PLOS ONE: Icaritin Causas ERK1 Sustentada /2 Activação e induz a apoptose em Human Cancer Endometrial Cells

Abstract

Icaritin, um composto de

Epimedium Genus

, tem receptor de estrogénio selectivo (ER) modulando actividades, e possuem actividade anti-tumoral. Aqui, nós examinamos efeito icaritin no crescimento celular das células cancerosas Hec1A endométrio humano e descobriram que icaritin proliferação inibiu potencialmente de células Hec1A. Icaritin-inibiu o crescimento celular foi associado com o aumento dos níveis de p21 e p27 e expressão reduzida cyclinD1 e CDK 4 expressão. Icaritin também induziu apoptose de células acompanhado por activação de caspases como evidenciado pela clivagem do substrato endógeno poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e a libertação do citocromo c, que foi anulada pela pré-tratamento com o inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk. tratamento Icaritin também induziu expressão de proteína pro-apoptótica Bax com uma diminuição concomitante da expressão de Bcl-2. fosforilação sustentada Além disso, induzida icaritin de extracelular regulada por sinal kinase1 /2 (MAPK /ERK1 /2) em células Hec1A e U0126, uma quinase da MAP-cinase específica (/2 MEK1) inibidor, bloqueou a activação de ERK1 /2 por icaritin e aboliu a inibição do crescimento induzida por icaritin e apoptose. Nossos resultados demonstraram que icaritin induzida sustentado ERK 1/2 ativação e inibiu o crescimento de células de câncer endometrial Hec1A, e forneceu um racional para a avaliação pré-clínica e clínica de icaritin para a terapia do cancro endometrial

Citation:. Tong JS, Zhang QH , Huang X, Fu XQ, Qi ST, Wang YP, et ai. (2011) Icaritin Causas Sustentada ERK1 /2 Activation e induz a apoptose em células de cancro do endométrio humano. PLoS ONE 6 (3): e16781. doi: 10.1371 /journal.pone.0016781

editor: Syed Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 08 de dezembro de 2010; Aceito: 14 de janeiro de 2011; Publicação: 08 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Tong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa básica do Estado Maior da China para QY Sun (2011CB94451). Este trabalho também foi apoiado pelo DK070016 concessão NIH para Z.Y. Wang e do tabaco liquidação Biomedical Research Prêmios Nebraska do Programa (LB-595 e LB692) para Z.Y. Wang. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial é uma das neoplasias pélvicos femininos mais comuns e é o quarto tipo de câncer mais comum em mulheres norte-americanas por trás de pulmão, mama e cancro do cólon, com 42,160 novos casos e 7.780 mortes estimadas para 2009 [ ,,,0],1], [2], [3]. Cerca de 81.500 mulheres são afetadas todos os anos na União Europeia e a incidência está a aumentar. A idade média de ocorrência é 63 anos, enquanto o 90% das mulheres são mais de 50 anos [4]. Embora os pacientes diagnosticados e tratados para o estágio da doença no início da histologia endometrioid desfrutar relativamente boas taxas de sobrevivência, doentes com doença avançada (estágios III ou IV, de acordo com o novo sistema revisto pela Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia [FIGO]) ou recorrente cancro do endométrio têm um mau prognóstico [5]. Para aquelas mulheres com doença em estágio precoce, a cirurgia com o uso individualizado do volume dirigido a radioterapia é curativa [6]. Para aquelas mulheres com doença em estágio avançado, não existe um padrão real do cuidado e, tradicionalmente, estas mulheres são tratadas com cirurgia, quimioterapia e radiação, em uma ou mais combinações. Na definição de doença avançada ou recorrente, especialmente quando não é passível de ressecção cirúrgica, a marca de terapia tem sido quimioterapia [7]. Embora muitos pacientes inicialmente respondem à quimioterapia, a resistência do tumor e, eventualmente, desenvolver recaída [5]. Assim, é urgente desenvolver novos agentes terapêuticos para tratar eficazmente esta doença mortal.

Icaritin (Fig. 1A) é um produto hidrolítico de icariin de

Epimedium

, a fitoterapia chinesa tradicional. Icaritin exibe diversas actividades farmacológicas e biológicas, tais como a estimulação de natureza neuronal e diferenciação cardíaca [8], [9], o aumento da osteoblástica e suprimiu diferenciação osteoclástica e actividade de [10], a prevenção da osteonecrose associada-esteróide [11], a inibição da humano carcinoma da próstata PC-3 de crescimento de células [12], a indução das células do músculo liso prostático humano apoptose através de ERK1 via 2 /[13], e os efeitos neuroprotectores [14]. Anteriormente, foi relatado que icaritin exibe atividade semelhante ao estrogênio no câncer de mama células MCF-7 receptor de estrogênio positivo em concentrações sub-micromolar [15]. Na gama micromolar, no entanto, icaritin inibiu o crescimento de células PC-3 de cancro da próstata [12]. Estes resultados indicaram que icaritin tem ambos agonistas e antagonistas de actividades em função da concentração e pode funcionar como um modulador do receptor de estrogénio para regular o crescimento celular. No entanto, não há relatos sobre a atividade de icaritin contra o cancro endometrial.

(A) A estrutura química do icaritin. (B) Efeitos de icaritin sobre a inibição do crescimento de células Hec1A. As células foram mantidas em meio isento de fenol-vermelho com 2,5% de soro fetal despojado com carvão durante 24 h, e, em seguida, tratado com a concentração indicada de icaritin. As células foram colhidas em diferentes pontos de tempo como o potencial indicada e a proliferação foi avaliada por ensaio MTT. Resultados de oito experimentos independentes foram em média e média ± SEM. *,

P

. 0,05 em comparação com células controlar

proteína Mitógeno-ativado (MAP) quinases participar em diversas funções celulares, como a proliferação celular, diferenciação celular, motilidade celular, e a morte das células [16]. Existem três subgrupos principais: da família de MAPK regulada por sinal kinase1 /2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal extracelular de proteínas activadas pelo stress kinases1 /2 (JNK1 /2) e a proteína-quinases p38. As cascatas de sinalização que envolvem a JNK e p38, activada por sinais extracelulares de stress, estão envolvidos na diferenciação celular e apoptose [17], [18]. Estudos anteriores têm demonstrado que a activação transiente de ERK1 /2 desempenha um papel essencial na proliferação celular e que sustentada a activação de ERK1 /2 induz a paragem do ciclo celular e diferenciação [19], [20]. No presente estudo, demonstramos aqui que a ativação de ERK1 /2 via de sinalização medeia a apoptose de células Hec1A icaritin-induzido.

No presente estudo, descobrimos que icaritin desencadeou uma mediada por mitocôndria Hec1A apoptose das células e sustentada activação da MAPK /ERK1 via 2 /. Nossos resultados sugerem que icaritin pode ser útil como um agente anticancerígeno na terapia do cancro endometrial.

Resultados

Icaritin inibe o crescimento do câncer de endométrio células Hec1A

icaritin Anteriormente, foi relatado crescimento inibiu potencialmente de células PC-3 de cancro da próstata, células de câncer de mama e células de hepatoma HepG2 [12], [15], [21]. Decidimos para examinar o efeito de icaritin sobre o crescimento de células Hec1A endometriais. As células foram tratadas com várias concentrações de icaritin durante 12 h, 24 h e 48 h, e o crescimento celular foi medida com o ensaio MTT. Verificou-se que houve uma redução dependente da dose e dependente do tempo do crescimento das células tratadas com Hec1A icaritin (Fig. 1B), o que indica que icaritin inibe a proliferação de células Hec1A.

para sondar o mecanismo subjacente icaritin paragem do ciclo celular induzida, foram examinados os principais reguladores em fase G1, tal como a ciclina D1 /CDK4 e inibidores de quinase dependente de ciclina WAF1 /p21 e KIP1 /p27. Como mostrado na Fig. 2A, icaritin tratamento resultou numa diminuição marcada dos níveis de ciclina D1 e CDK4 e aumento de WAF1 /p21 e expressão KIP1 /p27 em comparação com as células tratadas com veículo (Fig. 2B) de expressão. Estes dados indicaram que icaritin foi capaz de induzir a paragem do ciclo celular e para regular efectores relacionadas com o ciclo.

células Hec1A (A) foram tratados com a concentração indicada de icaritin durante 24 h. Os níveis de ciclina D1 e CDK4 foram determinados por Western blot. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controlos. células (B) Hec1A foram tratados com a concentração indicada de icaritin durante 24 h. Os níveis de p21 e p27 foram determinados por Western blot. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controles.

Icaritin induz as células Hec1A apoptose

Nós próximo teste se icaritin também induz a morte celular por apoptose em células de cancro endometrial Hec1A humanos. Hec1A células foram tratadas com icaritin e a apoptose foi determinada por dois métodos diferentes. Como mostrado na Fig. 3A, o número de células positivas TUNEL-aumentou com o aumento das concentrações de icaritin. fragmentação nucleossoma, um indicador de apoptose, determinada com o ELISA celular Detecção de Morte confirmaram ainda que icaritin induzida apoptose celular numa dose e forma dependente do tempo (Fig. 3B). Além disso, uma coloração de anexina V-icaritin também demonstraram que induzida morte celular por apoptose, mas não em células de necrose Hec1A (Fig. 3C).

(a) Visualização de células apoptóticas pelo ensaio de TUNEL de células Hec1A. fragmentação (B) DNA foi avaliada usando um celular kit ELISA de Detecção de Morte. Os dados são expressos como média ± SEM de três experiências separadas. *,

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0,05 em comparação com células de controlo. (C) O estado apoptótico foi determinado pelo método de coloração de anexina V /PI. Percentagens de negativo células (viáveis), células de anexina V-positivas (precoce de apoptose), as células PI-positivos (necróticas) ou anexina V e PI duplo positivo células (final apoptóticos) foram mostrados (média de três experiências independentes) por um a análise de citometria de fluxo.

dose e os efeitos dependentes do tempo de icaritin sobre a activação proteolítica da caspase-3 e caspase-9 também foram examinados. Como mostrado na Fig. 4A, o tratamento icaritin resultou num aumento significativo na forma activa da caspase-3 e caspase-9 em células Hec1A. A activação de caspases em células tratadas icaritin Hec1A foi ainda confirmada por detecção da clivagem de PARP, um substrato endógeno da caspase-3 activada e uma característica da apoptose. Como mostrado na Fig. 4B, o tratamento de células com Hec1A icaritin resultou na clivagem da PARP para um fragmento de 85 kDa. Além disso, foi examinada a localização subcelular de citocromo c para determinar se a via de mitocôndrias está envolvida na apoptose induzida por icaritin. Imunofluorescência de citocromo c foi visualizado com um microscópio confocal de laser. Depois as células foram tratadas com 10? M icaritin durante 24 h, o padrão de coloração do citocromo c tornou-se difusa e turva (Fig. 4C), em contraste com a aparência compacta, a placa do tipo de citocromo c nas células de controlo tratados com veículo, indicando o libertação de citocromo c das mitocôndrias para o citossol nas células tratadas com icaritin.

células Hec1A (a) foram tratados com o indicado icaritin concentração ou os pontos de tempo indicados, os extractos celulares totais foram preparados e sujeitos a Western blot ensaio para medir níveis de clivada pela caspase-3 clivada e-caspase-9. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controlos. células (B) Hec1A foram tratados com o indicado icaritin concentração ou os pontos de tempo indicados, os extractos celulares totais foram preparados e submetidos a ensaio de transferência de Western utilizando anticorpos contra PARP. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controlos. células (C) Hec1A foram fixados e rotulado para citocromo c (vermelho) e DNA (azul). (D) As células foram pré-tratadas com Hec1A 10 uM de Z-VAD-fmk, durante 1 h, seguido com 10 icaritin uM durante 24 h, e fragmentação de ADN e a actividade da caspase-3 foram determinados. Os dados são expressos como média ± SEM de três experiências separadas. *,

P

0,05 em comparação com células de controlo. células (E) Hec1A foram pré-tratadas com 10 uM de Z-VAD-fmk, durante 1 h, seguido com 10 icaritin uM durante 24 h. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio Western Blot utilizando um anticorpo contra o PARP. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controlos.

Para determinar o papel da activação da caspase em apoptose induzida por icaritin, que trataram células Hec1A com o inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk (10 uM) antes do tratamento icaritin. O inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk pré-tratamento aboliu a actividade da caspase-3 e reduziu a apoptose induzida por icaritin como medido por fragmentação de nucleossomas em células Hec1A (Fig 4D . E). Estes resultados sugerem fortemente que a activação da cascata de caspase foi essencial para a apoptose induzida em células-icaritin Hec1A.

Icaritin regula a expressão de proteínas da família Bcl-2 em células Hec1A

O anti-apoptótica Bcl-2 é uma antagonista potente da via de apoptose mitocondrial iniciado por uma variedade de tensões extra e intracelulares. Decidimos testar os efeitos de icaritin sobre a expressão de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e as proteínas pró-apoptóticas Bax nas células Hec1A com a análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 5, icaritin aumento nos níveis de expressão do Bax enquanto reduzida expressão de Bcl-2 a uma dose e forma dependente do tempo, indicando que icaritin também regula os níveis das proteínas da família Bcl-2 para facilitar a expressão de morte celular por apoptose induzida por icaritin.

células Hec1A (a) foram tratados com a concentração indicada de icaritin, extractos celulares totais foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de Bcl-2 e Bax. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controlos. células (B) Hec1A foram tratados com os pontos de tempo indicados icaritin de icaritin, extractos celulares totais foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de Bcl-2 e Bax. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controles.

Icaritin induz sustentado ERK1 /2 ativação em células Hec1A

stresses celulares e estímulos induzem a apoptose celular através da ativação sustentada da MAPK vias de sinalização [22], [23]. Nós portanto, examinado a activação das MAPK ERK1 /2, JNK e p38 após o tratamento icaritin. Como mostrado na Fig. 6A, os níveis de fosforilação de ERK1 /2 foi aumentada após o tratamento icaritin, o que durar vinte e quatro horas. No entanto, não foram observadas alterações significativas de expressão e fosforilação níveis de p38 e JNK após o tratamento icaritin (Fig 6B . C). Estes resultados sugerem que a activação sustentada da MAPK /ERK está envolvida na inibição do crescimento induzida por icaritin e apoptose em células HecA1.

Hec1A células foram tratadas com o indicado icaritin concentração ou intervalo indicado, foram preparados extractos celulares totais e sujeito a ensaio de transferência de Western para medir os níveis de formas fosforiladas de ERK1 /2 (a), de JNK (B) e p38 (C). As membranas foram sondado com anticorpos contra total de ERK1 /2, JNK e p38 para a normalização.

A via de sinalização ERK1 /2 está envolvido na apoptose induzida por icaritin em Hec1A

Nós que examinou se a activação sustentada induzida por icaritin da via de sinalização de ERK1 /2 desempenha um papel na inibição do crescimento e apoptose. Como mostrado na Fig. 7A B, icaritin induzida apoptose celular foi efectivamente anulada pela U0126, um potente inibidor de MEK1 /2, mas o inibidor de p38 SB203580 e SP600125 inibidor de JNK não teve nenhum efeito, sugerindo que a activação de ERK1 /2 de sinalização está envolvido na apoptose induzida por icaritin. Da mesma forma, a ERK1 /2 inibição pelo seu inibidor específico poderia antagonizar eficazmente icaritin induzida por caspase-3 actividade (Fig. 7C). Além disso, o ensaio de mancha de Western revelou que U0126 inibida sustentada ERK1 2 activação /e clivagem de PARP em icaritin tratados (Fig. 7D), enquanto o inibidor de caspases Z-VAD-fmk não teve nenhum efeito sobre a activação induzida por icaritin de ERK1 /2 (Fig . 7E). Estes resultados demonstraram que os efeitos pró-apoptóticos em células de icaritin Hec1A são mediadas pela activação sustentada da via de ERK1 /2 de sinalização.

células Hec1A (A) foram tratados com icaritin na presença ou ausência de 10 U0126 uM, 10 uM SP600125, ou 40 uM SB203580 durante 24 h, o crescimento celular foi determinada por MTT. As barras representam a média ± SEM de três experiências separadas. *,

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0,05 comparado para o grupo tratado com icaritin. células (B) foram tratadas com Hec1A icaritin na presença ou na ausência de 10 uM U0126, 10 uM SP600125, ou 40 uM SB203580 durante 24 h, e fragmentação de ADN foi determinada. Os dados são expressos como média ± SEM de três experiências separadas. *,

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0,05 comparado células tratadas com a icaritin. (C) As células foram tratadas com Hec1A icaritin na presença ou na ausência de 10 uM U0126, 10 uM SP600125, ou 40 uM SB203580 durante 24 h, e a actividade da caspase-3 foi determinada por ensaio da caspase-Glo. Os dados são expressos como média ± SEM de três experiências separadas. *,

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0,05 comparado células tratadas com a icaritin. células (D) foram pré-tratados Hec1A ou não pré-tratadas com 10? M U0126, em seguida, adicionados com DMSO (veículo) ou icaritin 10 uM durante 12 h, 24 h, respectivamente. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de ERK1 /2. Os níveis de proteína de ERK1 /2 também foram medidos como controlos. células (E) Hec1A foram pré-tratadas ou não pré-tratadas com 10? M U0126, em seguida, adicionados com DMSO (veículo) ou icaritin 10 uM durante 12 h, 24 h, respectivamente. Os extractos de proteína foram preparados e a clivagem de PARP foi analisada com parafuso Ocidental. Os níveis de proteína de β-actina foram também medidas como controlos. As células (F) Hec1A foram pré-tratadas com ou sem Z-VAD-fmk (10 pM) foram ainda incubadas com icaritin 10 uM, durante 24 h. Os extractos de proteína foram preparados e submetidos a ensaio de Western blot para avaliar os níveis de ERK1 /2. Os níveis de proteína de ERK1 /2 também foram medidas como controles.

Discussão

Aqui, nós demonstramos que icaritin, um composto purificado a partir de erva medicinal Epimedium, induz a inibição do crescimento e da morte celular por apoptose em células de cancro do endométrio humano Hec1A a uma dose e forma dependente do tempo.

é bem estabelecido que a progressão do ciclo celular é dinamicamente e estritamente regulado por complexos contendo CDKs e ciclinas todos os quais são críticos para a progressão normal da célula ciclo e inactivação destas proteínas leva à paragem do ciclo celular [24], [25], [26]. Os efeitos inibitórios observados de icaritin na expressão de ciclina D1 e CDK4 em células Hec1A icaritin sugeriu que pode prender o ciclo celular em fases específicas. actividade de CDK também é regulado pelos inibidores de CDK, como WAF1 /p21 e famílias KIP1 /p27 de proteínas. Aqui, também mostraram que os níveis induzidos icaritin do WAF1 /p21 e KIP1 /p27 expressão.

Em muitos tipos de células, a apoptose é caracterizada por a geração de fragmentos de ADN através da acção de endonucleases endógenas [27] , [28]. O DNA das células apoptóticas é clivada em fragmentos de multímeros de 180-200 pb, correspondendo ao tamanho oligonucleosomal. Portanto, o DNA de células apoptóticas normalmente migra como uma escada de multímeros 180-200 pb num gel de agarose. O método Terminal Transferase deoxynucleotidy biotina-dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) identifica células apoptóticas in situ, utilizando transferase de desoxinucleotidilo terminal (TdT) para transferir a biotina-dUTP para estas quebras na cadeia de ADN clivado [29]. A determinação ensaio ELISA dos fragmentos citoplasmáticos associados histona-ADN (mono- e oligonucleosomes) após a morte celular induzida por [30]. Anexina V é usado para determinar quantitativamente a percentagem de células dentro de uma população que estão a sofrer apoptose activamente. Ele baseia-se na propriedade de células perdem assimetria membrana nas fases iniciais de apoptose. Em células em apoptose, a fosfatidilserina de fosfolípidos de membrana (PS) é translocada do folheto interno da membrana plasmática para o folheto exterior, expondo desse modo PS para o ambiente externo. Anexina V é uma proteína de ligação ao fosfolípido dependente do cálcio que possui uma elevada afinidade para PS, e é útil para a identificação de células apoptóticas com PS exposta. Iodeto de propídio (PI) é uma sonda padrão de viabilidade e de citometria de fluxo é utilizada para distinguir células viáveis ​​de não viáveis. As células viáveis ​​com membranas intactas excluem PI, enquanto que as membranas de células mortas ou danificadas são permeáveis ​​ao PI. As células que são consideradas viáveis ​​são anexina V e PI negativo; As células que estão em apoptose precoce são anexina V positiva e PI negativo; células que estão no final de apoptose são ambos anexina V e PI positiva; e células que estão em necrótica são anexina V e PI negativo negativo [31]. O método de coloração de anexina V /PI distingue as células de apoptose e necrose células. No presente estudo, as células foram tratadas com Hec1A icaritin e a apoptose foi analisada utilizando ensaio TUNEL e ELISA. Além disso, um ensaio de ligação de anexina V-icaritin mostraram que o tratamento induziu apoptose, mas não em células de necrose Hec1A.

mitocôndrias desempenham um papel crucial na transdução de sinal de apoptose [32]. A observação de activação mediada por icaritin de caspase-9, caspase-3, a clivagem subsequente da PARP e a libertação do citocromo c, assim como o resultado de que o inibidor da pan-caspase z-VED-FMK quase completamente bloqueada apoptose icaritin-induzida em Hec1A células, sugerindo que a via da cascata de caspases mediada por mitocondrial desempenha um papel muito importante na apoptose induzida por icaritin [33].

Bcl-2 família de proteínas, incluindo os membros da família relacionados com Bcl-2 e Bcl-2 tal como Bcl-xL, Bad e Bax, desempenha um papel importante na regulação da apoptose. Eles podem activar ou inibir a libertação de factores tais como a jusante do citocromo C, que conduz à activação da caspase-3 e PARP na execução da apoptose [34]. Bax exerce uma actividade pro-apoptótica por translocação do citosol para a mitocôndria, onde induz a libertação do citocromo c, ao passo que a Bcl-2 exerce a sua actividade anti-apoptótica, pelo menos em parte, pela inibição da translocação de Bax para a mitocôndria [35] . Obviamente, a relação entre a expressão de proteínas pro- e anti-apoptóticas, tais como Bax /Bcl-2, é crítico para a indução de apoptose, e que determina a susceptibilidade das células à apoptose [36]. No presente estudo, mostrou que o tratamento das células com Hec1A icaritin resultou na diminuição significativa da proteína Bcl-2 e o aumento na proteína Bax, deslocando, assim, o rácio de Bax /Bcl-2 em favor da apoptose. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicaram que regula os níveis de icaritin da família Bcl-2 de expressão, induz a libertação de citocromo c e trigs caspase-dependente morte apoptótica de células.

A família de MAPK, ERK, SAPK /JNK1 /2 e p38, desempenha um papel central na proliferação celular, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose, incluindo extracelular regulada kinase1 /2 [37], [38]. Em geral ERK1, transiente /2 activação ocorre rapidamente e com declínio de 30-45 minutos, que é considerada como conduzindo a uma proliferação celular e sobrevivência [39], mas persistente ou sustentada ERK1 2 activação /que durar mais de 12 horas está envolvido na célula diferenciação e morte [40], [41], [42], [43]. As duas actividades de ERK1 /2 em ambas a proliferação celular e a morte celular pode ser explicada por vários estudos recentes que demonstram que a ERK fosforilada pode produzir resultados diferentes, dependendo da duração da acumulação de ERK no núcleo [44], [45]. Recentemente, foi relatado que a activação de ERK sustentada foi envolvida na apoptose induzida por cálcio de células epiteliais do cristalino [46]. Vários estudos têm mostrado que icaritin induz a activação da quinase ERK e p38 em células estaminais embrionárias e as células neuronais [8], [14]. Chen et al. relataram que icaritin induz a inibição do crescimento e apoptose de células PC-3 de cancro da próstata humano através da via de ERK1 /2 de sinalização [13]. Aqui também descobrimos que a activação induzida icaritin sustentada da ERK1 /2, mas não de JNK e p38 em células Hec1A. U0126, um inibidor específico da MEK (MAPK /ERK-quinase), bloqueou eficazmente icaritin induzida ERK1 /2 de activação e a apoptose induzida por icaritin atenuada, sugerindo que a activação sustentada do /2 via de sinalização ERK1 é um dos mecanismos.

em conclusão, constatamos que icaritin crescimento celular inibido e apoptose celular induzida em células Hec1A. Estudamos também os mecanismos subjacentes envolvidos na apoptose induzida por icaritin. Os nossos resultados indicam que a inibição do crescimento celular induzida por icaritin envolve as reduções de ciclina D1 e expressão da proteína CDK4 e induções de expressão de proteína p21 e p27. Os nossos resultados também demonstram que a apoptose induzida por icaritin envolve a activação de caspase-3 e caspase-9 e a libertação de citocromo c. Descobrimos que sustentou ERK1 /2 activação era necessária para a apoptose induzida por icaritin. Os resultados forneceram um racional que icaritin poderia ser desenvolvido como um potencial agente anticancerígeno contra o câncer endometrial humano.

Materiais e Métodos

Materiais e Reagentes

Icaritin com uma pureza de até a 99,5% era do Dr. Kun Meng (shenogen Pharma Co Pequim, China). Uma solução estoque (10 mM) foi preparada por dissolução de icaritin em DMSO (Sigma, St Louis, MO, EUA) e armazenou-se a -20 ° C. MTT, DAPI, U0126, SP600125, SB203580, e inibidor da pan-caspase (Z-VAD-FMK) foram adquiridos a partir de Calbiochem (San Diego, CA). O anticorpo para a caspase-3 clivada foi adquirido a Cell Signaling (Beverly, MA). Os anticorpos contra ERK1 /2, fosfo-ERK1 /2, p38, fosfo-p38, JNK, fosfo-JNK, p21, p27, citocromo c, Bcl-2, Bax, caspase-9, ciclina D1, CDK4, PARP e β -actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Kit FITC A anexina V Detecção de apoptose I foi comprado de Becton Dickinson (PharMingen).

Células da cultura e ensaio de proliferação celular

A linha de células de cancro do endométrio humano Hec1A foi obtido de Dr. Li-Hui Wei (Hospital Peking Pessoas University, Pequim) e cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-BRL, EUA) de meio com 10% de soro fetal de vitela (Hyclone, UT), 5 ug /ml de insulina, e mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada atmosfera de 5% de CO

2. Meios será alterado em fenol meio isento de vermelho com soro fetal de vitelo a 2,5% de carvão-descascada, durante 24 h antes de experiências necessárias.

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração final de 1 × 10

4 células /poço e incubadas em meio DMEM contendo 10% de FCS durante 24 h. Em seguida, as células foram cultivadas em DMEM fenol-vermelho livre de (Gibcol-BRL, EUA) com 2,5% de soro de vitelo fetal despojado com carvão (Biochrom AG, Alemanha), seguido por tratamento com concentrações variáveis ​​de icaritin durante 12 h, 24 h e 48 h. O meio foi removido e foi adicionado meio fresco a cada poço, juntamente com 20 jil de solução de MTT (5 mg /ml). Após 4 h de incubação, 150 uL de DMSO foram adicionados a cada poço. As placas foram lidas a comprimentos de onda de 490 nm utilizando um leitor de microplacas (TM Bioteck Powerwave

, EUA). Oito reduplicate poços foram utilizados para cada tratamento, e as experiências foram repetidas três vezes.

Análise Western Blot

Western blot foi realizada tal como descrito anteriormente [47], [48]. As células foram tratadas com a concentração indicada de icaritin durante o tempo indicado em fenol-vermelho livre de DMEM (Gibcol-BRL, EUA) com 2,5% de carvão despojado-soro de vitelo fetal (Biochrom AG, Alemanha). As células foram recolhidas em PBS arrefecido em gelo, e os extractos celulares foram preparados em tampão RIPA com o cocktail inibidor de proteinase a partir de Sigma (St. Louis, MO). As concentrações proteicas dos lisados ​​de células foram determinadas e fervido com tampão de gel de carga durante 10 min a 100 ° C. As amostras contendo 30 ug de proteína total foram sujeitas a electroforese em géis de 10% SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de PVDF (Millipore, Temecula, CA). Após transferência, a membrana foi bloqueada em TBST (TBS contendo 0,1% de Tween 20) contendo 5% de leite desnatado durante 2 horas, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários apropriados. Após lavagem três vezes em TBST, as membranas foram incubadas durante 1 h a 37 ° C com anticorpos secundários conjugados com peroxidase apropriados 1:2000 rábano. Finalmente, as membranas foram visualizadas utilizando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham, Piscataway, NJ).

Ensaio TUNEL

Potencial fragmentação do ADN foi analisado com coloração por fluorescência pelo TUNEL (transferase terminal dUTP nick Labeling End) kit de detecção de apoptose (Beyotime Biotech, China) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, células cultivadas em coverlips vidro estéreis foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min, e depois permeabilizadas com 0,4% de Triton X-100 durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram incubadas com uma mistura de reacção contendo biotina-dUTP e a desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) durante 60 min e, em seguida, com a solução de avidina-FITC durante 30 minutos no escuro. DAPI foi subsequentemente adicionado para coloração nuclear. A análise microscópica foi realizada utilizando um microscópio confocal de varredura a laser (Zeiss LSM 710 META, Alemanha).

Detecção de apoptose por Cell Death Enzyme-Linked Método imunoensaio

Para ELISA, as células semeadas em placas de 96 poços (1 × 10

4 células /cavidade) foram tratados com icaritin, em seguida, as células apoptóticas foram avaliadas usando o kit de ELISA de detecção celular Morte (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. imunoensaio enzima fotométrica foi usada para determinar quantitativamente a formação de fragmentos de ADN associado a histona citoplasmáticos sob a forma de mononucleosomes após a apoptose das células. A absorvância a 405 nm foi medida como o indicador de células apoptóticas. O comprimento de onda de referência foi de 490 nm. O factor de enriquecimento (quantidade total de apoptose) foi calculada dividindo a absorvância da amostra (A405 nm) pela absorvância dos controlos sem tratamento (A490 nm).

ensaios de Anexina V /PI para apoptose

para anexina V /PI ensaios, as células foram coradas com anexina V-FITC e PI, e avaliadas quanto a apoptose por citometria de fluxo de acordo com o protocolo do fabricante (BD PharMingen, San Diego, CA, EUA). Resumidamente, 1 x 10

6 células foram lavadas duas vezes com PBS, e coradas com 5 jil de anexina V-FITC e 10 ul de PI (5 ug /ml) em 1 ml de tampão de ligação durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células apoptóticas foram determinados utilizando um cytoflurometer Becton-Dickinson FACScan (Mansfield, MA, EUA).

Imunofluorescência coloração

imunofluorescência foi usada para analisar a distribuição subcelular de citocromo c induzida em células Hec1A por Icaritin. As células cultivadas em coverlips vidro estéreis foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min. Após permeabilizadas com 0,4% de Triton X-100 durante 10 min à temperatura ambiente, as células foram bloqueadas em PBS a 4% durante 1 h e incubou-se durante a noite a 4 ° C com anticorpo anti-citocromo c suplementado com BSA. Após lavagem três vezes em PBS, as células foram marcadas com o anticorpo secundário conjugado com TRITC-. DAPI foi subsequentemente adicionado para coloração nuclear. A análise microscópica foi realizada utilizando um microscópio laser confocal de varrimento (Zeiss LSM 710 META, Alemanha).

Medição da actividade de caspase-3

As células foram tratadas com icaritin na ausência e na presença de diferentes inibidores de cinase, e a actividade da caspase-3 nas lisados ​​límpidos foram medidos utilizando caspase-3 actividade Assay Kit (Biotech Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. A luminescência foi quantificada utilizando um leitor de ELISA. valores em branco foram subtraídos, e aumentos de caspase 3-atividades foram expressos como vezes de aumento e calculada com base em actividades medidos a partir de células não tratadas.

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