais resistente à quimioterapia. Ub, ubiquitina; P, fosfato. (Painel da direita) a resposta induzida por quimioterapia em células de HIF-1-deficiente. Inactivação de HIF-1 leva a geração de ROS mitocondrial acelerado. ROS são indutores potentes de p53 e, assim, aumentar a activação de p53 por agentes quimioterapêuticos. P53, por sua vez transactiva -entre outros – a quinase (CDK) p21 inibidor dependente da ciclina e inibe a atividade de NF-kB. A ativação combinada de p53 e inibição da NF-kB, resultar em apoptose e /ou senescência das células HIF-1-deficiente, portanto, um fenótipo mais quimiossensíveis.

Discussão

A factor de transcrição HIF-1α foi estabelecida como mediador importante da quimiorresistência mediada por hipoxia [6] – [8], [17], [18], [20]. Aqui, nós identificamos HIF-1α como um poderoso determinante da quimio-sensibilidade em células de câncer gástrico em condições de normóxia. Através da aplicação de um sistema à base de siRNA lentivírus Mostramos significativamente melhorada de 5-FU e cisplatina toxicidade em células de cancro gástrico-HIF-1a deficiente. Os dados disponíveis sobre o papel de HIF-1α para a quimio-sensibilidade das células cancerosas sob condições de normóxia são conflitantes. Enquanto as células de fibrossarcoma-HIF-1a deficiente (HT1080) apresentadas melhorado significativamente a sensibilidade para com etoposídeo sob ar ambiente, o cancro do cólon (HCT116) e hepatoma (Hepa-1) células não conseguiu fazê-lo [6]. Unruh

et ai. Relataram

susceptibilidade aumentada de fibroblastos embrionários de murídeo-HIF-1a deficiente a carboplatina ou etoposido sob normóxico, bem como condições de hipóxia [8]. Com relação ao câncer gástrico, o reforço da eficácia do 5-FU e vincristina foi demonstrado sob normoxia

in vitro

[18]. Bem de acordo com nossos resultados, ambos os estudos concluíram um papel fundamental para o HIF-1α na mediação chemoresistance em condições de normóxia. Curiosamente, um estudo recente no Japão demonstraram menor eficácia da quimioterapia baseada em 5-FU em HIF-1α-expressando adenocarcinomas gástricos humanos, fortalecendo a percepção de HIF-1 como um factor decisivo na determinação de quimioresistência cancro gástrico [31].

O controlo da progressão do cancro pela quimioterapia depende, pelo menos em parte, na indução de senescência celular. Recentemente, foi demonstrado perda de HIF-1α para causar senescência prematura de fibroblastos embrionários de murídeo imortalizadas sob condições de normóxia [32]. Nossos dados atuais sugerem que HIF-1α semelhante protege as células cancerosas gástricas contra a senescência induzida por quimioterapia em condições de normóxia. Este constitui o primeiro relatório de senescência induzida por quimioterapia elevada através de inactivação funcional de HIF-1α em uma linha celular de cancro humano estabelecido. Em células-HIF-1a deficiente, observamos também melhorou a indução de apoptose em resposta a 5-FU. Estudos anteriores relataram uma reactivação do factor pró-apoptótica Bid [6], ou uma mudança no equilíbrio de membros da família Bcl-2 pró e anti-apoptóticos para explicar o aumento das taxas de apoptose seguintes inativação de HIF-1α em células de câncer gástrico tratados com a droga [ ,,,0],. 18]

o nosso estudo identifica um novo mecanismo, pelo qual o HIF-1α neutraliza tanto a senescência e a apoptose induzida por quimioterapia: apresentamos provas conclusivas para a capacidade de HIF-1α para suprimir a indução do supressor de tumor p53 em resposta ao 5-FU em condições de normóxia. P53 é um determinante fundamental destino celular, devido ao seu papel na regulação da progressão do ciclo celular e a apoptose em resposta ao estresse celular e constitui o gene mais frequentemente mutado em cancros humanos [33]. Uma grande variedade de agentes quimioterapêuticos foram mostrados para estabilizar p53 e, por outro lado, a perda de p53 constitui um mecanismo básico de resistência no sentido de quimioterapia do cancro [33], [34]. A interacção das proteínas p53 e HIF-1α tem sido o objecto de debates de longas como ambos os relatórios positivos e negativos foram publicados [35]. No entanto o trabalho, a toda publicado anteriormente centrada na p53-HIF-1a-interações sob condições hipóxicas (ou mesmo anóxica). Para o melhor de nosso conhecimento, nossas experiências para o primeiro tempo, fornecer evidência para a supressão da atividade p53 pelo HIF-1α em condições de normóxia. Como consequência da regulação positiva p53 em células-HIF-1a deficiente, foram observadas mudanças nas efectores a jusante que estão ligados à característica parada do ciclo celular irreversível de senescência, por exemplo, estabilização de p21 e hipofosforilação de pRb. Diferente da nossa observação, trabalhos recentes sobre chemoresistance direção etoposídeo em fibroblastos embrionários murinos imortalizada HIF-1α com deficiência não observamos uma indução de p21 [36]. Além disso, o HIF-1α estabilizado p21 e p27, bem como conduzido para hipofosforilação de pRb, durante a paragem do crescimento induzida por hipoxia de fibroblastos embrionários de murídeo imortalizadas e B-linfócitos esplénicos primários [37]. Estes resultados contrastantes são provavelmente explicada pelos tipos de células investigadas: Enquanto Goda

et al

. caracterizada uma resposta fisiológica a hipoxia em tipos de células não transformadas, foi analisada a resposta ao dano no DNA grave em linhas celulares de cancro estabelecidas.

Enquanto p53 foi mostrado várias vezes para neutralizar a função de NF-kB [38], [39 ], os nossos dados actuais indicam um papel para o supressor de tumor na regulação da activação do NF-kB HIF-dependente 1α. Além de p53, NF-kB tem emergido como um segundo determinante, centro de resistência a agentes quimioterapêuticos [40]. Vários estudos estabeleceram ligações funcionais entre NF-kB e HIF-1α, embora eles variavelmente colocar HIF-1α quer a montante de NF-kB ou vice-versa. Por exemplo, a estabilização induzida por hipoxia de HIF-1α em células de músculo liso está sob o controle transcricional de NF-kB [41]. Da mesma forma, os resultados obtidos a partir de camundongos knockout IKK-beta condicional confirmou o papel central da NF-kB no controle basal e expressão induzida por hipoxia de HIF-1α

in vivo

[42]. Por outro lado, a expressão do gene da subunidade p65 de NF-kB, foi demonstrado que ser controlada por HIF-1α no contexto da apoptose suprimida-hipóxia dos neutrófilos [43]. A nossa descoberta de acentuadamente reduzida atividade de NF-kB em células-HIF-1a deficiente no tratamento com 5-FU, portanto, está bem de acordo com este último relatório. Curiosamente, observaram-se também significativamente reduziu a ligação de subunidades NF-kB em células de HIF-1α deficientes após estimulação com TNFa, um indutor bem estabelecido da actividade de NF-kB [44] ADN. Isto levanta a questão pertinente em que condições fisiológicas e fisiopatológicas HIF-1α é capaz de regular a activação de NF-kB. HIF-1α e NF-kB partilhar importância crucial para vários processos, tais como a inflamação, morte microbiana e tumorigénese. A natureza molecular exato, bem como a hierarquia de sua interação é mais provável células e dependente do contexto e não pode ser generalizada.

No estudo atual, fomos capazes de identificar ROS como um ponto de intersecção de HIF- 1a com a resposta ao stress celular mediada por p53 a quimioterapia. Intracelular ROS são conhecidos como indutores potentes da p53 e participar na activação de p53 por fármacos quimioterapêuticos [45]. Mitocôndrias representam a principal fonte de ROS intracelular [46], e HIF-1α provavelmente neutraliza a produção de ROS a nível mitocondrial através de múltiplos mecanismos, incluindo a inibição da biogênese mitocondrial e de piruvato vaivém na mitocôndria, a redução da atividade mitocondrial devido à utilização melhorada da glicólise e activação de autofagia mitocondrial [29], [30], [47], [48]. Anteriormente, estabelecemos uma ligação funcional entre a redução controlada pelo HIF-1α de ROS e independência de ancoragem das células cancerosas gástricas [22], implicando HIF-1α na patogênese do câncer gástrico na ausência de hipóxia. Nós descobrimos agora que a capacitiy de HIF-1α para restringir a produção de ROS das células cancerosas gástricas também confere resistência a agentes quimioterápicos que funcionam através da activação de p53 (Figura 6E). Curiosamente, os efeitos de aumento da resistência a terapia através da modulação de p53 e ROS também têm sido relatados para a HIF-2α [49]. As isoformas de HIF-alfa 1 e 2 mostram uma grande sobreposição em alvos putativos HIF e ligação a elementos de resposta hipóxica e atribuição definitiva dos efeitos induzidos pela hipóxia para qualquer isoforma nem sempre é realizável [50]. Bertout

et al.

Demonstrado que a inibição HIF-2α aumenta a apoptose induzida por radiação via acumulação de ROS e subsequente aumento da actividade p53 [49]. Além disso, Roberts

et ai.

Mostraram que a resistência contra a quimioterapia é parcialmente mediada pela supressão de HIF-2α-mediada de p53 em células de carcinoma de células renais [51]. Assim, as observações relatadas doravante levadas justificar investigações sobre o papel potencial da HIF-2α, uma tarefa que está actualmente em curso em nosso laboratório.

Tendo em vista a necessidade clínica para identificar preditores de resposta para as opções de tratamento disponíveis, o nosso