Abstract

câncer do trato biliar (BTC) é muitas vezes difícil de diagnosticar definitivamente , mesmo através de exame histológico. Os microRNAs (miRNAs) regular uma variedade de processos fisiológicos. Nos últimos anos, tem sido sugerido que os perfis para a transmissão miARNs, bem como aquelas para miARNs tecido, tem o potencial para ser utilizados como biomarcadores de diagnóstico para o cancro. O objetivo deste estudo foi o de confirmar a existência de miRNAs na bílis humana e para avaliar o seu potencial como biomarcadores clínicos para BTC. Foram amostrados bile de pacientes que foram submetidos a drenagem biliar para doenças biliares, tais como BTC e coledocolitíase. miARN detecção baseada em PCR e clonagem foram realizadas miARN para identificar miARNs biliares. Usando em tempo real microarrays miRNA alto rendimento baseados em PCR, os perfis de 667 miRNAs expressão foram comparados em pacientes com doença maligna (

n

= 9) e os pacientes da mesma idade com a coledocolitíase doença benigna (

n

= 9). A seguir, foi caracterizado miARNs biliares, em termos de estabilidade e de localização. Através da clonagem e utilização de métodos de PCR, que confirmou que existe miRNAs na bile. análise diferencial de miARNs biliares demonstraram que 10 dos 667 miARNs foram significativamente mais altamente expressa no grupo maligno do que no grupo benigna a

P

0,0005. Definir o limite especificidade de 100% mostrou que alguns miRNAs (

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

e

miR- 222 *

) tinha um nível de sensibilidade de 88,9%, e análise característica operacional do receptor demonstrou que

miR-9 Comprar e

miR-145 *

podem ser marcadores de diagnóstico úteis para BTC. Além disso, verificou-se a estabilidade a longo prazo dos miRNAs na bile, uma característica que os torna adequados para uso em diagnóstico em ambientes clínicos. Nós também confirmou que miRNAs biliares são localizada no epitélio biliar maligna /benigna. Estes achados sugerem que miRNAs biliares poderia ser biomarcadores informativos para doenças hepatobiliares e que alguns miRNAs, particularmente

miR

-9, pode ser útil no diagnóstico e manejo clínico de BTC

Citation:. Shigehara K, Yokomuro S, S Ishibashi, Mizuguchi Y, Y Arima, Kawahigashi Y, et al. (2011) Real-Time PCR-Based Análise da Human Bile MicroRNAome Identifica

miR-9

como um biomarcador de diagnóstico Potencial para biliar câncer do trato. PLoS ONE 6 (8): e23584. doi: 10.1371 /journal.pone.0023584

editor: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Itália |

Recebido: 28 Dezembro, 2010; Aceito: 21 de julho de 2011; Publicação: 17 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Shigehara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid e do Projeto “Núcleo de Investigação” para a Universidade privada: Subvenção Fundo Matching (S0801034) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, no Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Entre as neoplasias malignas hepatobiliares, câncer do trato biliar (BTC), que inclui o câncer cholangiocarcinoma e vesícula biliar intra e extra-hepática [1], está aumentando na incidência. BTC surge a partir do epitélio do tracto biliar e frequentemente provoca constrição ou obstrução do ducto biliar [2]. Uma consequência desta obstrução é a retenção de bile, o que leva a icterícia. Pacientes com suspeita de sofrerem BTC e que apresentem sintomas clínicos, tais como icterícia normalmente são examinadas utilizando técnicas de diagnóstico por imagem, incluindo ultra-sonografia, tomografia computadorizada (TC) e colangiopancreatografia por ressonância magnética (CPRM). No entanto, estas técnicas têm sensibilidade limitada para a detecção da BTC [3], e estabelecer um diagnóstico preciso de cancro na prática clínica é muitas vezes difícil, porque muitas doenças benignas apresentam sintomas semelhantes. O resultado é muitas vezes um diagnóstico tardio da BTC [4]. A detecção precoce do BTC é fundamental para o resultado do paciente, porque a) BTC está associada com mau prognóstico [4]; b) caracteriza-se pela falta de resposta /resposta fraca à quimioterapia e radioterapia; e c) o único tratamento curativo é a ressecção cirúrgica [5], [6]. pacientes BTC frequentemente submetido a uma cirurgia antes de sua condição foi definitivamente determinado a ser maligno [7]. Assim, a melhoria na precisão do diagnóstico para BTC é necessária, particularmente à luz da crescente incidência global da doença. Durante os últimos 10 anos, um progresso considerável tem sido feito na compreensão da patogenia da BTC, e vários genes e proteínas que contribuem para os mecanismos moleculares de carcinogénese do trato biliar, foram identificados [8], [9], [10], [11 ], [12].

Os microRNAs (miRNAs) são endogenamente expressa, short, não codificante RNAs 18-25 nucleótidos de comprimento que reprimem a tradução da proteína através da ligação ao alvo mRNAs. No campo do cancro, um número de estudos foram realizados em miARNs de tecido, num esforço para elucidar os mecanismos da doença e melhorar indicadores de diagnóstico e prognóstico de corrente [13], [14], [15]. Recentemente, os estudos sobre a utilidade de miARNs de componentes extracelulares, nomeadamente soro e plasma, tem sido relatada [16], [17], [18]. Por exemplo, tem sido mostrado que miARNs circulantes associados a placenta correlacionam-se com a evolução da gravidez [16]. Cogswell

et al.

Recuperado miRNAs de líquido cefalorraquidiano e descobriu miRNA específica para a doença de Alzheimer muda de acordo com o seu papel como potenciais biomarcadores para a doença [19]. Melkonyan

et al.

Detectada uma variedade de miRNAs na urina, incluindo alguns excretada transrenally, e propôs novas possibilidades de diagnóstico para análise de ácidos nucléicos transrenal [20]. Em outros lugares, Michael

et al.

Extraído miRNAs de exossomos obtidos a partir da saliva de controles saudáveis ​​e um paciente com síndrome de Sjögren [21]. No contexto do cancro, miARN no soro de pacientes com cancro da mama e linfoma difuso de grandes células B foram mostrados para ser estável e altamente preditivo de malignidade e sobrevivência [17], [18]. Estes relatórios sugerem um papel significativo para miARNs extracelulares, em adição aos dos miARNs tecido, na regulação de vários processos fisiológicos. Como este campo se desenvolve, estes miRNAs podem se tornar alvos diagnósticos e terapêuticos em situações clinicamente relevantes. Estes relatórios nos promovido a especular que miRNAs podem estar presentes e estável na bílis humana, assim como eles estão em outros fluidos corporais, e que os miRNAs transmitidas por biliares poderia ser usado como novos biomarcadores para BTC.

Os principais componentes de bílis humana são ácidos biliares, colesterol, bilirrubina, bicarbonatos, electrólitos, e água. A bílis é produzido por hepatócitos no fígado e flui através do canal biliar para o duodeno, onde auxilia na digestão de lípidos e absorção de [22]. Como sangue, bílis podem ser coletadas de pacientes que se submetem a drenagem biliar diagnóstica e /ou terapêutica. Por conseguinte, pode-se entender a utilidade de um biomarcador BTC na bílis e /ou soro. Um biomarcador bile poderia agilizar o diagnóstico da BTC solicitando novos exames histológicos, tais como a citologia bile, citologia escova, e uma pinça de biópsia do ducto biliar.

Neste estudo, primeiro determinar se existem miRNAs e pode ser detectado na bílis humana por sequenciação pequena biblioteca de ARN. Em seguida, determinou-se a expressão de miRNAs específicos na bile é diferente entre pacientes com câncer e aqueles sem câncer utilizando microarrays de expressão miRNA de alto rendimento em tempo real baseados em PCR. Finalmente, avaliamos o potencial dos miRNAs biliares como novos biomarcadores para BTC.

Materiais e Métodos

coleção Bile

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Seres Humanos da Nippon Medical School e Comitê de Ética em Pesquisa da Nippon Medical School. Pacientes que assinaram um formulário de consentimento informado foram incluídos neste estudo. amostras biliares foram coletados de 18 pacientes que sofrem de doença biliar (incluindo BTC e coledocolitíase) que realizou drenagem de bile de diagnóstico e /ou terapêutico via cholangiodrainage percutânea trans, trans biliar drenagem vesical percutânea, ou drenagem nasobiliary endoscópica. Nove pacientes foram diagnosticados histologicamente com adenocarcinoma (sete com colangiocarcinoma e dois com câncer de vesícula biliar). Foram incluídos nove pacientes do grupo controle pareados por idade com diagnóstico de coledocolitíase sem malignidade atual ou anterior ou uma condição inflamatória (Tabela 1).

O processamento da amostra e RNA extração

RNA foi extraído de 5 ml de bílis a partir de cada indivíduo no mesmo dia como a recolha. A fracção de ácido nucleico que foi obtido por extracção em fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) seguido de precipitação com etanol (-80 ° C durante 30 min). O ARN total foi obtido usando RNAiso Além disso (Takara Bio, Tóquio, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras de RNA extraídas foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

-PCR em tempo real

O ARN total foi transcrito reverso utilizando iniciadores não específicos /primers específicos para cada ARNm /miARN, respectivamente . Triplicatas do cDNA resultante foram submetidos a PCR em tempo real utilizando iniciadores TaqMan miRNA /sondas (Applied Biosystems, Tóquio, Japão) com um Real-Time PCR System 7300 (Applied Biosystems).

RNA pequeno biblioteca de sequenciamento de miRNAs biliares

métodos de clonagem miRNA são descritos no nosso relatório anterior [23]. Resumidamente, as amostras de RNA total foram extraídos a partir biliar usando RNAiso Além disso (Takara Bio) (ver acima) e separado num gel de poliacrilamida desnaturante. A fração de 18-24 nt foi então recuperado. Em seguida, 5′- e 3′-adaptadores foram ligados ao ARN, e PCR em tempo real foi levado a cabo. A amplificação dos fragmentos de ADNc foi conseguida por meio de dois ciclos consecutivos de PCR. Específico digestão com enzimas de restrição dos adaptadores permitidos para concatemerization do ADNc em fragmentos maiores. Estes fragmentos foram então clonados num vector para criar uma biblioteca de ADNc. Concatemerization aumenta os comprimentos das sequências informativos que podem ser obtidos a partir de cada clone. As sequências de ARN pequenas foram analisadas quanto homologia com miARNs conhecidos. Anotação dos miRNAs foi realizada utilizando o miRBase (última versão) função de análise de homologia.

miRNA expressão baseada em PCR em tempo real de perfil

Total de miRNA (350 ng) foi reverso transcrito usando Megaplex RT Primers (Applied Biosystems). Os ADNc resultantes foram pré-amplificado utilizando iniciadores pré-amplificador Megaplex (Applied Biosystems) e os produtos pré-amplificado aplicado a uma matriz de TaqMan MicroRNA humano Painel (A e B, v2.0). PCR em tempo real foi realizado utilizando um rápido sistema de tempo real 7900HT (Applied Biosystems). Os dados de PCR em tempo real obtidos utilizando o Painel de MicroRNA TaqMan foram analisados ​​com o software da Applied Biosystems (SDS ver. 2.3 e RQ gerente de ver. 1.2). Os níveis de expressão para miARNs paciente M9 (ver Tabela 1) foram ajustados para 1,0. miARNs cuja expressão não foi detectável em M9 paciente (ver Tabela 1) foram excluídos de análises posteriores. Para a quantificação, foi aplicado o método CT relativa (método ΔΔCT). U6 foi usada como um controlo interno. Para todos os 18 pacientes, este ensaio foi realizado utilizando os Painéis A e B. Foi determinado o ponto de corte para a significância utilizando um parâmetro de ajuste de delta, escolhidas na base de uma taxa de falsos positivos de zero. Os dados da matriz foram utilizados para construir curvas de receiver operating characteristic (ROC), traçando as relações entre os verdadeiros positivos (sensibilidade) e falsos positivos (1 – especificidade). A área sob a curva (AUC), uma medida de precisão discriminação, também foi calculada.

miRNA ensaio de estabilidade

Para avaliar a estabilidade dos miRNAs endógenos em bile, medimos níveis de miRNA na bílis a partir de três indivíduos que tinha sido incubada à temperatura ambiente durante 0 a 24 h. Resumidamente, 5 ml de cada amostra foi incubada biliar, e miARNs foram extraídas e purificadas nos pontos de tempo regulares usando o método descrito acima. As amostras de ARN foram então sujeitos a transcrição reversa e sujeitos a PCR em tempo real. Para medir a estabilidade de miARN exógeno, um material sintético

Caenorhabditis elegans

miARN (

CEL-miR-39

) foi adicionado a cada amostra de bílis no início do período de incubação (0 h) e submetido aos mesmos processos de extracção e quantificação. Para normalizar os dados, o sintético

C. elegans

miARN

CEL-miR-238

foi adicionada à fracção de ácido nucleico imediatamente antes da transcrição reversa para servir como um controlo interno na PCR em tempo real.

Bile fraccionamento

bílis é relatado para ser fraccionado em quatro componentes pelo aumento tanto da força centrífuga e a duração de centrifugação [24]. Para avaliar biliar miARN localização, que fraccionado amostras de 12 ml de bílis a partir de três indivíduos por centrifugação diferencial [25] e em relação ao nível dos miARNs em cada fracção (Fig. 1) expressão. Relativamente grandes componentes, tais como células inteiras, núcleos, e citoesqueleto celular sedimentar a uma

baixa velocidade (1000 ×

g

durante 10 min). Pastilhas contendo mitocôndrias, lisossomos e peroxissomos foram obtidos em um

velocidade média

(20.000 ×

g Compra de 20 min) e microssomas e pequenas vesículas no

alta velocidade

( 80.000 ×

g Compra de 1 h). Finalmente, os menores componentes (por exemplo, ribossomas, vírus e grandes macromoléculas) foram coletados em um

velocidade muito alta

com um longo período de centrifugação (150.000 ×

g Compra de 3 h) ( Figura 1). O ARN foi extraído de cada pellet utilizando RNAiso Além disso (Takara Bio), de acordo com o protocolo do fabricante, e a expressão de alguns miARNs arbitrariamente seleccionados foi medida por PCR em tempo real como descrito acima. O nível de expressão do mRNA que codifica o marcador citoqueratina 7 epitelial biliar (CK-7) também foi medida para verificar se o fraccionamento foi realizado adequadamente [26], [27], [28], [29].

bílis humana foi submetido a centrifugação repetida a velocidades mais elevadas progressivamente para separar as células e organelas. As condições de centrifugação (gravidade e do tempo) foram as seguintes: velocidade baixa, 1000 × g durante 10 min; velocidade média, de 20.000 × g durante 20 min; alta velocidade, 80.000 × g durante 1 h; velocidade muito alta, 150.000 × g durante 3 h.

Resultados

A confirmação da existência de miRNAs em bile

humana

Até agora, não houve nenhum relatório na presença de miARNs na bílis. A nossa primeira prioridade foi determinar se existe miRNAs na bile e, em caso afirmativo, para identificá-los. PCR em tempo real com iniciadores /sondas específicas demonstrado que

miR-21

estava presente na bílis (Fig. 2A). Usando bile como o material de origem, pequena biblioteca RNA sequenciamento verificada a presença de vários miRNAs, com

let-7b

ser o mais freqüentemente clonado (Fig. 2B e 2C). Estes resultados mostraram que miARNs estão presentes na bílis e que a bile é um material biológico atraente para análise miARN.

(A) de detecção de miARN baseada em PCR em tempo real de

miR-21

. MiARN TaqMan-PCR em tempo real usando uma sonda /iniciadores específicos para

miR-21

foi realizado em três amostras biliares e uma amostra de controlo não-molde (NC). Note-se a falta de um produto de PCR no controlo negativo (CN). (B) cromatograma representativo dos resultados de sequenciação após a clonagem de miARN biliares. As barras horizontais indicam acima do cromatograma cada miARN e ligante (ver Materiais e Métodos). (C) Tabela mostrando os miRNAs identificados a partir de clonagem, a sua frequência relativa, e se eles foram clonados a partir BTC ou casos benignos.

alto rendimento e quantitativa perfil de expressão microRNA de bile de pacientes com vias biliares cancer

Para identificar miRNAs biliares que são expressos de maneira aberrante em doenças do trato biliar, especialmente cânceres do trato biliar, foram analisadas amostras biliares de todos os 18 pacientes por expressão miRNA baseada em PCR em tempo real de perfil (Fig. 3A e Tabela S1 ). A quantificação relativa dos dados mostrou que 335 dos 667 miARNs foram significativamente mais altamente expressa no grupo maligno do que no grupo benigna (

P

0,05) (Fig. 3A e Tabela S1). Destes, destacamos 10 miRNAs (

miR-9

,

miR-145 *

,

miR-105

,

miR-147b

,

deixe-7F-2 *

,

deixe-7i *

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

,

miR -222 * Comprar e

miR-942

) cuja expressão foi significativamente maior em

P

. 0,0005 (Fig 3A). Definir o limite especificidade de 100% [17], [30] mostrou que

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

e

miR-222 *

tinha um nível de sensibilidade de 88,9%, indicando que estes miRNAs podem servir como marcadores biológicos para o cancro do tracto biliar (Fig. 3B). O nível de sensibilidade para

miR-145 *

,

miR-105

, e

miR-942

foi de 77,8% e que, para

miR-147b

,

deixe-7F-2 *

, e

deixe-7i *

foi de 66,7% (Fig. 3B). Além disso, a área sob a curva de ROC-análise mostrou que

miR-9

e

miR-145 *

poderia ser excelentes marcadores de diagnóstico para BTC (Fig. 3C). Tomados em conjunto, nossos dados mostram que miRNAs biliares, nomeadamente

miR-9

, têm o potencial para serem utilizados como indicadores de diagnóstico para cânceres do trato biliar.

(A) mapa miRNA expressão de calor, com miRNAs classificadas de acordo com sua

P

-Valores. As amostras são mostrados em linhas e em colunas miARNs. expressão miARN no paciente M9 (ver Tabela 1) foi ajustado para 1,0. Os resultados completos microarrays podem ser encontradas nas informações complementares. parcela (B) Ponto mostrando os níveis de expressão dos 10 miARNs que eram significativamente mais altamente expressa no grupo maligno do que no grupo benigna (

P

0,0005). O eixo vertical mostra os valores logarítmica quantificação relativa obtidos num ensaio de TaqMan matriz. Definir o limite especificidade de 100% mostraram o nível de sensibilidade para ser 88,9% para

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

e

miR-222 *

; 77,8% no

miR-145 *

,

miR-105

, e

miR-942

; e 66,7% no

miR-147b,

deixe-7F-2 *

, e

deixe-7i *

. ○, o valor mediano. A análise da curva (C) ROC. O perfil de expressão para cada miARN foi usada como a entrada para a análise receiver operating characteristic (ROC). A curva ROC mostra a sensibilidade versus 1 – especificidade. A área sob a curva (AUC), uma medida de precisão discriminação, também foi calculada.

Caracterização de miRNAs biliares

Para miRNAs biliares para ser usado para diagnóstico em um ambiente clínico, eles devem ser estáveis. Dada a sua natureza de degradação, que é importante para determinar quanto tempo a integridade de miARN pode ser mantida na bílis. Como mostrado na Fig. 4, que confirmou que os miRNAs biliares endógenos

miR-21

,

deixe-7c

, e

miR-9

mantiveram-se estáveis ​​na bile e que seus níveis de expressão manteve-se elevada , especialmente no prazo de 4 horas de incubação de 24 horas. No entanto, a exógena miRNA

cel-miR-238

foi imediatamente degradado quando adicionado aos três amostras biliares individuais (ver Materiais e Métodos). Estas observações sugerem que miARNs biliares endógenos estão numa forma estável, que pode resistir a condições desfavoráveis, tais como a actividade de ARNase potente e a acidez forte, que causam miARNs exógenos a ser degradada. Além disso, as análises de fraccionamento demonstrou que, para todas as três amostras testadas, todas as miARNs, incluindo

miR-9

, foram detectados no componente contendo células epiteliais biliares, núcleos, e citoesqueleto, indicando que miARNs biliares residir principalmente dentro células e núcleos. (Fig. 5).

Os miRNAs biliares humanos endógenos

hsa-miR-21

,

HSA-deixou-7c

, e

hsa-miR-9 Quais são relativamente estáveis. Em contraste, o sintético exógeno miARN

CEL-miR-39

foi rapidamente degradada quando adicionado a bílis.

Os níveis de ARNm e miARNs em cada fracção foram calculados a partir dos resultados reais de -tempo de PCR e o volume de RNA total para comparar a quantidade absoluta simplificado em cada componente. (A) de ARNm que codifica o marcador de CK epitélio biliar 7 foi detectada predominantemente no componente subcelular, que inclui células completas, os núcleos, e citoesqueleto celular. (B) O miRNAs

miR-21

,

miR-9

, e

RNU6B

mostraram um padrão semelhante, indicando que a maioria dos miRNAs na bile foram derivadas de células epiteliais das vias biliares . As fracções foram obtidas através de baixa velocidade (1), forma-velocidade (2), de alta velocidade (3); e muito centrifugação de alta velocidade (4).

Discussão

Aqui, nós relatamos sobre a presença e estabilidade de miRNAs biliares, os seus níveis de expressão relativa, medida pelo high-throughput PCR em tempo real, e as diferenças nos perfis de miARN entre amostras biliares a partir de doentes com doença do tracto biliar benigno e maligno. Depois de confirmar a existência de miRNAs em bile usando primers específicos de miRNA, foi realizada uma análise mais abrangente usando microarrays miRNA, o que nos permitiu testar a presença de 667 espécies de miRNA. Embora este seja um pequeno estudo, temos confiança de que o nosso conceito de utilização de miRNAs para distinguir doenças benignas /malignos do trato biliar será validado como mais estudos em grande escala são realizadas no futuro. Além de propor a utilização de diagnóstico de miARNs biliares, desenvolvemos métodos fiáveis ​​para a extracção e avaliando miARNs que são compatíveis com os testes clínicos. A análise comparativa dos níveis de expressão identificaram 10 miRNAs cujos níveis são diferentes entre condições benignas e malignas (

P Art 0,0005) (Fig. 3B). análise ROC identificou dois destes miARNs como sendo adequados para utilização como biomarcadores BTC (Fig. 3C). Notavelmente,

miR-9

mostrou especificidade diagnóstica de confiança e sensibilidade.

No contexto da biologia do câncer, expressão aberrante de

miR-9

tem sido associada com a metástase [31 ],, 33, 34 [32] [] []. O

miR-9

família é regulada [32], [33] ou reprimidos [31], [35] em vários cancros humanos. A diferença de

miR-9

expressão visto aqui pode ser semelhante à regulamentação específica para o estágio que foi demonstrada para

miR-200

em câncer de fígado [36]. No início, quando as células cancerosas se tornar invasoras e passam por transição epitelial-mesenquimal,

miR-200

é regulada negativamente, mas mais tarde é regulada durante a reepitelização de metástases distantes quando as células sofrem transição mesenquimal-epitelial [36]. O mecanismo de

miR-9

desregulação em nosso estudo permanece desconhecida, mas pode envolver metilação aberrante de é a região do promotor [31], [34], [37] ou ativação f do fator de transcrição MYC /MYCN [32 ]. Outros estudos funcionais de

miR-9

no BTC são necessários.

Nós posteriormente investigadas as características bioquímicas de miRNAs na bile. Plasma foi reportado para mostrar actividade de ARNase forte [38]. Mitchell

et ai.

Confirmaram esta actividade de ARNase e demonstraram que miARNs nus foram sujeitas a degradação, enquanto miARNs endógenos manteve-se estável no plasma, mesmo na presença de actividade de ARNase potente [39]. Curiosamente, observaram-se diferenças semelhantes em estabilidade entre miRNAs endógenos e exógenos na bile (Fig. 4). A estabilidade de miARNs biliares endógenos os torna adequados como biomarcadores de confiança em situações clínicas.

Como miARNs endógenos suportar as condições de desnaturação de bílis tem ainda de ser explicadas. Estudos recentes demonstraram que a maioria dos miARNs circulantes são encontrados em exossomas, que as protegem contra a degradação e são responsáveis ​​pela sua excelente estabilidade [40], [41], [42]. Exossomos são vesículas de membrana 40-100 nm de origem endocítica que contêm mRNA e miRNA. Os exossomas podem ser transferidos de uma célula para outra, e os seus componentes podem funcionar no novo ambiente. Vários miARN perfis tenham sido realizados estudos em exossomas que circulam no sangue [40], [41], [42]. Inicialmente, presume-se que a estabilidade de miARNs biliares endógenos resultou da sua presença em exossomas. No entanto, ao contrário das nossas expectativas, as experiências de fraccionamento celular revelou que a maioria dos miARNs biliares não foram encontrados em pequenas vesículas, mas em células inteiras e núcleos (fig. 5). Embora não haja evidência de que miARNs biliares têm as mesmas funções como aqueles no soro ou plasma, os resultados dos estudos de fraccionamento e a análise de PCR de CK-7 sugerem que miARNs extraídos da bílis são obtidos principalmente a partir de células epiteliais intactas ou células malignas que foram descamadas a partir do tracto biliar. Assim, miARNs endógenos permanecer estável na bílis até a degradação das células descamadas em que estão contidos. Uma vez que miRNAs são liberados a partir dessas estruturas na bile, que são susceptíveis rapidamente degradada.

Há uma necessidade real de ferramentas inovadoras para diagnosticar com precisão BTC. Actualmente, a presença de antigénio carcinoembrionário (CEA) e de hidrato de carbono 19-9 (CA 19-9) em soro de servir como um padrão para o diagnóstico clínico da BTC. Como mostrado na Tabela 1, no entanto, a sensibilidade deste teste não é tão elevada como a conseguida pela nossa análise miARN. Em oito dos nove casos BTC, os níveis séricos de CEA não aumentou, embora o câncer estava presente. Além disso, o soro CA-19-9 só níveis foram aumentados em certos doentes, provavelmente por causa da colestase. técnicas imaginando diagnóstico, como ultrassonografia endoscópica (EUS) e ultra-sonografia intraductal são usados ​​quando BTC é suspeita. EUS permite uma boa visão da árvore biliar extra-hepática distal, vesícula biliar, linfonodos regionais e vasculatura [5]. Rösch

et al.

Comparou a precisão do diagnóstico de colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE), MRCP, CT, e EUS em 50 pacientes com estenose biliar. A sensibilidade /especificidade do diagnóstico de malignidade foi de 85% /75% para CPRE, 85% /71% para MRCP, 77% /63% para CT, e 79% /62% para EUS [43]. Em um estudo prospectivo de pacientes com suspeita cholangiocarcinoma, EUS tinha uma sensibilidade diagnóstica de 79% e uma especificidade de 62% [44]. Além disso, em uma recente meta-análise, EUS teve uma sensibilidade de 78% e uma especificidade de 84% [45]. ultra-sonografia Intraductal com guiado por fio, fino calibre, sondas de alta frequência é realizada durante a CPRE, e em estudos anteriores mostraram taxas de precisão para distinguir estenoses benignas e malignas de 76-90% [46], [47], [48]. Além das técnicas de imagiologia, tais como métodos histológicos citologia biliar, citologia da escova, e uma pinça de biópsia são obrigatórios para o diagnóstico definitivo. citologia bile e citologia têm apenas taxas de precisão modestos para determinar malignidade, variando de 30 a 70% na maioria dos estudos publicados [5], [49], [50], [51], [52], [53]. Pinça de biópsia, a qual tem uma taxa de precisão mais elevado do que os outros testes histológicos (43 a 81%), não é amplamente utilizada porque requer um dispositivo especializado e técnica [54], [55], [56]. Da mesma forma, a agulha fina biópsia mais especializado guiada por EUS aspiração, com uma sensibilidade diagnóstica de 43 a 86% de estenose biliar [7], [57], [58], [59], [60], [61], atualmente só é usado para tumores pancreáticos e estenose do ducto biliar inferior e não foi aprovado para uso em outras condições. A baixa precisão do diagnóstico de alguns dos testes actualmente utilizados confirma que BTC pode ser difícil de diagnosticar. Em vista do prognóstico pobre para BTC [4], que é desejável para melhorar a facilidade e precisão de teste. Os resultados da nossa investigação indicam que a medição miRNAs biliares podem melhorar a velocidade ea precisão do diagnóstico BTC. Além disso, a análise de bile é viável porque miRNAs biliares são estáveis ​​e podem ser facilmente extraídos e analisados ​​em ambientes clínicos.

Investigações adicionais com maior número de pacientes e diferentes populações de estudo, bem como estudos de apresentação diferencial entre BTC e pré doenças -malignant tais como colangite esclerosante primária são necessários para alcançar aceitação clínica. No entanto, os nossos resultados demonstram que a medição dos níveis de miARN biliares é uma abordagem prática para auxiliar a avaliação da BTC e é comparável a muitos métodos de diagnóstico correntes, incluindo a citologia. Concluímos, portanto, que a medida de expressão miRNA na bile seria útil na distinção entre condições benignas e malignas, especialmente nos casos que permanecem sem diagnóstico. Notavelmente, bile

miR-9

tem um forte potencial para uso como um marcador clínico de cânceres do trato biliar.

Informações de Apoio

Tabela S1.

níveis de expressão do miARNs na bílis. Um mapa de calor foi construído utilizando os dados das micromatrizes de miARN usados ​​para analisar amostras de bílis a partir de pacientes com doenças malignas e benignas. expressão miARN no paciente M9 (ver Tabela 1) foi ajustado para 1,0. B, análise de biliares de um paciente com doença benigna; M, a análise da bílis de um paciente com doença maligna

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023584.s001

(XLSX)

Reconhecimentos

Agradecemos Takuji Kosuge e Yoshimi Hinohara por sua assistência técnica especializada.